李慧媛，岳婧怡，王舉濤,2*，蔡百祥*

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；3蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蕪湖 241006

內(nèi)生真菌指一類生活在健康植物組織體內(nèi)但不引起植物感染病害的微生物，其具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，與宿主植物互生互利，且產(chǎn)生多種重要的次生代謝產(chǎn)物，可用于制藥、農(nóng)業(yè)，以及具有一系列生物活性的食品工業(yè)[1-3]。

鐮刀菌屬(Fusarium)是一類廣泛分布于土壤和植物體內(nèi)的絲狀真菌，近年來，諸多學(xué)者對(duì)鐮刀菌屬真菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其不僅能產(chǎn)生伏馬毒素(fumonis)、單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)和玉米赤霉烯酮(zearalenones)三類主要真菌毒素，還能產(chǎn)生萜類、酰胺、醌類和聚酮類等具有廣泛的顯著的生物活性的次生代謝產(chǎn)物[4-9]。調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌Fusariumguttiforme次生代謝產(chǎn)物的研究較少，為進(jìn)一步豐富Fusariumguttiforme代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分，同時(shí)考慮固體發(fā)酵對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的影響，本文利用多種色譜分離方法和現(xiàn)代波譜技術(shù)，對(duì)植物內(nèi)生真菌Fusariumguttiforme大米發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究，并同時(shí)對(duì)所獲得的化合物進(jìn)行體外抗炎活性篩選，旨在發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎和活性較好的先導(dǎo)分子，以期豐富鐮刀屬內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

AV-500 MHz型核磁共振譜儀(Bruker公司，德國)；UPLC-IT-TOF 質(zhì)譜(Shimadzu Crop公司，日本)；LC-3000半制備型HPLC(北京同恒創(chuàng)新科技有限公司，中國)；Waters Xbridge C18(250 mm ×20mm,5 μmol/L)色譜柱(Waters公司，美國)；ODS C18(45～60 μmol/L)(日本京都YMC株式會(huì)社，日本)；Sephadex LH-20凝膠(GE公司，瑞士)；柱層析硅膠200～300目(青島海洋化工廠，中國)；HSGF254 薄層層析硅膠板(煙臺(tái)江有硅膠開發(fā)有限公司，中國)。

1.2 菌種來源

內(nèi)生真菌Fusariumguttiforme(GenBank accession No.KC464629.1)來源于安徽中醫(yī)藥大學(xué)天然藥化教研室，4 ℃保存。

1.3 菌種的發(fā)酵提取與分離

將保存在斜面試管中的待發(fā)酵菌株接種到滅菌后的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯浸粉3 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂14.0 g/L)上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化5～7天，用滅菌后的5 mm打孔器打孔取其菌餅，將菌餅置于滅菌后的大米固體培養(yǎng)基(100 g大米和110 mL蒸餾水置于1 L的錐形瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min)中，于28 ℃恒溫發(fā)酵25天。25天后停止發(fā)酵，在每個(gè)錐形瓶中加入500 mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，連續(xù)減壓回流3次后得到待分離浸膏。

該乙酸乙酯部位(20 g)經(jīng)硅膠柱色譜(200～300目)，依次以石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫(100∶0→0∶1，V/V)和二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)洗脫(1∶1，V/V)，共得到9個(gè)組分(A～I(xiàn))。Fr.B(0.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱(MeOH，100%)處理并通過半制備型HPLC(MeOH-H2O，50∶50 V/V)分離得到化合物7(10 mg)。Fr.D(5 g)經(jīng)MCI(MeOH-H2O，1∶1→0：1，V/V)，RP-C18柱(MeOH-H2O，30∶70→100∶00，V/V)洗脫得到S1～S3三個(gè)亞組分。S2(0.6 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱(CHCl3-MeOH，1∶1，V/V和MeOH)洗脫，并采用pre-HPLC(MeCN-H2O，60∶40 V/V)得到化合物2(5 mg)、3(8 mg)。Fr.E7(6 g)經(jīng)Sephadex LH-2柱(MeOH，100%)洗脫，并通過pre-HPLC(MeOH-H2O，60∶40 V/V)純化，得到化合物1(6 mg)和5(11 mg)。Fr.F(3g)經(jīng)ODS柱(MeOH-H2O，10∶90→100∶0，V/V)梯度洗脫，得到四個(gè)亞組分SF1～SF4。SF2(0.2 g)通過pre-HPLC(MeCN-H2O，60∶40 V/V)純化，得到化合物4(5 mg)和化合物6(4 mg)。

1.4 化合物NO抑制活性的測(cè)試

NO生成抑制率 = (OD非藥物處理組-OD樣品組)/

OD非藥物處理組× 100%

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H和13C NMR數(shù)據(jù)(500和125 MHz，CDCl3)

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-7

圖2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY (-) 和 HMBC (→) 相關(guān)性Fig.2 The key 1H-1H COSY (-) and HMBC (→) correlations of compound 1

化合物2白色粉末;分子式為C8H7NO2。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：9.26(1H，br s，1-OH)，8.05(1H，d，J= 13.5 Hz，H-7)，7.85(1H，d，J= 13.5 Hz，H-8)，7.72(2H，d，J= 8.0 Hz，H-3，5)，6.98(2H，d，J= 8.0 Hz，H-2，6)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)；δ：162.2(C-1)，117.1(C-2，C-6)，132.7(C-3，C-5)，122.7(C-4)，140.0(C-7)，135.9(C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，因此確定化合物2為(Z)-1-hydroxy-4-(2-nitroethenyl)-benzene。

化合物3無色粉末;易溶于甲醇，分子式C7H6O2為。ESI-MS：121 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.85(1H，s，CHO)，7.81(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6)，7.01(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：129.8(C-1)，132.6(C-2，6)，116.0(C-3，5)，161.7(C-4)，191.4(C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，因此確定化合物3為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物4白色針狀結(jié)晶;分子式為C29H43O。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.59(1H，d，J= 9.5 Hz，H-6)，6.02(1H，d，J= 9.5 Hz，H-7)，5.73(1H，br s，H-4)，5.25(1H，dd，J= 16.5，6.7 Hz，H-23)，5.18(1H，dd，J= 16.5，6.3 Hz，H-22)，2.54(1H，m，H-2α)，2.48(1H，m，H-2β)，2.02(1H，m，H-1α)，1.82(1H，m，H-1β)，1.05(3H，d，J= 6.0Hz，H-21)，0.96(3H，s，H-19)，0.94(3H，s，H-18)，0.92(3H，d，J= 7.0 Hz，H-27)，0.86(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.83(3H，t，J= 6.2 Hz，H-29)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：35.6(C-1)，19.0(C-2)，199.6(C-3)，123.0(C-4)，164.4(C-5)，124.4(C-6)，134.0(C-7)，124.5(C-8)，44.3(C-9)，36.8(C-10)，25.4(C-11)，34.1(C-12)，44.0(C-13)，156.1(C-14)，34.1(C-15)，27.7(C-16)，55.7(C-17)，16.6(C-18)，18.9(C-19)，39.3(C-20)，21.2(C-21)，132.5(C-22)，135.0(C-23)，42.8(C-24)，33.1(C-25)，19.6(C-26)，20.0(C-27)，29.7(C-28)，17.6(C-29)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，因此確定化合物4為stigmasta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。

化合物5無色晶體;分子式為C29H46O2。ESI-MS：427 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.17(1H，s，H-4)，2.53(1H，m，H-2α)，2.46(1H，m，H-2β)，2.14(1H，dd，J= 5.0，2.8 Hz，H-1β)，1.91(1H，dd，J= 9.9，5.7 Hz，H-1α)，1.17(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J= 6.4 Hz，H-21)，0.85(3H，t，J= 7.5 Hz，H-29)，0.84(3H，d，J= 7.1 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J= 6.8 Hz，H-27)，0.72(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.5(C-1)，33.9(C-2)，199.5(C-3)，125.4(C-4)，161.1(C-5)，202.4(C-6)，46.8(C-7)，34.2(C-8)，51.0(C-9)，39.8(C-10)，20.9(C-11)，39.1(C-12)，42.5(C-13)，55.8(C-14)，23.9(C-15)，28.0(C-16)，56.5(C-17)，11.9(C-18)，17.5(C-19)，36.0(C-20)，18.7(C-21)，33.8(C-22)，26.0(C-23)，45.8(C-24)，29.1(C-25)，19.8(C-26)，18.9(C-27)，23.0(C-28)，11.8(C-29)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，因此確定化合物5為stigmast-4-ene-3,6-dione。

化合物6無色針狀結(jié)晶;分子式為C28H43O。1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δ：5.57(1H，dd，J= 6.6，2.5 Hz，H-6)，5.38(1H，m，H-7)，5.21(1H，dd，J= 15.9，6.6 Hz，H-23)，5.18(1H，dd，J= 15.9，6.6 Hz，H-22)，1.03(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.94(3H，s，H-19)，0.91(3H，d，J= 7.2 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J= 6.4 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J= 6.4 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)，δ：38.4(C-1)，32.0(C-2)，70.5(C-3)，40.8(C-4)，139.8(C-5)，119.6(C-6)，116.3(C-7)，141.4(C-8)，46.3(C-9)，37.0(C-10)，21.1(C-11)，39.1(C-12)，42.8(C-13)，54.6(C-14)，23.0(C-15)，28.3(C-16)，55.7(C-17)，12.1(C-18)，16.3(C-19)，40.4(C-20)，21.1(C-21)，135.6(C-22)，132.0(C-23)，42.3(C-24)，33.1(C-25)，20.0(C-26)，19.7(C-27)，17.6(C-28)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，因此確定化合物6為麥角甾醇。

化合物7白色粉末;分子式為C6H6O3。1H NMR(400 MHz，CD3OD)，δ：9.43(1H，s，CHO)，7.28(1H，d，J= 3.2 Hz，H-3)，6.48(1H，d，J= 3.6 Hz，H-4)，4.51(2H，s，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)，179.5(C-1)，153.8(C-2)，124.8(C-3)，110.9(C-4)，163.2(C-5)，57.6(C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，因此確定化合物7為5-羥甲基糠醛。

2.2 生物活性

評(píng)估化合物1～7在LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中抑制NO產(chǎn)生的能力。結(jié)果(見表2)顯示化合物1和2表現(xiàn)出較弱的NO抑制活性，IC50值為48.1和46.6 μmol/L，陽性對(duì)照LNMMA(NG-單甲基-L-精氨酸鹽酸鹽)的IC50為38.2 μmol/L。

3 討論

本研究從植物內(nèi)生菌F.guttiforme大米發(fā)酵物的乙酸乙酯部位分離鑒定了7個(gè)化合物，其中化合物1為一種新型的含過氧鍵的二聚苯衍生物，化合物2～7分別為苯衍生物、酚酸類、甾體類化合物、麥角甾醇及糠醛類化合物，均首次從該真菌中分離得到，極大地豐富了鐮刀菌屬次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性。同時(shí)，二聚體或多聚體衍生物大多具有較強(qiáng)的藥理活性和穩(wěn)定性，其中對(duì)二聚體類衍生物研究偏多，Paik等[16]報(bào)道了一系列含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的二聚體衍生物，其中鄰苯二甲酸酯二聚體對(duì)人子宮頸癌具有很好的選擇性和殺傷性，對(duì)正常宮頸細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。烷基、酯基、醚鍵等連接的青蒿素二聚體往往比單核化合物具有更高體內(nèi)外抗瘧疾的活性、更低的毒副作用和穩(wěn)定的理化性質(zhì)[17,18]。此外，已有報(bào)道表明苯環(huán)衍生物、酚類和甾體類化合物等具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑菌等活性，因此本文對(duì)從F.guttiforme中分離所得到的化合物1～7抗炎活性進(jìn)行體外初步評(píng)估，結(jié)果表明化合物1和2表現(xiàn)出一定的NO生成抑制活性，IC50值為48.1和46.6 μmol/L，初步闡明了鐮刀菌F.guttiforme的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)的開展提供參考，同時(shí)亦可為鐮刀菌相關(guān)研究提供一定科學(xué)價(jià)值。

表2 化合物1～7在RAW 246.7細(xì)胞中抑制NO產(chǎn)生的IC50值