武艷霜，王巖金，楊馥吉，嚴(yán)永敏,2

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬鎮(zhèn)江三院肝病科, 江蘇 鎮(zhèn)江 212005)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver diseases，NAFLD)是一類(lèi)影響全球約1/4成年人口的慢性肝病，造成了嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)[1]。肝細(xì)胞的脂肪變性是NAFLD的重要組織學(xué)特征[2-3]。外泌體是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，其中包含各種生物分子，如核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。外泌體可以將這些生物分子傳遞到細(xì)胞中，參與分化發(fā)育、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)等各種生物學(xué)過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體參與NAFLD的發(fā)展[4-7]。如Cheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR-627-5p 通過(guò)抑制脂肪質(zhì)量與肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity-associated gene，F(xiàn)TO)表達(dá)改善NAFLD。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體對(duì)miR-96-5p 的上調(diào)可以緩解NAFLD[9]。但是肝細(xì)胞來(lái)源的外泌體(exosomes derived from hepatocytes，LO2-Ex)在NAFLD中的作用尚不清楚。本研究旨在探討LO2-Ex對(duì)高脂肪飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的抑制效果。從動(dòng)物水平考察LO2-Ex對(duì)脂質(zhì)的抑制作用，為NAFLD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高脂飼料(常州鼠一鼠二生物科技有限公司)，人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)，RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(澳大利亞Bovogen公司)，青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)Invitrogen公司)，超濾離心管、HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，BCA 蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，兔抗人β-肌動(dòng)蛋白一抗、兔抗人CD9一抗、兔抗人Calnexin一抗、兔抗人TSG101一抗(英國(guó)Abcam公司)，羊抗兔二抗(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(日本Cytiva公司)，Nanosight 納米顆粒跟蹤分析儀(英國(guó)Malvern公司)，F(xiàn)EI Tecnai 12透射電子顯微鏡(荷蘭 Philips公司)，油紅O染色液(美國(guó)Sigma公司)，天狼星紅染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，普通光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，數(shù)字切片掃描儀(匈牙利 Dhistech公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，4～6周，體質(zhì)量(19±1)g，購(gòu)買(mǎi)于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào): SYXK(蘇)2017-0044。小鼠5只/籠，于23 ℃±2 ℃、相對(duì)濕度55%±5%、IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)。

1.3 人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞培養(yǎng)及LO2-Ex的分離

LO2細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含10%的胎牛血清和100 U青霉素/鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)，改用相應(yīng)含10%無(wú)外泌體胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。立即收集上清液采用超速離心法提取外泌體。首先將上清液置于4 ℃，10 000 ×g離心30 min以去除大細(xì)胞碎片。然后，將去除了大細(xì)胞碎片的上清液分裝到100 kDa的超濾管內(nèi)，以1 500×g，4 ℃離心30 min，重復(fù)此步驟，直至上清液變濃稠。接著，將濃縮液轉(zhuǎn)移到超離管內(nèi)，以100 000×g，4 ℃離心3 h收集外泌體(重復(fù)2次)，棄去多余PBS，將外泌體溶解于無(wú)菌PBS。分裝后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Nanosight納米顆粒分析系統(tǒng)和透射電鏡檢測(cè)LO2-Ex粒徑與形態(tài)

用PBS將1 μL外泌體原液稀釋至2 000倍，無(wú)菌濾器過(guò)濾后用Nanosight 納米顆粒分析系統(tǒng)分析外泌體粒徑和濃度。準(zhǔn)備500 μL外泌體原液，輕輕混勻后取適量滴加在銅網(wǎng)上，室溫靜置5 min，棄去多余液體后倒扣在磷鎢酸液滴上，負(fù)染5 min，烘干后在透射電鏡下觀察拍照。

1.5 LO2-Ex蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)外泌體標(biāo)志物

將外泌體溶解液和細(xì)胞裂解液1 ∶1充分混勻。用渦漩振蕩器將混合液振蕩裂解3 min，冰上靜置3 min，重復(fù)5次。用BCA法測(cè)定外泌體蛋白濃度。充分變性蛋白質(zhì)，-20 ℃保存?zhèn)溆?。配?0% SDS-PAGE凝膠分離外泌體中等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF上。膜在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜，回收一抗。膜在1×TBST中洗3次，每次5 min。然后在室溫下與二抗孵育1 h，膜在1×TBST中洗3次，每次5 min。將蛋白質(zhì)水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動(dòng)蛋白水平，主要抗體為CD9(1 ∶500)、Calnexin(1 ∶2 000)、TSG101(1 ∶500)，二抗為HRP結(jié)合的羊抗兔(1 ∶2 000)。新鮮配制曝光液后進(jìn)行曝光分析。

1.6 小鼠NAFLD模型建立及LO2-Ex注射

使用雄性C57BL/6小鼠，體重(19±1) g，建立NAFLD模型，HE染色觀察肝組織空泡變性用于判斷造模是否成功。所有動(dòng)物在(23±2) ℃和55%±5%的相對(duì)環(huán)境濕度下持續(xù)12 h /12 h的光/暗循環(huán)。適應(yīng)1周后，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組：正常雜糧(10% kcal)喂養(yǎng)的小鼠為正常對(duì)照組、高脂肪飲食(45% kcal)喂養(yǎng)的小鼠為NAFLD模型組、肝細(xì)胞外泌體1 mg(高脂肪飲食+LO2-Ex-1 mg)組和肝細(xì)胞外泌體2 mg(高脂肪飲食+LO2-Ex-2 mg)組，喂養(yǎng)10周。從第11周開(kāi)始，將LO2-Ex溶解在PBS中，外泌體組分別尾靜脈注射LO2-Ex 250、500 μg/只/周，連續(xù)注射4周。對(duì)照組和模型組分別注射等量的PBS。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周測(cè)量一次體重。10周后各組小鼠隨機(jī)抽取1只，HE染色觀察小鼠NAFLD的造模情況，造模成功后，其余小鼠繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)。末次注射后空腹12 h，肝門(mén)靜脈沖血后獲取小鼠新鮮肝臟，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/凈體重)。肝組織做冰凍切片和石蠟切片用于油紅O染色和天狼星紅染色。

1.7 HE染色觀察肝組織空泡變性

肝組織石蠟切片于65 ℃烘箱中烘烤6～8 h，常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3次，每次5 min。蘇木素染色3～8 min，流水稍沖洗，1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片加入伊紅染液染色1～3 min。再以70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡鏡檢，數(shù)字切片掃描儀掃描分析。

1.8 油紅O染色檢測(cè)肝組織脂肪滴沉積

肝組織冰凍切片恢復(fù)至室溫，雙蒸水充分浸潤(rùn)組織切片以除去包埋劑。后用60%異丙醇浸洗切片2 min，加入油紅O工作液避光孵育15 min；蘇木素染色30 s，流水沖洗返藍(lán)，甘油明膠封片，使用普通光學(xué)顯微鏡觀察油滴圖像。

1.9 天狼星紅染色檢測(cè)肝組織膠原沉積

肝組織石蠟切片于65 ℃烘箱中烘烤6～8 h，常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3次，每次5 min。滴加天狼星紅染液室溫孵育1 h，流水沖洗，蘇木素染色30 s，流水沖洗10 min。再以70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，封片，晾干，用數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行掃描分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LO2-Ex的鑒定

用Nanosight納米顆粒分析系統(tǒng)觀察到LO2-Ex的粒徑約為120 nm(圖1A)。透射電子顯微鏡分析證實(shí)LO2-Ex具有特征性的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)(圖1B)，蛋白質(zhì)印跡證實(shí)LO2-Ex外泌體標(biāo)志物CD9和TSG101表達(dá)，而未檢測(cè)到Calnexin表達(dá)(圖1C)。

A：Nanosight納米顆粒分析觀察LO2-Ex粒徑分布；B：透射電鏡觀察LO2-Ex形態(tài)(×25 000)；C：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)LO2-Ex表面標(biāo)志物

2.2 LO2-Ex改善NAFLD小鼠肝組織結(jié)構(gòu)和提高小鼠肝臟指數(shù)

NAFLD的重要組織學(xué)特征是發(fā)生脂肪變性[2-3]。HE染色觀察到，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肝組織空泡變性顯著，空泡遍布整個(gè)視野，而正常對(duì)照組小鼠肝組織未發(fā)生空泡變性。與模型組相比，LO2-Ex治療后的小鼠肝組織空泡變性顯著減少，而且隨著外泌體濃度增加，抑制NAFLD小鼠肝組織空泡變性的效果越顯著(圖2A)。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟蒼白、粗糙且暗沉。而LO2-Ex治療后的小鼠肝臟比模型組紅潤(rùn)、細(xì)膩、有光澤，并且隨著外泌體濃度增加，這種改善作用越明顯(圖2B)。同時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的體重明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，LO2-Ex-1 mg組的小鼠體重顯著減輕(P<0.05)，見(jiàn)圖2C。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，LO2-Ex-2 mg組治療后NAFLD小鼠肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖2D。以上結(jié)果均表明，NAFLD小鼠造模成功，LO2-Ex改善NAFLD小鼠肝組織結(jié)構(gòu)和提高小鼠肝臟指數(shù)。

A：HE染色檢測(cè)小鼠肝組織空泡變性(×400)；B：肝臟大體觀；C：小鼠體重變化；D：小鼠肝臟指數(shù)；a：P<0.05，與正常對(duì)照組相比；b：P<0.05，與模型組相比

2.3 LO2-Ex抑制NAFLD小鼠脂質(zhì)和膠原沉積

脂滴是復(fù)雜且具有代謝活性的細(xì)胞器，由單層磷脂和蛋白質(zhì)包圍的中性脂質(zhì)核心組成，脂滴積累是NAFLD的特征[10]。通過(guò)油紅O染色觀察到，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肝組織有大量脂肪滴沉積，脂肪滴粗大、深染、遍布整個(gè)視野。與模型組相比，LO2-Ex減輕了NAFLD小鼠肝組織的脂滴沉積，隨著LO2-Ex濃度增加，肝組織的脂滴減少，且變得細(xì)小、散在分布在組織切片中(圖3A)。NAFLD常伴隨著膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)肝纖維化和肝硬化[11]。天狼星紅染色觀察到，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠在肝組織脈管區(qū)附近發(fā)生了大量的膠原沉積，膠原呈現(xiàn)深染。而LO2-Ex治療組與模型組相比， NAFLD小鼠肝組織的膠原沉積減輕，脈管區(qū)附近膠原散在且染色變淺(圖3B)。

3 討論

NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等慢性肝病的病理基礎(chǔ)[12-13]，目前尚缺乏用于診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)NAFLD進(jìn)展的生物標(biāo)志物和FDA批準(zhǔn)的NAFLD治療藥物[14]。

外泌體攜載來(lái)自組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸等[15]，通過(guò)旁分泌或自分泌的方式完成細(xì)胞間通訊。由于其生物相容性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，外泌體可以成為輸送藥物、微小核糖核酸、蛋白質(zhì)和其他分子的理想載體[6,16]。一項(xiàng)研究表明，肝細(xì)胞分泌的外泌體介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的激活，從而加劇肝纖維化[17]。另外有研究人員證實(shí)，LO2-Ex能夠調(diào)節(jié)和治療糖尿病[18]。上海交通大學(xué)的一項(xiàng)研究表明，脂毒性LO2-Ex能夠激活巨噬細(xì)胞引起NAFLD[19]。但是，肝細(xì)胞分泌的外泌體在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少。因此猜想，肝細(xì)胞作為肝臟組織唯一的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其外泌體是否會(huì)對(duì)NAFLD有一定的作用。

A：油紅O染色檢測(cè)小鼠肝組織脂滴沉積(×400)；B：天狼星紅染色檢測(cè)小鼠肝組織膠原沉積(×400)

本課題組在先前的研究中建立了外泌體提取方法，并對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在急性肝損傷中的作用進(jìn)行了研究[20]。肝細(xì)胞外泌體介導(dǎo)的治療有望成為創(chuàng)新、無(wú)細(xì)胞、非侵入性、低免疫原性和無(wú)毒的肝臟治療替代策略，并提供有關(guān)肝細(xì)胞修復(fù)功能的重要機(jī)制信息[21]。本研究通過(guò)Nanosight納米顆粒分析系統(tǒng)、透射電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡多個(gè)方面對(duì)提取的外泌體進(jìn)行了驗(yàn)證，證明了LO2-Ex直徑約為120 nm、有特征性的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)、表達(dá)外泌體標(biāo)志物CD9和TSG101，不表達(dá)Calnexin。這與先前的研究結(jié)果基本一致[22]。

Cheng等[8]研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體miR-627-5p通過(guò)抑制FTO表達(dá)改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝并減輕肝損傷，從而改善NAFLD。另外一項(xiàng)研究表明藍(lán)莓衍生的外泌體樣納米顆粒通過(guò)抑制脂肪酸合酶和乙酰輔酶A羧化酶1的表達(dá)來(lái)減弱脂滴的積累從而改善NAFLD[23]。本研究設(shè)置了兩個(gè)濃度的肝細(xì)胞外泌體治療組，以期找到最佳的治療濃度。其中尾靜脈注射肝細(xì)胞外泌體2 mg后能夠提高小鼠肝臟指數(shù)。此外，肝細(xì)胞外泌體治療結(jié)束后達(dá)到了減輕NAFLD小鼠體重、抑制肝組織脂質(zhì)和膠原沉積進(jìn)而達(dá)到緩解NAFLD的目的。NAFLD與許多細(xì)胞因子尤其是IL-6升高有關(guān)，高脂肪飲食喂養(yǎng)的小鼠IL-6水平也升高[24]。那么，LO2-Ex是否攜帶了某些因子能夠抑制NAFLD小鼠IL-6水平進(jìn)而緩解NAFLD，有待進(jìn)一步研究。來(lái)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院石春薇課題組的研究人員發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1介導(dǎo)的活性肝星狀細(xì)胞分泌外泌體，傳遞糖酵解相關(guān)蛋白GLUT1和PKM2，影響肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的活性和代謝狀態(tài)[17]。那么，肝細(xì)胞外泌體是否能夠傳遞脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白進(jìn)而促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝目前還不清楚。

本研究結(jié)果表明LO2-Ex抑制NAFLD小鼠脂質(zhì)沉積，然而外泌體中發(fā)揮作用的活性分子及其作用機(jī)制尚不清楚。后續(xù)研究將從體內(nèi)和體外兩方面進(jìn)一步探討LO2-Ex抑制NAFLD的作用和機(jī)制，為臨床治療NAFLD提供新的治療策略。