孫慶申， 王鈺涵， 韓德權(quán)， 張 炎， 韓曉云

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心， 黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 哈爾濱 150080；3.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 哈爾濱 150080)

東北酸菜是白菜經(jīng)腌制而成的傳統(tǒng)食品。酸菜腌制過程中的微生物發(fā)酵不僅賦予酸菜獨(dú)特的色、香、味，而且低pH值在一定程度上抑制了有害菌的生長[1]。但是隨著貯藏期的延長，由于雜菌大量繁殖引起的酸菜腐敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。不同的酸菜貯藏性能不同，可能與酸菜中特有微生物及其抑制腐敗菌作用有關(guān)。因此，從酸菜中分離具有防腐作用的微生物，并明確其發(fā)揮抗菌作用的成分具有重要的意義。

植物乳桿菌作為發(fā)酵蔬菜中的主要種屬，在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生不同的抗菌物質(zhì)，如有機(jī)酸、抗菌肽(包括細(xì)菌素)等[2]。細(xì)菌素是一類由核糖體合成的低分子量抗菌肽，具有一定的抑菌作用[3-4]。這一特性使它們成為發(fā)酵食品的有效防腐劑。乳酸菌作為一類革蘭氏陽性菌，常被用作食品發(fā)酵劑和益生菌制劑[5-6]。Islam 等[7]分離得到乳酸菌具有廣譜抑菌性，對(duì)食源性腐敗菌、致病菌具有較好抑菌能力。高兆建等[8]從泡菜中分離到的發(fā)酵乳桿菌具有良好的耐酸堿性，作為酸性食物防腐劑具有良好的發(fā)展前景。齊世華等[9]通過篩選高產(chǎn)苯乳酸的菌株得到植物乳桿菌Lp45，其抑制霉菌生長的能力較強(qiáng)，作為生物保鮮劑具有良好的應(yīng)用前景。

隨著人們食品安全意識(shí)的提高，挖掘具有廣譜抑菌性能的細(xì)菌素受到了越來越多的關(guān)注[10]。盡管針對(duì)植物乳桿菌細(xì)菌素分泌的研究已有很多報(bào)道，這些菌株的來源不同，同時(shí)大多數(shù)細(xì)菌素的抑菌譜較窄。本研究從市售的保藏期較長的腌菜中篩選出了一株具有高效抗菌活性的菌株，經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定該菌株為植物乳桿菌，并對(duì)其所產(chǎn)的細(xì)菌素的性質(zhì)進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)所篩選出的植物乳桿菌L3產(chǎn)細(xì)菌素L3除了具備目前研究的細(xì)菌素的特性以外，對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌，以及真菌等都具有較好的抑菌活性，這些特性對(duì)于防止食品的微生物敗壞具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 指示菌與試劑

指示菌：凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、白色念珠菌、畢赤酵母、青霉菌均來自黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶、瓊脂粉、葡萄糖、硫酸錳、吐溫8 0、硫酸鎂、磷酸鈉、氯化鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G- 50，北京博奧拓達(dá)科技有限公司。MRS肉湯培養(yǎng)基，Solarbio試劑公司。

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于真菌指示菌的培養(yǎng)(不加瓊脂的為PDA液體培養(yǎng)基)。

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉 5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 10 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于細(xì)菌指示菌的培養(yǎng)(不加瓊脂的為LB液體培養(yǎng)基)。

1.2 儀器與設(shè)備

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于酵母菌和霉菌的分離與培養(yǎng)(不加瓊脂的為YPD液體培養(yǎng)基)。

LRH- 250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；LDZM- 75型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；SW- CJ- 2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；XS- 212型生物顯微鏡，南京江南光電股份有限公司；H1650型高速離心機(jī)，長沙湘儀儀器制造公司；HZQ- C型空氣浴振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DKS- 24型水浴鍋，上海經(jīng)濟(jì)區(qū)沈蕩中新電器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1乳酸菌的分離及拮抗菌初篩

購買市售保質(zhì)期為9個(gè)月的各品牌腌制蔬菜，包括親民北大荒有機(jī)酸菜、翠花酸菜、朱老六東北酸菜、遲紅棵酸菜、秒廚酸菜絲、農(nóng)夫大田酸菜、農(nóng)夫酸菜和正宗大田酸菜產(chǎn)品，在過保質(zhì)期1個(gè)月時(shí)將每個(gè)品牌包裝袋內(nèi)的蔬菜和汁液分別取出，經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎后取1 mL樣品加到9 mL的無菌生理鹽水中，充分振蕩后進(jìn)行稀釋，取稀釋度為1×10-7和1×10-8倍的樣品200 μL，在含有CaCO3的MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，37 ℃培養(yǎng)24～48 h；選擇有溶鈣圈的白色單菌落通過三區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，再挑取單一菌落接種至MRS斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩⑻暨x出來的19個(gè)菌株在37 ℃兼性厭氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察乳酸菌生長情況。

再利用從酸菜汁中分離出的青霉菌，采用菌餅法進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，對(duì)19個(gè)菌株的抑菌活性進(jìn)行初篩[11]。將對(duì)數(shù)生長期的乳酸菌菌懸液以7 140g離心15 min，取上清液加入至PDA培養(yǎng)基，在PDA培養(yǎng)基未凝固時(shí)，接入分離出的青霉菌，將此含有青霉菌和乳酸菌上清液的PDA培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察乳酸菌上清液對(duì)青霉菌抑菌圈直徑的大小。以無菌生理鹽水制成的未加入乳酸菌上清液、僅接種青霉菌的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.2一株優(yōu)勢乳酸菌的篩選及菌種鑒定

將1.3.1節(jié)中篩選出的一株抑菌效果最好的乳酸菌命名為L3。

1.3.2.1乳酸菌L3生長及抑菌動(dòng)力學(xué)曲線

將乳酸菌L3以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。每隔2 h測定發(fā)酵液的pH值以及OD600值，以未接菌的MRS液體培養(yǎng)基做對(duì)照。通過培養(yǎng)時(shí)間(t)與培養(yǎng)液OD值繪制乳酸菌L3的生長曲線。

在乳酸菌L3培養(yǎng)24 h過程中，每隔2 h取培養(yǎng)液5 mL，經(jīng)7 140g離心15 min后，取上清液。以枯草芽孢桿菌為指示菌，采用牛津杯法測定上清液對(duì)指示菌的抑菌效果，以培養(yǎng)時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑(mm)為縱坐標(biāo)，繪制抑菌動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.2.2乳酸菌L3的菌種鑒定

1)菌體的生理生化特征。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法，采用革蘭氏染色，吲哚實(shí)驗(yàn)，過氧化氫實(shí)驗(yàn)以及碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)等對(duì)乳酸菌L3進(jìn)行菌株鑒定[12]。

2)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)所分離的乳酸菌L3進(jìn)行DNA提取，利用細(xì)菌通用引物(F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；R：GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。利用blast軟件將所得菌株L3的16S rDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行同源性分析，然后提交到NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行登記。

1.3.3細(xì)菌素L3的抗菌活性測定

1.3.3.1細(xì)菌素L3的抑菌性能干擾因素排除實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌性能干擾因素，如酸、蛋白酶等，進(jìn)行排除分析。

無細(xì)胞上清液(cell-free supernatant，CFS)的制備。將分離出的乳酸菌L3以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)18 h，7 140g離心10 min取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾得到CFS，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

指示菌的制備：將金黃色葡萄球菌和酵母菌按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量分別接種于LB和YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)過夜，1 776g離心10 min后收集菌體，稀釋至1×10-7倍，分別涂布于LB和YPD固體培養(yǎng)基，再用牛津杯打孔，備用。

1)排除酸實(shí)驗(yàn)。將CFS冷凍干燥，用1 mL無菌蒸餾水復(fù)溶，再用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.5～7.0[14]。采用瓊脂擴(kuò)散法，向含有指示菌的YPD和LB固體培養(yǎng)基牛津杯孔內(nèi)加入調(diào)節(jié)pH前后的CFS 100 μL，4 ℃靜置1 h，于37 ℃培養(yǎng)24 h比較兩者的抑菌圈大小。

2)蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)。用50 mmol/L(pH=7.0)的PBS緩沖液把適量的蛋白酶K、胰蛋白酶以及胃蛋白酶溶解，分別加入經(jīng)處理的CFS，各蛋白酶終質(zhì)量濃度均為1 mg/mL[15]，分別調(diào)整為各酶的最適pH值(蛋白酶K pH值8.0、胰蛋白酶pH值7.8～8.5、胃蛋白酶pH值1.5～2.0，37 ℃水浴2 h后調(diào)回pH值6.5～7.0。對(duì)照組為未經(jīng)各種酶處理的CFS。采用瓊脂擴(kuò)散法，37 ℃培養(yǎng)24 h測量抑菌圈直徑。

3)排除過氧化氫實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行調(diào)整后，用50 mmol/L(pH=7.0)的PBS緩沖液把H2O2酶溶解，加入CFS中，使H2O2酶終質(zhì)量濃度均為10 mg/mL，以未加H2O2的CFS作為對(duì)照組，37 ℃水浴2 h后，取100 μL處理后的CFS加入牛津杯孔中，4 ℃靜置1 h，于37 ℃培養(yǎng)24 h測量抑菌圈直徑。

1.3.3.2細(xì)菌素L3的提取及純化

參考文獻(xiàn)[16]的方法提取CFS中的細(xì)菌素，取100 mL的CFS于燒杯中，加入1.5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4 ℃靜置過夜，收集有機(jī)相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到CFS中的細(xì)菌素。對(duì)乳酸菌L3胞內(nèi)的細(xì)菌素，采取細(xì)胞破碎的方法提取，具體過程如下：采用細(xì)胞破碎儀將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的乳酸菌L3進(jìn)行超聲破碎5 min，于75 ℃水浴中加熱15 min，滅活蛋白水解酶，7 140g離心10 min，用5 mmol/L PBS緩沖液 (pH值7.1～7.4)洗細(xì)胞沉淀物，重懸于滅菌蒸餾水；再次離心后重懸于100 mmol/L NaCl 至pH=2.0，4 ℃放置2 h，不斷攪拌，使細(xì)菌素從破碎的細(xì)胞最大限度地釋放出來，懸浮液再次離心，取上清液，在上清液中加入1.5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4 ℃靜止過夜，倒出有機(jī)相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到乳酸菌胞內(nèi)細(xì)菌素粗提物，將其與發(fā)酵上清液中提取的細(xì)菌素分別用甲醇復(fù)溶，混合后備用。

采用Sephadex G- 50層析柱將提取的細(xì)菌素L3進(jìn)行過濾層析，流動(dòng)相使用100%純水，每6 mL餾分收集1管，流速為0.2 mL/min，然后再利用自動(dòng)分步收集器收集樣品。收集各洗脫峰進(jìn)行抑菌活性檢測，將有抑菌活性的收集液合并，凍干并進(jìn)一步分析。

1.3.3.3細(xì)菌素L3的抑菌譜檢測

采用瓊脂擴(kuò)散法測定細(xì)菌素L3的抑菌活性。無菌條件下將LB、PDA和YPD固體培養(yǎng)基倒入滅菌后的平皿中，待冷卻至適當(dāng)溫度，加入各指示菌(凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、白色念珠菌、畢赤酵母、青霉菌)混勻后(指示菌稀釋度為1×10-7倍)，插入牛津杯，待冷卻后取出。在孔中加入100 μL的細(xì)菌素L3水溶液，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑d。以空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，每組3個(gè)平行。

1.3.3.4細(xì)菌素L3分子量的測定

經(jīng)系列純化后的活性組分通過 Tricine-SDS- PAGE 電泳測定細(xì)菌素L3分子量。采用相同條件進(jìn)行兩次電泳，電泳結(jié)束后，一份用于染色，另一份經(jīng)充分洗滌脫去十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)后，覆蓋LB培養(yǎng)基做抑菌活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。根據(jù)抑菌條帶位置判斷細(xì)菌素L3的分子量大小。

1.3.3.5細(xì)菌素L3的穩(wěn)定性測定

本部分實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌作為指示菌，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，1 776g離心10 min后收集菌體，涂布于LB固體培養(yǎng)基平皿中，再通過瓊脂擴(kuò)散法分別測定經(jīng)過下述處理的細(xì)菌素L3的抑菌活性，以未處理的細(xì)菌素L3作為對(duì)照。

1)熱穩(wěn)定性。將細(xì)菌素L3加熱至60、80、100 ℃處理20 min或121 ℃處理15 min，測定其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑。

2)酸堿穩(wěn)定性。根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]方法略做修改，配置pH=1.5、2.5、3.5、4.5的人工模擬胃液、pH=7的人工模擬腸液以及pH>7的堿性溶液處理細(xì)菌素L3，測定細(xì)菌素L3的酸堿穩(wěn)定性。

3)蛋白酶的敏感性。根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]的方法略做修改，用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分別處理細(xì)菌素L3，將各酶(終濃度為1 mg/mL)加入細(xì)菌素L3中，37 ℃水浴2 h，測定細(xì)菌素L3對(duì)不同的蛋白酶的敏感性。

4)對(duì)其他物質(zhì)的敏感性。參考文獻(xiàn)[19-20]的方法，向細(xì)菌素L3樣品中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%吐溫- 80、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，30 ℃處理4 h，通過牛津杯法測定細(xì)菌素L3對(duì)上述物質(zhì)的敏感性。

1.3.3.6細(xì)菌素L3對(duì)金黃色葡萄球菌的生長抑制作用

將初步提純的細(xì)菌素L3與金黃色葡萄球菌以1∶1(體積比)的接種量進(jìn)行接種，觀察未接種的金黃色葡萄球菌和接入細(xì)菌素L3的金黃色葡萄球菌在600 nm下的OD值變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差值。利用Origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離及拮抗菌初篩結(jié)果

本研究采用溶鈣圈法從不同品牌的酸菜中，挑選出呈白色或者微黃色、不透明或半透明、圓潤光滑、邊沿整齊的19個(gè)桿狀或短桿狀乳酸菌菌落(見表1)。

表1 19株乳酸菌菌落形態(tài)

因?yàn)樵诠哔A藏和保鮮過程中，霉菌污染是導(dǎo)致果蔬品質(zhì)變壞甚至腐敗的最主要的有害菌，且霉菌具有傳播速度快等特點(diǎn)，所以，本實(shí)驗(yàn)以酸菜中分離出的青霉菌作為指示菌，以所得到的19株乳酸菌的抑菌活性強(qiáng)弱作為篩選條件，獲得5株對(duì)青霉菌有拮抗作用的乳酸菌，通過菌餅直徑比較發(fā)現(xiàn)編號(hào)為L3的菌株抑菌能力最強(qiáng)(見表2)，因此選擇乳酸菌L3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 19株乳酸菌對(duì)青霉菌的抑菌性能

2.2 乳酸菌L3的生理生化特性及菌種鑒定結(jié)果

2.2.1乳酸菌L3的生長動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)酸特性及抑菌曲線

本實(shí)驗(yàn)測定了培養(yǎng)液的OD600值，以此判定乳酸菌L3的生長曲線，結(jié)果見圖1，在MRS液體培養(yǎng)基中，乳酸菌L3培養(yǎng)約2 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，并于18 h之后進(jìn)入了穩(wěn)定期。該菌株的產(chǎn)酸能力強(qiáng)，在培養(yǎng)2 h時(shí)pH值下降到5.5左右，到8 h時(shí)，pH下降到4.0以下。以枯草芽孢桿菌作為指示菌進(jìn)行抑菌活性測定，從培養(yǎng)4 h開始，菌株L3的發(fā)酵液開始具有抑菌活性，在進(jìn)入生長穩(wěn)定期后抑菌活性基本穩(wěn)定，在24 h達(dá)到最高水平，所以將24 h作為產(chǎn)細(xì)菌素L3的最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖1 優(yōu)勢乳酸菌L3生長曲線及抑菌動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.2乳酸菌L3的生理生化特征

利用溶鈣圈實(shí)驗(yàn)證明了乳酸菌L3具有分解CaCO3的能力。經(jīng)過革蘭氏染色，吲哚試驗(yàn)，過氧化氫試驗(yàn)以及測試碳水化合物中經(jīng)發(fā)酵后均呈陽性，初步判定菌株L3屬于乳桿菌屬(見表3)。

表3 乳酸菌L3生理生化鑒定結(jié)果

2.2.3乳酸菌L3的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)按照細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說明提取了菌株L3的總DNA，并進(jìn)行葡聚糖凝膠電泳檢測，然后將提取的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段大小在1 500 bp左右(見圖2)。對(duì)菌株L3的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示，這株菌與植物乳桿菌同源性在99%以上，故將該菌株確定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，并命名為植物乳桿菌L3，將該序列提交NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫，獲得菌株序列號(hào)為MT781360。

泳道1為Marker；泳道2為乳酸菌L3

2.3 細(xì)菌素L3的抗菌活性分析

2.3.1細(xì)菌素L3粗提物的抑菌性能干擾因素排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

有研究表明乳酸菌的代謝產(chǎn)物中具有多種抑菌物質(zhì)，包括有機(jī)酸、過氧化氫等[21]。為了證明抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)，對(duì)1.3.3.1節(jié)中的無菌上清液進(jìn)行了蛋白水解酶處理、排酸和H2O2酶實(shí)驗(yàn)；然后以枯草芽孢桿菌為指示菌，發(fā)現(xiàn)加入了蛋白酶K和胰蛋白酶后抑菌活性明顯降低，而加入了過氧化氫酶后抑菌活性沒有明顯變化，說明除了過氧化氫酶以外，該抑菌物質(zhì)對(duì)其他酶都敏感，證明了抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)類物質(zhì)(見表4)。這一結(jié)果與Seval等[15]分離出的細(xì)菌素KT11，以及徐志嬌等[22]從植物乳桿菌L10中發(fā)現(xiàn)的代謝物抑菌活性相似，所有這些細(xì)菌素對(duì)pH值有一定的依賴性，對(duì)溫度和過氧化氫酶不敏感，經(jīng)過蛋白酶處理后其抑菌活性降低，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了其蛋白質(zhì)性質(zhì)。

表4 細(xì)菌素L3對(duì)酶的敏感性

2.3.2細(xì)菌素L3粗提物的初步純化結(jié)果

初步純化細(xì)菌素L3采用分子篩凝膠過濾層析，層析結(jié)果見圖3，洗脫2 h 34 min左右出現(xiàn)第一個(gè)峰，全程僅有一個(gè)峰，將該峰進(jìn)行收集后做抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)存在抑菌性。

A為目標(biāo)峰。

2.3.3細(xì)菌素L3的抑菌譜

采用牛津杯法測定細(xì)菌素L3對(duì)不同的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌等的抗菌活性，結(jié)果見表5，除凝結(jié)芽孢桿菌和乳酸桿菌外，細(xì)菌素L3對(duì)所有的指示菌都有抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制活力顯著高于革蘭氏陰性菌。細(xì)菌素L3對(duì)革蘭氏陽性菌中的蠟樣芽孢桿菌、單核增生李斯特菌的抑菌活性高于對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性。對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用稍弱，對(duì)于銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌的抑菌活性強(qiáng)于大腸桿菌的抑菌活性。除此之外，細(xì)菌素L3對(duì)于真菌中的白色念珠菌、畢氏酵母及青霉菌也顯示了良好的抑制生長的能力。這些結(jié)果顯示，細(xì)菌素L3具有廣譜抑菌活性。

表5 細(xì)菌素L3的抑菌譜

2.3.4細(xì)菌素L3分子質(zhì)量的大小

將細(xì)菌素L3經(jīng)過乙酸乙酯萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、Sephadex G- 50 凝膠分子篩層析及HPLC純化處理后，對(duì)收集的抑菌活性組分進(jìn)行Tricine-SDS- PAGE 檢測(見圖4)，細(xì)菌素L3泳道顯示清晰的非?？拷膬蓚€(gè)條帶，這兩個(gè)條帶均存在抑菌活性，該抑菌物質(zhì)的分子質(zhì)量大小介于4～5 kDa。研究顯示，不同來源的細(xì)菌素分子質(zhì)量范圍變化較大，如Xin等[23]從芽孢桿菌中分離出得細(xì)菌素大小為5.8 kDa，Seval等[15]分離出的細(xì)菌素KT11分子質(zhì)量大小在3.5 kDa；也有一些研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素分子質(zhì)量較小，例如韓金志等[24]分離出的細(xì)菌素FZU122的分子質(zhì)量大小為1.05 kDa，Wayah等[25]分離的細(xì)菌素SPW11為1.2 kDa。本研究通過抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，植物乳桿菌L3分泌的細(xì)菌素L3與已報(bào)道的細(xì)菌素不是同一種物質(zhì)。

泳道1為細(xì)菌素L3濃縮液；泳道2為MRS培養(yǎng)基對(duì)照；泳道3為Marker。

2.3.5細(xì)菌素L3的穩(wěn)定性結(jié)果

酸堿穩(wěn)定性結(jié)果表明，純化后得到的細(xì)菌素L3在pH值 2～10的范圍內(nèi)抑菌活性保持穩(wěn)定，且在pH=3時(shí)抑菌活性最高(見圖5)，這與Seval等[15]分離出的細(xì)菌素KT11性質(zhì)相似。將細(xì)菌素L3分別置于60、80、100 ℃水浴20 min，或120 ℃下處理15 min后，仍保持抑菌活性(表6)。

表6 溫度對(duì)細(xì)菌素L3抑菌活性的影響

圖5 pH值對(duì)細(xì)菌素L3抑菌效果的影響

季紅等[26]從乳桿菌ST- III發(fā)酵上清液分離到細(xì)菌素類物質(zhì)，但其在pH=7時(shí)幾乎喪失活性。細(xì)菌素L3相比于此抑菌素的酸堿穩(wěn)定性更好，這與Zhou[27]，Messaoudi[28]，Castro[29]等報(bào)道的細(xì)菌素性質(zhì)相似。有些細(xì)菌在低溫下是穩(wěn)定的，但在100 ℃或121 ℃下失去了大部分抑菌活性，例如腸球菌素F4- 9[30]。因此基于細(xì)菌素的蛋白質(zhì)性質(zhì)和熱穩(wěn)定性，細(xì)菌素L3可以歸類于熱穩(wěn)定細(xì)菌素，在食品工業(yè)中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.3.6細(xì)菌素L3對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用結(jié)果

金黃色葡萄球菌作為常見的食源性致病微生物，廣泛存在于環(huán)境中。因此本文研究了細(xì)菌素L3對(duì)金黃色葡萄球菌生長的抑制作用(見圖6)，金黃色葡萄球菌在未添加細(xì)菌素L3的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 h時(shí)開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，到10 h后開始緩慢增長，24 h吸光度值到達(dá)1.999。添加細(xì)菌素L3的金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)生長期明顯延遲，表現(xiàn)出生長抑制，16 h后OD值約為0.868，進(jìn)入穩(wěn)定期不再增長。說明細(xì)菌素L3能很明顯地抑制金黃色葡萄球菌生長。

圖6 細(xì)菌素L3對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

3 結(jié) 論

本研究在眾多品牌腌制蔬菜中分離出19株乳酸菌，進(jìn)行抗菌活性的研究，最終得到一株具有較好抑菌活性的乳酸菌。通過菌體形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA基因序列比對(duì)分析，確定該菌株為植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌L3。利用Sephadex G- 50柱層析從該菌株發(fā)酵上清液中分離得到抑菌物質(zhì)，其分子量大小同文獻(xiàn)報(bào)道的其他植物乳桿菌來源的細(xì)菌素不同，初步判定細(xì)菌素L3是一種新型的細(xì)菌素。抑菌實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)菌素L3對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌等多種食源性腐敗菌均具有抑菌活性。多種蛋白酶處理后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素L3活性完全消失，表明細(xì)菌素L3是蛋白類物質(zhì)。穩(wěn)定性研究表明細(xì)菌素L3在較高的溫度、酸性、中性和偏堿性環(huán)境下依舊保持較高的活性，抗逆性強(qiáng)。細(xì)菌素L3特性與大多文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)菌素存在一定差異。因此，本研究從酸菜中分離得到的植物乳桿菌L3所產(chǎn)的細(xì)菌素L3能為一種新型細(xì)菌素，在食品防腐方面具備明顯的優(yōu)勢，有潛力進(jìn)一步開發(fā)為天然食品防腐劑。但是該細(xì)菌素的產(chǎn)量還較低，下一步工作將通過優(yōu)化發(fā)酵條件以及通過群體感應(yīng)誘導(dǎo)等方法提高該細(xì)菌素的產(chǎn)量，并將進(jìn)一步應(yīng)用于發(fā)酵乳中。