倪恒凡，劉 玲，萬(wàn) 麗*

1四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科，成都 611137；2成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 610041

天然化合物對(duì)新藥的發(fā)現(xiàn)做出了巨大貢獻(xiàn)，黃酮類化合物是天然產(chǎn)物中的一大類[1]，因?yàn)槠渚哂辛己玫目寡?、抗腫瘤、抗菌、抗?jié)儭⒈８?、保護(hù)心血管等活性備受大家關(guān)注[2-9]，從豆科崖豆藤屬植物絨毛崖豆藤(MillettiavelutinaDunn)莖中提取分離出的抗炎活性化合物2,5-二甲氧基呋喃[4″,5″:3,4]查耳酮(2,5-dimethoxyfuran[4″,5″:3,4]chalcone，1)屬于查爾酮類化合物。Ma等[10]研究結(jié)果顯示，該化合物具有較強(qiáng)的抗炎活性，其在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中主要通過(guò)抑制IL-1β分泌和Caspase-1激活，并抑制ASC齊聚，從而表現(xiàn)出良好的抗炎活性。并在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可明顯緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性休克。在新藥開(kāi)發(fā)的早期階段，進(jìn)行藥物代謝的相關(guān)研究有助于快速識(shí)別安全、有效、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)良好的化合物，提前淘汰不合格的化合物，節(jié)約研發(fā)成本，目前尚未在國(guó)內(nèi)外期刊上發(fā)現(xiàn)對(duì)該化合物的體內(nèi)外代謝數(shù)據(jù)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)2,5-二甲氧基呋喃[4″,5″:3,4]查耳酮在大鼠、小鼠、恒河猴、Beagle犬和人5個(gè)種屬肝微粒體和大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物研究，并通過(guò)對(duì)2,5-二甲氧基呋喃[4″,5″:3,4]查耳酮及其代謝產(chǎn)物(M1)體內(nèi)外藥代動(dòng)力學(xué)研究探究該化合物的主要物質(zhì)作用基礎(chǔ)，為其進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

美國(guó)Thermo公司Q Exactive高分辨質(zhì)譜(含ESI源，軟件Xcalibur3.2、Compound Discover 2.0)；美國(guó)AB SCIEX公司QTRAP5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(軟件Analyst 1.6.2、MμLtiQuant 3.3)；日本Shimadzu公司超高速液相色譜，美國(guó)Waters公司ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱。

樣品1(自制，No：20190221，純度≥98%，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，ESI-MS:m/z309.122 1(calcd for C19H16O4，309.112 7)[M+H]+[10]。樣品M1(自制，No：20190311，純度≥98%，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，ESI-MS：m/z311.1277(alcd for C19H18O4，311.1283)[M+H]+。內(nèi)標(biāo)辛二酰苯胺異羥肟酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司，No：00502A，純度≥98%)。人種屬的肝微粒體(20 mg/mL)、大鼠種屬的肝微粒(20 mg/mL)、比格犬種屬的肝微粒體(20 mg/mL)、猴種屬的肝微粒體(20 mg/mL)、小鼠種屬的肝微粒體(20 mg/mL)，NADPH反應(yīng)啟動(dòng)液(武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，于-80 ℃冷凍保存。甲醇、乙腈(色譜純，Sigma-Aldrich公司)。甲酸(色譜純，F(xiàn)lukaAnalytical公司)。

圖1 樣品1及M1結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of sample 1 and M1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重200±10 g，SPF級(jí)C57雄性小鼠，體重22±2 g均購(gòu)買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2014-028。

1.2 溶液的配制

1.2.1 給藥溶液的配制

樣品1注射液制備方法：精密稱取樣品1適量，加入生理鹽水適量，制備成濃度1 mg/mL，于4 ℃冰箱密封保存，備用。

1.2.2 儲(chǔ)備液的配制

精密稱取樣品1及M1適量，用甲醇溶解制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱密封保存，備用。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取SAHA對(duì)照品適量，用乙腈稀釋成20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3 LC-MS/MS條件

1.3.1 液相條件

QTRAP5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為：0.1%甲酸水(A相)，乙腈(B相)梯度洗脫(0～1 min，10%→90% B，1～3 min，90% B)，流速為0.5 mL/min，柱溫35 ℃，平衡1.5 min，進(jìn)樣體積1 μL。

Q Exactive高分辨質(zhì)譜：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為：0.1%甲酸水(A相)，乙腈(B相)梯度洗脫(0～15 min，10%→90% B，15～20 min，90% B)，流速為0.5 mL/min，柱溫35 ℃，平衡1.5 min，進(jìn)樣體積2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

QTRAP5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜：采用MRM(多反應(yīng)檢測(cè)模式)檢測(cè)，質(zhì)譜條件為：ESI+(正離子模式)，樣品1監(jiān)測(cè)離子對(duì)為：m/z309.1→m/z267.1，碰撞能量為17.73 V；M1監(jiān)測(cè)離子對(duì)為：m/z311.1→m/z191.1，碰撞能量為15.27 V；內(nèi)標(biāo)SAHA監(jiān)測(cè)離子對(duì)為：m/z265.1→m/z232.1，碰撞能量為20 V；去簇電壓(DP)均為100 V；離子束聚焦電壓(EP)：10 V；碰撞池出口電壓(CXP)：10 V；駐留時(shí)間為0.10 s。

Q Exactive高分辨質(zhì)譜：質(zhì)譜條件為：ESI+(正離子模式)，噴霧電壓(IS)：4 500 V;霧化氣壓力(GS1)：50 Psi；氣簾氣壓力(CUR)：15 Psi；輔助氣壓力(GS2)：45 Psi；離子源溫度(TEMP)：550 ℃；簇裂解電壓(DP)：55 V；碰撞能量(CE)：35 V。

1.4 樣品1在各種屬代謝產(chǎn)物研究

配制孵育體系為200 μL(PBS 188 μL、NADPH 12 μL)，再加入樣品12 μL(2 mmol/L)，恒溫水浴預(yù)孵育(37 ℃、5 min)，再加入各種屬的肝微粒體5 μL(20 mg/mL)啟動(dòng)反應(yīng)。在37 ℃水浴鍋中繼續(xù)孵育60 min后加入400 μL含SAHA(20 ng/mL)的冰乙腈終止反應(yīng)。渦旋3 min，離心15 min(13 000 r/min)，取上清液進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)平行3份[11]。樣品進(jìn)UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比孵育0 min和60 min樣品離子流圖，尋找樣品1在各種屬肝微粒體中的代謝產(chǎn)物。

1.5 樣品1在C57小鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物研究

隨機(jī)取C57小鼠分為對(duì)照組、血漿組和糞尿組，每組3只。將小鼠放置在代謝籠中，給藥前12 h禁食不禁水，對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組注射樣品1(10 mg/kg)。血漿組分別于給藥后0.5、1.5 h收集血液樣品，尿液和糞便樣品于給藥后收集48 h內(nèi)的糞便和尿液(每8 h收集一次)。取出離心轉(zhuǎn)速為3 500 r/min，時(shí)間15 min，后取上清液即得血漿樣品，樣品保存于低溫冰箱-80 °C。樣品預(yù)處理如下：

血漿樣品：取0.1 mL血漿樣品加入到預(yù)先活化的SPE小柱中，用1 mL 10%甲醇洗滌3次，棄去，再加入1 mL甲醇，將洗脫液進(jìn)行氮吹，后加100 μL甲醇復(fù)溶，13 000 r/min離心15 min，取上層清液進(jìn)樣分析。

尿液樣品：取0.5 mL尿液樣品加入到預(yù)先活化的SPE小柱中，用1 mL 10%甲醇洗滌3次，棄去，再加入1 mL甲醇，將洗脫液進(jìn)行氮吹，后加100 μL甲醇復(fù)溶，13 000 r/min離心15 min，取上層清液進(jìn)樣分析。

糞便樣品：將糞便干燥后研磨粉碎，每0.1 g糞便粉末加入2 mL醇浸提12 h后再超聲15 min，再取出3 500 r/min離心15 min，取上層清液于37 ℃進(jìn)行氮吹，所得殘?jiān)尤?00 μL醇復(fù)溶，3 500 r/min離心15 min，取上層清液進(jìn)樣分析。

1.6 樣品1及M1在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

經(jīng)過(guò)“1.3”項(xiàng)研究，在5個(gè)種屬的肝微粒體的孵育結(jié)果中都找到了樣品1的代謝產(chǎn)物樣品1加氫還原物(M1)，經(jīng)過(guò)下文中的二級(jí)質(zhì)譜確證后，推斷出樣品1還原物的結(jié)構(gòu)，然后本課題組合成了該代謝產(chǎn)物，并在大鼠樣品1靜脈注射后進(jìn)行樣品1及M1的定量研究并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)。

1.6.1 大鼠頸靜脈插管手術(shù)

大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉處理，麻醉后固定于無(wú)菌操作臺(tái)中，剔除左邊頸部的毛發(fā)后，用酒精擦拭干凈皮毛，待大鼠麻醉后，用手術(shù)剪剪開(kāi)皮膚找到頸靜脈，使用1 mm外徑0.5 mm內(nèi)徑的聚乙烯管插入頸靜脈中縫合固定，后將聚乙烯管從后頸部穿出固定于耳后，縫合后將大鼠靜置24 h，禁食不禁水。

1.6.2 血漿樣品收集

將6只SD大鼠從頸靜脈注射給藥樣品1，給藥劑量為10 mg/kg，分別于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、10、24 h，從頸靜脈插管中取血0.2 mL到EP管中，3 500 r/min離心15 min，分離出上層血漿冷藏于-40 ℃待用。

1.6.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿30 μL于1.5 mL的EP管中，加入含20 ng/mL內(nèi)標(biāo)SAHA的乙腈120 μL渦旋30 s后13 000 r/min離心15 min，取上層離心液80 μL裝入進(jìn)樣瓶中進(jìn)UFLC-MS/MS分析。

1.7 方法學(xué)考察

樣品1及M1方法學(xué)驗(yàn)證按照《藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[12]，主要驗(yàn)證內(nèi)容有專屬性、線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性

按照“1.6.3”項(xiàng)下條件，取空白大鼠的血漿30 μL，分別制備空白樣品和含內(nèi)標(biāo)和樣品1標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)照品及含內(nèi)標(biāo)和M1標(biāo)準(zhǔn)液的對(duì)照品，與實(shí)驗(yàn)血漿樣品進(jìn)行UFLC-MS/MS分析，進(jìn)行樣品的專屬性考察。結(jié)果顯示：空白樣品無(wú)干擾峰，內(nèi)標(biāo)SAHA與樣品1及M1分離度好，保留時(shí)間分別為1.5、1.99及1.96 min，證明該方法專屬性良好，特異性高(見(jiàn)圖2)。

圖2 樣品1、M1分別與內(nèi)標(biāo)SAHA的色譜圖Fig.2 Chromatograms of compound 1,M1 and internal standard SAHA注：空白血漿樣品(1)；血漿中分別加入樣品1對(duì)照品或M1對(duì)照品和SAHA(2)；給藥后血漿樣品(3)。a：M1；b：樣品1；c：SAHA內(nèi)標(biāo)。Note:Blank plasma sample (1);Sample 1 or M1 and SAHA were added to the plasma (2);Plasma sample after administration (3).a:M1;b:Sample 1;c:SAHA internal standard.

2.1.2 線性與范圍

于空白的大鼠血漿中分別加入系列濃度的樣品1、M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，終濃度配制成分別為3、10、30、100、300、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行UFLC-MS/MS分析，將藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值與藥物終濃度作線性回歸，以加權(quán)最小二乘法(權(quán)重系數(shù)為1/C2)，分別考察三條標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品1的結(jié)果分別為：y=0.012 04x-0.001 04(R=0.997 01)，y=0.0127x+ 0.002 40(R=0.991 30)，y=0.012 55x-0.009 86(R=0.994 63)，表明樣品1質(zhì)量濃度在3～1 000 ng/mL范圍內(nèi)成線性相關(guān)，根據(jù)信噪比S/N≥10得到最低定量限為3 ng/mL。M1考察三條標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分別為：y=0.012 36x-0.006 06(R=0.997 77)，y=0.012 21x+0.002 29(R=0.993 60)，y=0.011 63x-0.000 04(R=0.996 08)，根據(jù)信噪比S/N≥10得到最低定量限為3 ng/mL。

2.1.3 精密度與準(zhǔn)確度

按照“1.6.3”項(xiàng)下方法，分別配制樣品1及M1質(zhì)量濃度為9、100、800 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品平行6份，進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品1及M1的濃度，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣3天，考察日間精密度；同法制備該質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，進(jìn)樣分析，計(jì)算各質(zhì)控樣品測(cè)得濃度與理論濃度的回收率，評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度；由表1可知，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD均小于10%，樣品1的回收率在100.96%～103.21%，M1的回收率在99.20%～105.83%，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[13]。表明該方法精密度、準(zhǔn)確度良好，測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確可信。

表1 樣品1及M1的精密度、準(zhǔn)確度和基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定(n=6)

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)

按照“1.6.3”項(xiàng)下方法，用大鼠空白血漿配制質(zhì)量濃度分別為9、300、800 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，同時(shí)用流動(dòng)相分別配制相同質(zhì)量濃度的樣品1對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，分別得峰面積A和B。每組平行5份?；|(zhì)效應(yīng)=A/B×100%。由表1結(jié)果顯示，樣品1基質(zhì)效應(yīng)在98.37%～100.70%，M1基質(zhì)效應(yīng)在93.14%～96.02%，偏差小于15%，表明此提取方法無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

2.1.5 穩(wěn)定性

按照“1.6.3”項(xiàng)下方法，配制質(zhì)量濃度分別為9、300、800 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，進(jìn)樣分析。每組平行5份，考察各質(zhì)控樣品于自動(dòng)進(jìn)樣室內(nèi)放置24 h的穩(wěn)定性，-80 ℃放置15天的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，以及凍融5次后的凍融穩(wěn)定性。表2結(jié)果顯示在上述各條件下，樣品1及M1樣品穩(wěn)定性良好。

表2 樣品1及M1的穩(wěn)定性測(cè)定(n=5)

2.2 樣品1在不同種屬肝微粒體中的代謝產(chǎn)物

采用一級(jí)全掃描正離子方式檢測(cè)(MS scan)，比較0、60 min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的色譜圖差異，初步判斷樣品1的體外代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示5個(gè)種屬均有2個(gè)體外代謝產(chǎn)物：M1(8.36 min)，m/z311.127 7([M+H]+)；M2(4.06 min)，m/z299.128 3([M+H]+)(見(jiàn)圖3)。由于體外代謝產(chǎn)物M1、M2與下文體內(nèi)代謝產(chǎn)物一致，故在下文體內(nèi)代謝產(chǎn)物中進(jìn)行詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析。

2.3 樣品1在小鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

將處理后的小鼠的血漿、尿液、糞便樣本進(jìn)UPLC-QE-Orbitrap-MS進(jìn)行分析，通過(guò)比較給藥前后的質(zhì)譜圖譜，結(jié)合各組分的保留時(shí)間、精確的一級(jí)母離子分子質(zhì)量、碎片的分子質(zhì)量等信息，推斷出各個(gè)代謝產(chǎn)物的可能結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)代謝途徑，在血漿樣本中鑒定出原型藥樣品1及代謝產(chǎn)物M1、M2、M5共4個(gè)，在糞便樣本中鑒定出原型藥及代謝產(chǎn)物M1、M2、M3、M4、M5共6個(gè)，尿液樣本中鑒定出原型藥及代謝產(chǎn)物M1、M3、M4共4個(gè)，各個(gè)代謝產(chǎn)物保留時(shí)間詳見(jiàn)下圖4中糞便樣本的總離子流圖，各個(gè)代謝產(chǎn)物及原藥結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5，各個(gè)代謝產(chǎn)物的二級(jí)碎片信息見(jiàn)表3。

圖3 以人肝微粒體為代表的體外代謝產(chǎn)物總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of in vitro metabolites represented by human liver microsomes

圖4 以糞便為代表的體內(nèi)代謝產(chǎn)物總離子流圖Fig.4 Total ion current diagram of metabolites in the body represented by feces

圖5 樣品1及代謝產(chǎn)物產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of compound 1 and metabolite products

表3 樣品1代謝產(chǎn)物表征

如圖4所示，樣品1(C19H16O4)洗脫時(shí)間為8.48 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z309.112 7(見(jiàn)圖6a)，其二級(jí)質(zhì)譜主要的特征碎片離子有m/z267.101 6 [M-C2HO]+、179.074 0 [M+H-C9H6O]+、131.049 1 [M-C10H9O3]+、105.115 5 [M-C12H11O3]+(見(jiàn)圖7a)；可能的裂解途徑見(jiàn)圖8。利用代謝產(chǎn)物與原型藥具有相似的斷裂途徑，m/z131.049 1、178.063 0、105.115 5可作為快速鑒別樣品1體內(nèi)代謝產(chǎn)物的特征性離子。

M1的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z311.1277(圖6b)，推測(cè)其分子式為C19H18O4，比化合物1分子質(zhì)量多2 Da，推斷為化合物1加上兩個(gè)H而成。其二級(jí)質(zhì)譜主要的特征碎片離子(見(jiàn)圖9)有m/z269.107 6、191.070 3、105.033 5。其中m/z269.107 6為M1去掉左側(cè)呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)，比化合物1的原藥碎片m/z267.1016多2 Da，其中m/z191.070 3為M1左側(cè)的苯環(huán)和呋喃環(huán)的結(jié)構(gòu)，m/z105.033 5為M1右側(cè)的苯環(huán)外連接一個(gè)羰基的結(jié)構(gòu)，從兩個(gè)碎片上看還原所加的兩個(gè)H原子未加到兩側(cè)的苯環(huán)、呋喃環(huán)及羰基上，由上推測(cè)M1可能為化合物1的中間雙鍵加氫還原代謝產(chǎn)物，后經(jīng)合成M1后確證。

M2的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z299.127 3(見(jiàn)圖6c)，推測(cè)其分子式為C18H18O4，比化合物1分子質(zhì)量少了10 Da，推斷為化合物1結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)打開(kāi)后掉甲基而形成。其二級(jí)質(zhì)譜主要的特征碎片離子(見(jiàn)圖10)有m/z267.101 6、105.033 5。其中m/z267.101 6為M2去掉左側(cè)的呋喃環(huán)的結(jié)構(gòu)，m/z105.033 5為M2右側(cè)的苯環(huán)外連接一個(gè)羰基的結(jié)構(gòu)，掉的甲基確認(rèn)在呋喃環(huán)上，由上推測(cè)M2可能為化合物1的呋喃環(huán)打開(kāi)掉甲基形成。

M3的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z279.101 1(見(jiàn)圖6d)，推測(cè)其分子式為C18H14O3，比化合物1分子質(zhì)量少了30 Da，推斷為化合物1結(jié)構(gòu)中去掉甲氧基而形成。其二級(jí)質(zhì)譜主要的特征碎片離子(見(jiàn)圖11)有m/z251.106 7、201.055 1、105.034 0。其中m/z251.106 7碎片可能為M3去掉左側(cè)的呋喃環(huán)打開(kāi)后去掉甲基及O原子的結(jié)構(gòu)，m/z201.055 1碎片可能為M3去掉右側(cè)苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，m/z105.033 5為M3右側(cè)的苯環(huán)外連接一個(gè)羰基的結(jié)構(gòu)，由上推測(cè)M3可能為化合物1去甲氧基形成。

M4的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z327.122 2(見(jiàn)圖6e)，推測(cè)其分子式為C19H18O5，比化合物1分子質(zhì)量多了18 Da，推斷為化合物1結(jié)構(gòu)中加O及2個(gè)H原子而形成。其二級(jí)質(zhì)譜主要的特征碎片離子(見(jiàn)圖12)有m/z309.112 2、267.101 3、131.049 4、105.034 0。其中m/z309.112 2碎片可能為M4去掉左側(cè)的呋喃環(huán)打開(kāi)后去掉O原子形成，m/z267.101 3碎片可能為M4去掉左側(cè)苯環(huán)的結(jié)構(gòu)醛基，m/z105.033 5為M4右側(cè)的苯環(huán)外連接一個(gè)羰基的結(jié)構(gòu)，由上推測(cè)M4可能為化合物1呋喃環(huán)開(kāi)環(huán)形成。

圖6 化合物1及代謝產(chǎn)物的一級(jí)色譜圖Fig.6 The MS spectra of 1 and metabolites

圖7 化合物1及代謝產(chǎn)物的二級(jí)色譜圖Fig.7 The MS/MS spectra of 1 and metabolites

圖8 樣品1可能的裂解機(jī)制Fig.8 Possible fragmentation pathways of compound 1

M5的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z343.118 1(圖6f)，推測(cè)其分子式為C19H18O6，比化合物1分子質(zhì)量多了34 Da，推斷為M1結(jié)構(gòu)中加2個(gè)羥基而形成。其二級(jí)質(zhì)譜主要的特征碎片離子(見(jiàn)圖13)有m/z207.066 2、167.070 3、105.034 0。其中m/z309.112 2碎片可能為M5中間鏈接羥基的碳鏈斷裂形成，m/z167.070 3碎片可能為M5左側(cè)苯環(huán)上的呋喃環(huán)打開(kāi)形成，m/z105.033 5為M5右側(cè)的苯環(huán)外連接一個(gè)羰基的結(jié)構(gòu)，由上推測(cè)M5為M1加兩個(gè)羥基形成。

2.4 藥代動(dòng)力學(xué)

按照經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的UFLC-MS/MS方法測(cè)定大鼠尾靜脈樣品1給藥后(10 mg/kg)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，采用DAS 2.0進(jìn)行計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并采用非房室模型對(duì)藥物在大鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行擬合，尾靜脈注射樣品1后，測(cè)定大鼠血漿中的樣品1及M1的濃度，藥時(shí)曲線見(jiàn)圖14。樣品1的最大血藥濃度Cmax=405.962 μg/L，達(dá)峰時(shí)間Tmax=0.083 h，半衰期T1/2=3.738 h，藥時(shí)曲線下面積AUC0-t=190.635 g/(L·h)，清除率Cl=65.578 kg·h/L，表觀分布容積為Vd=299.378 L/kg，M1的最大血藥濃度Cmax=281.291 g/L，達(dá)峰時(shí)間為T(mén)max=0.083 h，半衰期T1/2=3.011 h，藥時(shí)曲線下面積AUC0-t=561.302 g/(L·h)，清除率為Cl=19.179 kg·h/L，表觀分布容積為Vd=79.032 L/kg，結(jié)果表明M1在5 min時(shí)就達(dá)到了最大濃度，樣品1在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成了代謝產(chǎn)物M1，而后M1濃度一直隨樣品1的減少而減少。

圖9 M1可能的裂解機(jī)制Fig.9 Possible fragmentation pathways of M1

圖10 M2可能的裂解機(jī)制Fig.10 Possible fragmentation pathways of M2

圖11 M3可能的裂解機(jī)制Fig.11 Possible fragmentation pathways of M3

圖12 M4可能的裂解機(jī)制Fig.12 Possible fragmentation pathways of M4

圖13 M5可能的裂解機(jī)制Fig.13 Possible fragmentation pathways of M5

圖14 樣品1及M1在大鼠體內(nèi)的藥時(shí)曲線圖(n=6)Fig.14 Concentration-time profiles of compound 1 and M1 in rats(n=6)

3 討論與結(jié)論

絨毛崖豆藤是一味具有良好抗炎療效的中藥之一，樣品1作為其主要的抗炎成分，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究較少，尚未見(jiàn)其體內(nèi)外代謝研究相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用UPLC-QE-Orbitrap-MS方法具有較高的靈敏度及專屬性，對(duì)于代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)及鑒定具有顯著的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)鑒定出了樣品1在小鼠、大鼠、猴、犬和人5個(gè)種屬肝微粒體中的代謝產(chǎn)物為M1、M2，在體內(nèi)有代謝產(chǎn)物M1、M2、M3、M4、M5，后根據(jù)質(zhì)譜碎片推斷出每個(gè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并采用合成的方法制得M1，證明推斷的化合物結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確可靠。采用UFLC-MS/MS法對(duì)體內(nèi)樣本進(jìn)行定量分析，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法穩(wěn)定可靠，可以快速定量檢查出樣本中的微量目標(biāo)化合物，相對(duì)于液相色譜法及紫外分析方法具有靈敏度更高等優(yōu)勢(shì)。

化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)是評(píng)價(jià)化合物的一個(gè)重要指標(biāo)。通過(guò)體內(nèi)外研究其主要代謝產(chǎn)物為M1，后在大鼠體內(nèi)研究樣品1及M1的代謝速率，并計(jì)算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)樣品1在體內(nèi)轉(zhuǎn)換為M1后再進(jìn)行進(jìn)一步代謝為M5。本研究對(duì)樣品1進(jìn)行了體內(nèi)外代謝產(chǎn)物研究，推斷出了5種代謝產(chǎn)物，并在大鼠體內(nèi)測(cè)定了樣品1及主要代謝產(chǎn)物M1的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，探究了樣品1及M1在大鼠體內(nèi)血漿中的變化趨勢(shì)，結(jié)果表明化合物1在體內(nèi)不穩(wěn)定，快速代謝為M1，表明起抗炎作用的是其代謝產(chǎn)物而非自身，本研究為其闡明體內(nèi)抗炎作用物質(zhì)機(jī)制提供理論依據(jù)。