郭京京，李雅軒，樊子怡，陳炫彤，王 琪，符 群,2*

1東北林業(yè)大學林學院；2黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，哈爾濱 150040

沙棘HippophaerhamnoidesLinn.又稱酸刺、酸柳，其果實在民間有悠久的藥食兼用歷史，沙棘葉片也在近年納入新資源食品名錄。我國是世界上天然沙棘種質資源最豐富的國家，不僅野生沙棘資源豐富，也是人工種植沙棘面積最大的國家，是“三北”防護林的重要樹種之一，據(jù)統(tǒng)計，截至2022年1月，我國沙棘總種植面積約3 107萬畝，占世界沙棘種植量的90%以上。沙棘果因富含維生素[1]、黃酮、多酚、有機酸、亞油素、必需氨基酸等生物活性物質，被認為是預防和治療心血管疾病、糖尿病、炎癥性疾病、皮膚病、胃潰瘍甚至癌癥的良好植物資源[2,3]。

目前我國沙棘產(chǎn)業(yè)主要以飲料加工和提煉沙棘油為主。其中，Zeng等[4]得出微波預處理+短時加速溶劑萃取將能提高沙棘油的營養(yǎng)品質；Liu等[5]優(yōu)化了沙棘果油提取工藝；Fu等[6]以沙棘原漿為原料研制沙棘發(fā)酵飲料；Li[7]對沙棘果酒加工現(xiàn)狀進行分析，以促進沙棘果酒的發(fā)展。沙棘加工果實出渣率約20%，多數(shù)被干燥為動物飼料或被廢棄，直接導致環(huán)境污染及土地資源浪費。沙棘果渣中膳食纖維含量高達50%以上。膳食纖維被營養(yǎng)學界譽為“第七大營養(yǎng)素”，可作為重要的食品填充劑[8]；可促進有益腸道細菌的繁殖，增加人體內的吸收能力，減少血漿中的膽固醇和甘油三酯，有助于控制肥胖等健康功效。

基于此，本研究對沙棘果酒行業(yè)廢棄物沙棘果渣中的可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不可溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)進行提取工藝優(yōu)化，對比研究不同膳食纖維的應用性質，以期為沙棘產(chǎn)業(yè)中廢棄資源的充分利用，產(chǎn)出不同用途分型的高附加值膳食纖維產(chǎn)品，延長沙棘產(chǎn)業(yè)鏈奠定理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣(黑龍江省農科院園藝分院)；α-淀粉酶(CAS9001-19-8，4 000 U/g)、胰蛋白酶(CAS9002-07-7，250 U/mg)、纖維素酶(CAS9012-54-8，50 U/mg)(上海源葉生物科技有限公司)；石油醚、95%乙醇等為國產(chǎn)分析純。

儀器設備：AL-1041C分析天平(METTLER TOLEDO公司)；EPOCH12酶標分析儀(BioTek Instruments，Inc，美國)；SB25-12DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理

沙棘果渣經(jīng)50 ℃恒溫干燥，粉碎過60目篩，經(jīng)過石油醚脫脂后，脫溶干燥并冷藏保存。

1.2.2 超聲波輔助酶解法提取沙棘果渣膳食纖維的方法

準確稱取1.000 g脫脂后的沙棘果渣粉加入20 mL蒸餾水，2 mol/L NaOH調至pH為8.1后加入6%胰蛋白酶(按沙棘果渣粉的質量計，下同)37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，2 mol/L冰醋酸調至pH6.0后加入8%α-淀粉酶95 ℃水浴45 min，沸水浴10 min滅酶，冷卻；加入纖維素酶在不同超聲條件下提取，滅酶冷卻，5 500 r/min離心10 min，70 ℃蒸餾水洗滌沉淀至中性，離心干燥，得不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)；將上清液(第一次離心)與洗滌液合并，濃縮為原體積的1/3，醇沉1 h，離心，干燥，得到可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)。將提取出的IDF和SDF按2∶1的比例混合作為總膳食纖維(total dietary fiber，TDF)進行研究[9]。

1.2.3 單因素試驗

研究纖維素酶的添加量(4%、5%、6%、7%、8%)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)、超聲時間(10、20、30、40、50 min)、醇沉所用乙醇的料液比(W/V)(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)對SDF/IDF的影響。

1.2.4 響應面優(yōu)化實驗

單因素中影響顯著的因素為纖維素酶添加量、超聲時間和超聲溫度，把SDF/IDF的比值作為指標，以該三種因素為條件，進行響應面法優(yōu)化提取工藝。

1.2.5 膳食纖維應用性質研究

將提取的SDF、IDF以及TDF經(jīng)過冷凍干燥后，對不同應用性質的進行對比評價。

1.2.5.1 持水力(water holding capacity，WHC)

將沙棘果渣中的TDF和IDF粉末分別準確稱取0.300 g(m1)于離心管中，加入8.00 mL蒸餾水，充分振蕩，在室溫下放置12 h，5 000 r/min離心10 min，取沉淀，稱取底泥沉淀物的質量為m2(g)，按公式(1)計算膳食纖維的持水力。

(1)

1.2.5.2 持油力(oil holding capacity，OHC)

將沙棘果渣中的TDF、SDF和IDF粉末分別準確稱取0.300 g(m3)于離心管中，加入植物油8.00 mL，充分振蕩，在室溫下放置12 h后，5 000 r/min離心10 min，稱取底泥沉淀物的質量為m4(g)，按公式(2)計算不同膳食纖維的持油力。

(2)

1.2.5.3 溶脹度(swelling capacity，SWC)

將沙棘果渣TDF和IDF粉末分別稱取0.300 g(m5)置于10 mL的量筒中(V1，mL)，加入蒸餾水8.00 mL，充分搖勻，在室溫放置12 h后，讀出膳食纖維膨脹的體積(V2，mL)，按公式(3)計算膳食纖維的溶脹度(mL/g)。

(3)

1.2.5.4 不同膳食纖維對膽固醇吸附作用

繪制膽固醇標準曲線：取10.00 mL試管5支，分別加入膽固醇標準液(100 μg/mL)0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，混合均勻，在室溫下，靜置10 min。加入冰乙酸將溶液定容到4.0 mL，沿其管壁緩緩加入鐵礬顯色劑2.0 mL，充分搖勻，靜置15 min。在560 nm波長處進行比色。以OD值作縱坐標，膽固醇總量作橫坐標，繪制標準曲線為y=0.010 8x+0.007，相關系數(shù)R2=0.995 1。

對膽固醇吸附作用分析：取新鮮的蛋黃10.000 g，加入蒸餾水90.000 g，制成乳液。加入50.000 g乳液和2.000 g膳食纖維于200 mL廣口瓶中，混合均勻。利用鹽酸模擬胃部環(huán)境(pH=2.0)以及小腸環(huán)境(pH=7.0)，37 ℃下恒溫均勻振蕩2 h，4 000 r/min離心20 min，靜置，取上清液0.04 mL，測定其中的膽固醇含量[10]。按公式(4)計算對膽固醇的吸附量(μg/g)。

(4)

式中，M：對膽固醇的吸附量(μg/g)；M1：吸附前蛋黃液中膽固醇含量(μg)；M2：吸附后上層清液中膽固醇含量(μg)；m：所用膳食纖維的質量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組做3次平行試驗，以平均值±標準差用于結果表示。采用軟件SPSS 20.0對單因素進行Tukey顯著性檢驗，軟件Origin 2019作折線圖，軟件DesignExpert10進行響應面設計與方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1a所示，酶添加量小于5%時，隨著纖維素酶的添加量的增加，沙棘果渣中SDF/IDF比值先增后減，當纖維素酶的添加量為5%時，SDF/IDF的比值最高，為0.305。此結果與Li[9]、Wu[11]、Xu[12]等研究規(guī)律相似，說明適量纖維素酶的添加可促進沙棘果渣中纖維素糖苷鍵斷裂，形成纖維寡糖，提高SDF的含量，隨著纖維素酶用量的不斷增加，細胞壁與其的反應性能隨之增大，會使膳食纖維水解后得到的IDF得率減少，SDF得率增多[13]，使SDF/IDF比值增大；由于細胞壁數(shù)目一定，在過高的酶添加量下，部分SDF被進一步降解，SDF得率減小，因此SDF/IDF比值降低。

隨著超聲溫度從30 ℃升至50 ℃，SDF/IDF的比值不斷增大，在50 ℃時，SDF/IDF比值增至0.267，為最大值；超過50 ℃時，SDF/IDF比值不斷減小，該結果表明，在本研究中50 ℃以下溫度升高有利于沙棘果渣中膳食纖維的提取。Xu[12]從黑豆中提取SDF結果顯示隨著超聲溫度的增加，SDF提取率先增加后減少，其臨界溫度為40 ℃，本研究與其結果趨同。這可能是由于外界溫度升高，溶劑和溶質分子的運動速度不斷加快，更多的膳食纖維可以克服吉布斯自由能，分子間碰撞幾率增加，加快了酶促反應。然而溫度過高會使得纖維素酶蛋白分子的熱能增加，其間的非共價相互作用斷裂的可能性增加，抑制了酶的活性甚至使酶失活，使SDF與IDF得率均減小，而在本試驗中，SDF減少量比IDF減少量相對較多，因此SDF/IDF的值下降。

圖1 各因素對沙棘果渣膳食纖維提取影響Fig.1 Effect of various factor on extraction of dietary fiber from H.rhamnoides pomace

隨著超聲時間的延長，沙棘果渣中SDF/IDF比值逐漸增加；當時間為40 min時，SDF/IDF最大，為0.314；超過40 min，比值開始降低，這與Zhang等[14]研究結果規(guī)律相似，其膳食纖維最大得率時間為35 min?？赡苡捎陔S著時間的增加，超聲波會使纖維素酶暴露更多的活性位點，增加了酶與底物的接觸機會，同時適當?shù)某晻r間促進超聲波誘導氫鍵斷裂以及內部疏水核的分散，提高酶促反應速率，使纖維素酶充分作用，SDF不斷增加，本試驗中IDF增速低于SDF，因此SDF/IDF比值不斷增加；然而時間過長，活性中間體與蛋白質之間的骨架作用會使酶聚集，阻礙活性位點的暴露，也使蛋白質的穩(wěn)定性降低[15]，分解成小分子物質，膳食纖維因此水解，使膳食纖維產(chǎn)出減少[14]。本研究中，此時SDF得率明顯減少，而IDF含量無明顯變化，SDF/IDF比值減小。

當料液比小于1∶3時，SDF/IDF比值逐漸增大；當料液比為1∶3時，比值最大，為0.308；當料液比大于1∶3時，SDF/IDF比值先降后升，并基本保持不變。由于料液比影響因素對SDF影響不大，因此確定料液比為1∶3，以其他三種因素進行進一步分析。

2.2 響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面試驗設計結果及模型建立

選擇對膳食纖維提取結果影響顯著的三個因素，分別為纖維素酶添加量(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)，并以SDF/IDF比值為響應值，進行響應面試驗，結果如表1所示。

采用Box-Behnken中心組合試驗對可溶性膳食纖維提取進行了工藝優(yōu)化，經(jīng)回歸擬合，建立SDF/IDF比值與纖維素酶添加量、超聲時間、超聲溫度的二階多項式模型：SDF/IDF=0.22+0.006 75A-0.001 125B+0.007 625C+0.009 25AB-0.012AC+0.007BC-0.012A2-0.011B2-0.003 45C2。

表1 響應面實驗方案及結果

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

表2 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

2.2.3 響應面結果分析

用軟件Design-Expert10對響應面試驗的結果作曲面圖(見圖2)，以對各因素之間的交互作用進行進一步的研究。曲面圖可以更為直觀地反映出不同因素之間的交互作用[16]，曲面越陡，作用越顯著。以其中的一個因素作為中心水平，研究另外兩個因素的交互作用對SDF/IDF比值的影響。如圖2a～2c以及表3，可見曲面較陡，AC交互作用顯著(P<0.05)，SDF/IDF比值呈先增大后降低的趨勢，說明回歸方程存在極大值。不同條件下，SDF/IDF的比值都有一種較優(yōu)的條件。

2.2.4 最佳條件確定及回歸模型驗證試驗結果

通過響應面分析得出采用超聲輔助酶的方法提取沙棘果渣中膳食纖維的含量的最優(yōu)條件為纖維素酶添加量為4.877%，超聲時間為42.159 min，超聲溫度為60.000 ℃，此時SDF/IDF比值為0.22。為適合于實際操作，調整最佳工藝為：加入5%的纖維素酶，60 ℃下超聲42 min。在該條件下進行驗證，得出SDF/IDF比值為0.21±0.01，與預測值相差0.01，表明模型理論預測值與實際值擬合效果良好。

圖2 響應曲面圖Fig.2 Response surface diagram

2.3 沙棘果渣膳食纖維應用性質結果分析

2.3.1 不同膳食纖維的持水力、持油力、溶脹度

膳食纖維生理功能的兩個重要指標是水化性質和持油力，水化性質強，意味著當膳食纖維攝入后，排泄物的體積會變大、質地變軟、使排泄物在體內停留的時間縮短，從而排泄頻率增加，間接緩解直腸和泌尿系統(tǒng)的壓力，可避免便秘和結腸癌[17]。由表3可知，沙棘果渣膳食纖維在持油性、溶脹度及吸附膽固醇方面表現(xiàn)出良好應用性質，且呈現(xiàn)不同的效果差異性。IDF的持水力強，TDF的溶脹力較高；SDF的持油力最低，TDF的持油力則較高。持油力可以用來評估膳食纖維吸收脂肪的能力，由于膳食纖維的結構較為疏松，有比較高的比表面積，因此膳食纖維的水化能力和持油力相對較高，對消化道中的脂肪的吸收和排泄起到促進作用[18]。

表3 沙棘果渣中不同膳食纖維應用性質

2.3.2 膳食纖維對膽固醇吸附作用結果分析

當身體攝入過多的高脂食物時，血漿中的低密度脂蛋白就會和膳食中過多的膽固醇結合，進而形成低密度脂蛋白膽固醇[19]，當?shù)兔芏戎鞍缀吭龆鄷r，就會引起血栓動脈硬化的危險性上升。膳食纖維能通過吸收膽汁酸抑制小腸對膽汁酸的吸收，減少人肝中膽汁酸的含量，進而促進人體膽固醇的分解，有效降低血清和肝臟中膽固醇的含量[20]。

由表4可知，TDF在pH=2和pH=7條件下對膽固醇吸附作用極顯著(P<0.01)，分別為4.79×10-3和6.42×10-3μg/g，pH=7時對膽固醇的吸附作用更高。SDF在pH=2時對膽固醇的吸附量高于pH=7時的吸附量(P<0.01)，分別為4.87×10-3和3.97×10-3μg/g，可能由于SDF中部分側鏈基團在較高的pH下發(fā)生解離，影響SDF對膽固醇的吸附[21]。在pH=2時IDF對膽固醇的吸附作用極顯著低于pH=7時的吸附力(P<0.01)。

不同類型的膳食纖維，對胃部環(huán)境和小腸環(huán)境中的膽固醇都有不同的吸附效應。不同的膳食纖維在胃部環(huán)境中對膽固醇吸附功能并沒有明顯區(qū)別，但在小腸環(huán)境中卻表現(xiàn)出極明顯的吸收差異，總膳食纖維對膽固醇吸附能力比可溶性膳食纖維提高了1.6倍以上。

本研究中，總膳食纖維以不可溶性膳食纖維為主，可溶性膳食纖維為輔的兩類纖維素構成，在溶脹力方面體現(xiàn)出優(yōu)于不可溶性膳食纖維的能力，持油作用及對膽固醇的吸附作用也分別優(yōu)于可溶及不可溶性膳食纖維。因此，不同比例搭配的膳食纖維可能會表現(xiàn)出不同的應用性質，有待于進一步研究，利用不同膳食纖維的作用特點，可作為食品輔料、食品添加劑及功能性成分添加到不同類別需求的食品中。

表4 沙棘果渣中不同膳食纖維對膽固醇的吸附作用

3 結論

超聲波與酶具有協(xié)同作用的機理是通過超聲波可提高酶活性[22]，進一步提升膳食纖維得率。本研究中通過響應面優(yōu)化得出最佳工藝為，添加纖維素酶量5%，超聲溫度60 ℃，超聲功率120 W，超聲時間42 min，此時SDF得率為(16±1)%，IDF得率為(73±2)%，SDF/IDF比值為0.21±0.01。相同工藝條件下，單一使用超聲波時SDF得率為(12±4)%，IDF得率為(65±1)%，SDF/IDF比值為0.18±0.08；單一使用纖維素法SDF得率為(11±1)%，IDF得率為(67±1)%，SDF/IDF=0.16±0.02，可見，超聲輔助酶法制備沙棘果渣膳食纖維具有顯著的得率優(yōu)勢，且使得可溶性膳食纖維比例增加。

沙棘果渣總膳食纖維表現(xiàn)出良好應用性質，特別體現(xiàn)在溶脹力和持油力較高，分別為3.12±0.13 mL/g、(4.47±0.41)%，且對膽固醇的吸附效果良好，在pH=7時對膽固醇吸附作用高出SDF近一倍。

綜上，利用沙棘加工副產(chǎn)物果渣能夠高效制備不同類型的膳食纖維，提高資源利用率，降低產(chǎn)業(yè)成本，獲得高附加值產(chǎn)品，對于進一步促進沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定經(jīng)濟價值和社會意義。