林錦賢， 王攀， 吳欣謀， 林育純

(廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102)

銅是人體的必需微量元素之一，是生物體中許多必需酶的輔助因子，具有較強(qiáng)的氧化還原活性和蛋白結(jié)合能力，經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的維持和調(diào)控，參與細(xì)胞生理功能調(diào)節(jié)。環(huán)境外源因素暴露可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銅代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)，介導(dǎo)細(xì)胞毒性和機(jī)體損傷效應(yīng)[1]。已知調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(regulated cell death，RCD)的調(diào)控是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵[2]；過(guò)量銅暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及細(xì)胞死亡的機(jī)制尚未完全闡明。新近，Tsvetkov等[3]在Science的研究論文中證實(shí)，人類細(xì)胞中存在一種銅依賴的、受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡，是依賴于線粒體呼吸但不同于已知細(xì)胞死亡(如細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡等)機(jī)制的新型RCD方式；并將這種新的銅依賴性細(xì)胞死亡方式命名為“銅死亡(cuprotosis)”。盡管銅死亡目前還沒(méi)有在“細(xì)胞死亡命名”中得到確認(rèn)[2,4]，但已有證據(jù)表明，銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制不僅涉及細(xì)胞內(nèi)銅的積累，也具有不同形式RCD的共性標(biāo)志和特征，如誘導(dǎo)活性氧生成、抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)等[1,5-6]。結(jié)合近年來(lái)本課題組開(kāi)展有關(guān)外源物誘導(dǎo)不同形式RCD介導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷及其相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的研究[7-8]，本文綜述銅代謝參與介導(dǎo)外源物暴露誘導(dǎo)RCD及其調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展，提出銅依賴性細(xì)胞死亡研究展望，為銅代謝功能失調(diào)相關(guān)毒性損害或疾病的干預(yù)和抗腫瘤潛在應(yīng)用提供線索。

1 銅在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布及其生理學(xué)作用概述

生物體中銅穩(wěn)態(tài)依賴于不同形式銅離子的數(shù)量和分布等動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)。銅在生物體內(nèi)以Cu+(亞銅離子，還原型)和Cu2+(銅離子，氧化型)兩種不同的離子形式存在，參與細(xì)胞生理功能或病理過(guò)程的調(diào)控[1,9]。細(xì)胞外的Cu2+能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜受體的相互作用；細(xì)胞內(nèi)則主要是保持Cu+狀態(tài)，其中細(xì)胞膜上的Cu+可以直接或通過(guò)抑制磷酸酶發(fā)揮結(jié)構(gòu)修飾和(或)氧化還原作用，改變生長(zhǎng)因子的膜受體激活狀態(tài)；細(xì)胞質(zhì)中Cu+通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾或抑制磷酸酶，直接調(diào)節(jié)激酶活性；細(xì)胞核內(nèi)Cu+通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和隨后的蛋白質(zhì)合成[10]。

銅在生物體和細(xì)胞內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和排泄過(guò)程，決定機(jī)體內(nèi)銅的分布和穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。細(xì)胞外主要以Cu2+形式存在，其進(jìn)入細(xì)胞前在細(xì)胞表面經(jīng)金屬還原酶(如STEAP家族)還原為Cu+才能被吸收。Cu+主要在腸道吸收，銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(copper transporter 1, CTR1)以同源三聚體的形式存在于腸上皮細(xì)胞膜上，對(duì)Cu+的攝取具有高度特異性[11]。在血液循環(huán)中，銅與銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin, CP)、白蛋白和跨銅蛋白等血漿蛋白結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到器官和組織。已知外周組織和肝臟組織細(xì)胞中的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶α(copper-transporting ATPase alpha, ATP7A)和β(ATP7B)，分別在細(xì)胞攝取銅和銅從肝細(xì)胞流出的過(guò)程中發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)作用[12]。ATP7A負(fù)責(zé)將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到門(mén)靜脈；腸道吸收的進(jìn)入外周循環(huán)的Cu+通過(guò)門(mén)靜脈循環(huán)到達(dá)肝臟，因此肝臟是銅的主要捕獲者、分配者和排泄者，是調(diào)節(jié)全身銅穩(wěn)態(tài)的核心。通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)銅濃度保持在非常低的水平，且主要以結(jié)合銅形式存在，以防止細(xì)胞內(nèi)游離銅的積累及其對(duì)細(xì)胞的損害[13]。在細(xì)胞內(nèi)，ATP7A將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到反式高爾基網(wǎng)絡(luò)和囊泡中，調(diào)節(jié)銅的亞細(xì)胞分布和靶向各種銅蛋白；例如腸上皮細(xì)胞或肝細(xì)胞內(nèi)的Cu+，可以在銅伴侶蛋白作用下，參與合成銅鋅超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)，是生物體中抗氧化酶體系的重要成員[1]。儲(chǔ)存在肝細(xì)胞中的銅，可釋放到血液中進(jìn)一步分布，或運(yùn)輸?shù)侥懼信判?。其中，ATP7A可促進(jìn)銅通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)；ATP7B調(diào)控細(xì)胞內(nèi)銅的排出，在銅過(guò)量時(shí)，肝細(xì)胞胞質(zhì)中Cu+被銅伴侶蛋白抗氧化物1結(jié)合，通過(guò)結(jié)合ATP7B的N端金屬結(jié)合域，轉(zhuǎn)移至膽管膜處進(jìn)入膽汁以排泄人體過(guò)量的銅[5,14]。

銅的儲(chǔ)存和動(dòng)員，在酵母中主要受定位于液泡的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr2和Ctr6調(diào)控。其中，Ctr2通過(guò)細(xì)胞膜銅伴侶蛋白促進(jìn)銅的利用，Ctr2缺失可導(dǎo)致液泡中銅水平增加；Ctr6缺失可通過(guò)減少銅鋅SOD1造成銅過(guò)載[1,9]。真核細(xì)胞中，線粒體是銅儲(chǔ)存和動(dòng)員的重要細(xì)胞器；位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C(cytochrome C, CytC)氧化酶銅伴侶蛋白17(COX17)可以結(jié)合1～4個(gè)Cu+，將細(xì)胞質(zhì)中Cu+攜帶至線粒體間隙，并傳遞給細(xì)胞色素氧化酶缺陷同源物1，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, CCO)Ⅱ和Ⅰ亞單位，以激活呼吸鏈中酶的活性。此外，細(xì)胞膜Cu+向線粒體間隙的轉(zhuǎn)運(yùn)目前尚不清楚，可能與從酵母和小鼠肝臟中分離出的一種結(jié)構(gòu)不明的新型銅配體有關(guān)[1]。

銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)，如銅積累過(guò)多或運(yùn)輸不當(dāng)，細(xì)胞內(nèi)銅濃度超過(guò)穩(wěn)態(tài)機(jī)制維持的閾值時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[15]。例如，嚴(yán)重的銅缺乏會(huì)導(dǎo)致多種損傷，包括由線粒體中的CCO功能障礙引起的能量產(chǎn)生受損；反之，細(xì)胞內(nèi)銅過(guò)載也可誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生。研究表明，ATP7A基因突變引起銅吸收和利用功能喪失的門(mén)克斯病(Menkes disease, MD)，是一種發(fā)生在嬰兒期、致命性的遺傳性銅缺乏癥，其特征是進(jìn)行性神經(jīng)損傷導(dǎo)致的死亡；ATP7B基因突變會(huì)導(dǎo)致肝臟和神經(jīng)元銅超載誘發(fā)威爾遜氏病(Wilson′s disease, WD)等[12,16]。在細(xì)胞中，Cu2+積累的毒性作用和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，部分歸因于與蛋白質(zhì)位點(diǎn)的不當(dāng)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊、聚集和功能喪失。研究表明，人正常肺支氣管上皮細(xì)胞暴露于Cu2+，RNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)基因激活、泛素相關(guān)基因以及自噬調(diào)節(jié)基因表達(dá)增高，表明Cu2+誘導(dǎo)蛋白酶體降解，經(jīng)由自噬可從細(xì)胞質(zhì)中去除并進(jìn)一步降解錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)復(fù)合物[17]。另外，銅平衡的改變與阿爾茨海默病中淀粉樣斑塊沉積和帕金森病中α-突觸核蛋白的蛋白聚集有關(guān)[18]。

因此，靶向干預(yù)銅在機(jī)體或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布過(guò)程，是當(dāng)前銅代謝失調(diào)相關(guān)疾病的主要新藥開(kāi)發(fā)策略。伊利司莫(elesclomol, ES)是一種高度親脂性的Cu2+結(jié)合分子，可以運(yùn)載銅離子穿過(guò)細(xì)胞膜，有望用于MD和其他遺傳性銅缺乏癥相關(guān)疾病的干預(yù)和治療。Guthrie等[19]發(fā)現(xiàn)在Atp7a缺陷小鼠中，ES與銅離子結(jié)合、分揀銅轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體和募集到銅酶上，可增加腦中的CCO水平、減輕小鼠中MD病理改變和死亡率，預(yù)防有害的神經(jīng)退行性變化，提高重度MD模型中斑紋樣變小鼠的存活率。

2 銅外源物暴露誘導(dǎo)RCD和調(diào)控作用機(jī)制

銅是多種含金屬酶的輔因子以及生物結(jié)構(gòu)成分的必需元素，其生物學(xué)效應(yīng)呈U形(非線性)劑量效應(yīng)關(guān)系[20]；因此，銅穩(wěn)態(tài)與腫瘤、肝損傷及神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在其中發(fā)揮雙向調(diào)控作用[13]。本文分析并討論銅暴露及其代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)誘導(dǎo)的相關(guān)RCD及其調(diào)控機(jī)制，具體模式圖見(jiàn)圖1。

2.1 銅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制

細(xì)胞凋亡是一種真核細(xì)胞常見(jiàn)的程序性細(xì)胞死亡或RCD形式。當(dāng)細(xì)胞自身內(nèi)部環(huán)境發(fā)生擾動(dòng)，如DNA復(fù)制錯(cuò)誤或損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧超載等，或響應(yīng)外部環(huán)境刺激影響(通常由死亡受體或依賴性受體家族激活)時(shí)，可引發(fā)相應(yīng)的內(nèi)源性或外源性細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)，或引起各種損傷和疾病相關(guān)的病理過(guò)程的調(diào)節(jié)[2,4]。本課題組前期報(bào)道了不同外源物暴露誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制，例如，合成的超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIO-NP)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡且敏感性高于正常肝細(xì)胞，證實(shí)靶向線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)墙閷?dǎo)癌癥特異性細(xì)胞毒性的新分子靶點(diǎn)[7]；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SPIO-NP可誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)表達(dá)及其轉(zhuǎn)位在線粒體關(guān)聯(lián)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的分布，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間通訊串話，介導(dǎo)線粒體依賴性凋亡和誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性[21]；乙型肝炎病毒X蛋白靶向誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)的B56γ亞基，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和肝細(xì)胞凋亡[22]。已有研究在不同動(dòng)物和組織中確認(rèn)，銅能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡，較為普遍地將其歸因于內(nèi)源性凋亡類的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器相關(guān)的應(yīng)激損傷，證明調(diào)控這些細(xì)胞器應(yīng)激損傷過(guò)程能夠干預(yù)銅誘導(dǎo)凋亡和影響轉(zhuǎn)歸[13,17]。

圖中縮略詞按從左往右、從上往下順序依次排列：ATP7A，銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶α；ATP7B，銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶β；CytC，細(xì)胞色素C；ROS：活性氧；Bcl-2，B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白；Bax，B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白；Bak，B淋巴細(xì)胞瘤-2同源拮抗蛋白；Caspase-9、-7、-3，半胱天冬酶-9、-7、-3；PERK，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；ERO1α，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1α；ATF4、6，激活轉(zhuǎn)錄因子4、6；IRE1α，需肌醇酶1α；XBP1，X-Box結(jié)合蛋白1；ER，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；CTR1，銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；ES，伊利司莫；DSF，雙硫侖；p53，抑癌蛋白p53；γH2AX，磷酸化組蛋白H2AX；RIPK1、3，受體相互作用蛋白激酶1、3；p-MLKL，磷酸化混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白；HIF1α，缺氧誘導(dǎo)因子1α；COMMD10，銅代謝MURR1結(jié)構(gòu)域10；GPX4，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4；LPO：脂質(zhì)過(guò)氧化；Cu-NPs，銅基納米顆粒；Fenton/Haber Weiss，芬頓反應(yīng)和哈伯-韋斯反應(yīng)；CTSB，組織蛋白酶B；NLRP3，NOD樣受體家族成員3；ILs，白介素家族；GSDMD，穿孔素D；STEAP，六跨膜前列腺上皮抗原；DLAT，二氫硫辛酰胺S-乙酰轉(zhuǎn)移酶；FDX1，鐵氧還蛋白1；LA，硫辛酸；COX17，細(xì)胞色素C氧化酶銅伴侶17；HSP70，熱休克蛋白70；TCA，三羧酸循環(huán)

銅經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Wu等[23]發(fā)現(xiàn)CuSO4處理的ICR小鼠肝臟細(xì)胞中CHOP通路、JNK通路和Caspase-12通路分子的mRNA和蛋白水平升高，激活相應(yīng)通路增加肝細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生顆粒狀和空泡狀變性損傷。Liu等[24]在CuSO4處理ICR小鼠中進(jìn)一步驗(yàn)證了高劑量Cu2+暴露通過(guò)增加活性氧和蛋白質(zhì)羰基化合物水平，降低谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量以及SOD等mRNA和酶活性誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，CytC釋放、切割的Caspase-9和Caspase-3、Bak和Bax水平增加，Bcl-2降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，Zhao等[25]用銅納米顆粒(copper nanoparticles, CuNPs)和CuSO4處理斑馬魚(yú)胚胎，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜的細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)膜減少并形成大的囊泡，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成松散結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞中活性氧和非折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Caspase-3增加、Bcl-2蛋白下調(diào)，促進(jìn)眼部細(xì)胞凋亡發(fā)生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷；而清除活性氧、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可有效恢復(fù)銅應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡所致的胚胎視網(wǎng)膜缺陷；其中銅負(fù)載誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與含CuNPs暴露和銅離子釋放密切相關(guān)，給予CuNPs或Cu2+處理的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cox17-/-和Atp7a-/-突變體中，氧化還原相關(guān)和抗氧化基因、未折疊蛋白反應(yīng)傳感器基因均明顯下調(diào)。

銅經(jīng)由自噬和線粒體自噬通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Luo等[26]給予小鼠單核巨噬細(xì)胞CuSO4處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中線粒體活性氧水平增高，經(jīng)由蛋白激酶B-AMP活化蛋白激酶-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)自噬發(fā)生和自噬體形成，切割的Caspase-3、-8、-9和聚(ADP-核糖)聚合酶蛋白表達(dá)增高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；采用線粒體活性氧抑制劑Mito-TEMPO和通過(guò)雷帕霉素干預(yù)自噬，可改善CuSO4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；敲低自噬相關(guān)蛋白5(autophagy related 5, Atg5)抑制自噬，可增強(qiáng)CuSO4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Tang團(tuán)隊(duì)的系列研究中，Yang等[27]給予肉雞喂食過(guò)量銅，發(fā)現(xiàn)雞肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核膜破壞、染色質(zhì)濃縮碎裂以及線粒體腫脹和空泡化，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，Bax、Bak1、Caspase-3、CytC等mRNA水平增高，Bcl-2下調(diào)，Pink1、p53基因上調(diào)，提示銅誘導(dǎo)線粒體損傷相關(guān)的細(xì)胞凋亡；通過(guò)PINK1/Parkin途徑引發(fā)線粒體自噬可減弱凋亡損傷；采用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可加重銅誘導(dǎo)的細(xì)胞周期S期停滯和凋亡率增加。

靶向銅誘導(dǎo)凋亡相關(guān)途徑的功能藥物開(kāi)發(fā)和抗癌應(yīng)用已有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、甲狀腺癌、口腔癌和胰腺癌等多種癌癥患者血清和腫瘤組織中銅含量升高，并與部分癌癥分期和進(jìn)展密切相關(guān)[5-6,13]。癌癥組織中的銅富集特征正在成為抗癌藥物開(kāi)發(fā)中有吸引力的靶點(diǎn)；基于靶向銅誘導(dǎo)凋亡有兩種主要策略在臨床前和臨床條件下進(jìn)行試驗(yàn)。第一種涉及使用銅螯合劑，如D-青霉胺、四硫代鉬酸鹽(tetrathiomolybdate, TTM)和曲恩汀等，通過(guò)直接與銅結(jié)合來(lái)降低銅的生物利用度；第二種是使用銅離子載體，如雙硫侖(disulfiram, DSF)、二十二碳六烯酸和硫代氨基脲等，可以增加細(xì)胞內(nèi)銅離子水平，通過(guò)產(chǎn)生活性氧、抑制蛋白酶體和誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[5,28-29]。其中，ES可螯合細(xì)胞外銅，以ES-Cu2+復(fù)合物形式進(jìn)入細(xì)胞并可快速且選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，使Cu2+被還原為Cu+，導(dǎo)致大量活性氧產(chǎn)生，觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)多種癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤活性[28]；例如，ES可誘導(dǎo)人T淋巴細(xì)胞白血病HSB2細(xì)胞中出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)特征性基因轉(zhuǎn)錄譜的變化，提示ES通過(guò)將活性氧水平提高至超過(guò)觸發(fā)細(xì)胞死亡的閾值這一獨(dú)特特征誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。DSF在抗癌應(yīng)用中的巨大潛力引起關(guān)注。首先，癌細(xì)胞中含有通過(guò)CTR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的大量Cu+可與DSF反應(yīng)，生成二乙基二硫代氨基甲酸銅配合物[Cu(DDC)2CuET]，特異性地靶向和滲透到癌細(xì)胞中，而不是銅水平低的正常健康細(xì)胞。其次，DSF在癌細(xì)胞中抑制SOD，并與GSH還原酶競(jìng)爭(zhēng)，阻斷由醛脫氫酶同工酶介導(dǎo)的活性氧清除和解毒，介導(dǎo)隨后的氧化應(yīng)激和DNA損傷，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶誘導(dǎo)線粒體通透性改變和凋亡[29]。第三，已經(jīng)證實(shí)，DSF或代謝物與銅的結(jié)合物是許多癌癥中功能性蛋白酶體相關(guān)蛋白的抑制劑，介導(dǎo)多泛素化蛋白和重要蛋白質(zhì)(如IκB、p27和c-Myc等)的細(xì)胞毒性蛋白聚集體的積累，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和隨后的凋亡[30]。第四，DSF-Cu復(fù)合物可抑制NF-κB活性，抑制肝癌中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或使癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感等[31]。此外，研究者通過(guò)優(yōu)化藥物組裝和遞送策略等方法，改善DSF的穩(wěn)定性差、代謝快速、血漿半衰期短等不足，以期發(fā)揮其靶向銅代謝調(diào)控的優(yōu)越性介導(dǎo)抗癌效應(yīng)[32]。

2.2 銅誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡及其分子機(jī)制

壞死性凋亡是一種在形態(tài)上與壞死類似的RCD形式，特征包括質(zhì)膜完整性喪失、胞質(zhì)半透明化、細(xì)胞體積增加和細(xì)胞器腫脹；在機(jī)制上與細(xì)胞凋亡相似，壞死性凋亡主要由受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein, RIP)激酶1(RIPK1)、RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like, MLKL)形成的壞死小體復(fù)合物介導(dǎo)和作為信號(hào)調(diào)控樞紐起決定性作用[2,4]。RIPK1/RIPK3/MLKL復(fù)合物通過(guò)引發(fā)線粒體功能障礙來(lái)誘導(dǎo)壞死性凋亡，涉及誘導(dǎo)線粒體自噬、線粒體活性氧產(chǎn)生、線粒體磷酸酶磷酸甘油酸變位酶家族成員5的激活，或誘導(dǎo)線粒體通透性改變等多種機(jī)制[33]。新近，廈門(mén)大學(xué)韓家淮院士團(tuán)隊(duì)Chen等[34]借助單分子定位超分辨成像技術(shù)，采用“隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡”，在細(xì)胞原位首次觀察到壞死小體在細(xì)胞中的組織結(jié)構(gòu)特征，揭示了RIPK1/RIPK3信號(hào)中樞組成的分布及其與MLKL四聚體結(jié)合的精準(zhǔn)信號(hào)，解析了壞死小體形成及其靶向細(xì)胞膜和決定細(xì)胞壞死性凋亡的分子調(diào)控機(jī)制。研究表明，多種外源物如金屬化合物、納米材料和病原微生物等的暴露，都可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡及其可被靶向調(diào)控和干預(yù)[35]。本課題組關(guān)注于外源物暴露誘導(dǎo)的壞死性凋亡發(fā)生及其線粒體質(zhì)量控制調(diào)控相關(guān)機(jī)制研究[36]；乙肝病毒X蛋白與黃曲霉毒素B1聯(lián)合暴露，通過(guò)COX-2介導(dǎo)壞死小體形成和線粒體動(dòng)力學(xué)紊亂，觸發(fā)肝脂肪變性[37]；鎘化合物(Cd2+)誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性中，經(jīng)由線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1和Rb蛋白互作，介導(dǎo)RIPK1/RIPK3/p-MLKL在線粒體的分布及其誘導(dǎo)的線粒體依賴性壞死性凋亡[38]；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在Cd2+誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中，線粒體氧化還原驅(qū)動(dòng)的線粒體融合蛋白2的S-谷胱甘肽化修飾，通過(guò)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體串?dāng)_，促進(jìn)神經(jīng)元壞死性凋亡[39]。

銅經(jīng)由活性氧依賴性DNA損傷誘導(dǎo)壞死性凋亡和毒性損傷。銅離子是細(xì)胞核中最豐富的金屬離子，細(xì)胞經(jīng)CuCl2處理，Cu2+可進(jìn)入核內(nèi)結(jié)合DNA并引起其斷裂。在鱒魚(yú)原代肝細(xì)胞中，Cu2+和Cd2+都具有細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞發(fā)生線粒體膜通透性改變、DNA損傷和細(xì)胞器腫脹，導(dǎo)致細(xì)胞壞死性凋亡；采用壞死性凋亡抑制劑Nec-1或z-VAD-FMK可緩解Cu2+引起的細(xì)胞凋亡；但是，相比于Cd2+的細(xì)胞毒性，Cu2+的毒性需要更高的濃度和更長(zhǎng)的作用時(shí)間才能達(dá)到類似Cd2+的毒性水平[40]。

利用銅離子及銅化合物誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡的調(diào)節(jié)作用，可應(yīng)用于腫瘤化學(xué)預(yù)防和靶向干預(yù)。已知植物化合物如多酚等作用于血液分離的淋巴細(xì)胞，在Cu2+還原為Cu+及其再氧化過(guò)程中產(chǎn)生活性氧(尤其是羥基自由基)，結(jié)合染色質(zhì)(尤其是鳥(niǎo)嘌呤)并導(dǎo)致DNA斷裂；Nanni等[41]發(fā)現(xiàn)，采用牛至葉水醇提取物處理人黑色素瘤細(xì)胞，可以激活線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧并引起DNA斷裂，使用銅螯合劑證實(shí)了Cu2+在DNA損傷中的作用；因此，利用化合物對(duì)銅濃度較高的腫瘤細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性的特征(對(duì)非腫瘤細(xì)胞沒(méi)有)，可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生和介導(dǎo)腫瘤化學(xué)預(yù)防。此外，利用銅化合物組裝的銅基納米材料在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死性凋亡中被廣泛應(yīng)用，如用于磁共振成像的CuS-MnS2納米花，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的壞死性凋亡，可介導(dǎo)卵巢癌的光熱/光動(dòng)力治療[42]。應(yīng)用于臨床成像診斷和具有光熱/光動(dòng)力療法特性的CuS-NiS2納米材料聯(lián)合近紅外光治療，可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧，激活RIPK1/RIPK3/MLKL壞死小體復(fù)合物；干預(yù)MLKL會(huì)降低帽肌動(dòng)蛋白(capping actin protein, CAPG)含量，證實(shí)通過(guò)MLKL/CAPG誘導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生，可顯著減小小鼠體內(nèi)腫瘤體積[43]。采用銅介導(dǎo)的18F-標(biāo)記設(shè)計(jì)的正電子發(fā)射斷層掃描放射性示蹤劑CNY-07，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)血腦屏障靶向RIPK1以表征腦中壞死性凋亡的發(fā)生并進(jìn)行體內(nèi)成像；聯(lián)合RIPK1抑制劑如Nec-1和DL747等的使用，在治療一些腦部疾病中具有更佳效果；提示銅相關(guān)壞死性凋亡作為生物標(biāo)志，在疾病診斷、藥物評(píng)估和分子機(jī)制研究方面具有潛在的應(yīng)用前景[44]。

2.3 銅誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡及其分子機(jī)制

焦亡是一種由炎性小體引發(fā)的溶解性程序性死亡，可清除受損細(xì)胞，同時(shí)引發(fā)炎癥反應(yīng)。不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡中存在相應(yīng)炎性小體的典型激活，如損傷或病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)含有pyrin結(jié)構(gòu)域的NOD樣受體家族成員3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3)、細(xì)菌感染誘導(dǎo)含有CARD的NLR家族蛋白4 (NLR-family CARD-containing protein 4, NLRC4)、異常雙鏈DNA誘導(dǎo)黑色素瘤中缺失的PYHIN家族成員2 (PYHIN family member absent in melanoma 2, AIM2)等激活，可活化Caspase-1，剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，經(jīng)由穿孔素D的N端在細(xì)胞膜上形成的膜孔釋放成熟白介素，如IL-1β和IL-18[2,4,45]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1通過(guò)PP2A-B56γ靶向COX-2去磷酸化介導(dǎo)COX-2在線粒體關(guān)聯(lián)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜分布及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)性降解，增強(qiáng)NLRP3依賴性肝細(xì)胞焦亡，并通過(guò)IL-1β釋放、介導(dǎo)Kupffer細(xì)胞活化，促進(jìn)肝臟炎癥損傷[46]。

銅暴露誘導(dǎo)NLRP3依賴性細(xì)胞焦亡介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Deigendesch等[47]研究表明，銅經(jīng)由經(jīng)典的NLRP3炎性小體激活通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡并參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。首先，采用銅螯合劑TTM預(yù)處理后，小鼠腹腔注射大腸埃希菌來(lái)源的脂多糖構(gòu)建NLRP3活化依賴性急性炎癥模型，發(fā)現(xiàn)血清Caspase-1依賴性細(xì)胞因子降低，而不依賴Caspase-1的細(xì)胞因子不受TTM預(yù)處理影響；血清中游離組蛋白- DNA復(fù)合物和高遷移率族蛋白1水平降低；提示生物體內(nèi)銅的利用障礙和消耗，可特異性抑制Caspase-1依賴性炎性小體激活及其介導(dǎo)的全身性損傷。其次，在脂多糖引發(fā)野生型和NLRP3缺陷型小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞中，TTM以劑量依賴性方式顯著降低Caspase-1 p20活化、IL-1β釋放和細(xì)胞焦亡；回補(bǔ)試驗(yàn)中僅添加Cu2+可逐步恢復(fù)TTM的抑制作用，提示銅特異性地激活NLRP3和焦亡是TTM抑制炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制；且在各炎性小體干預(yù)試驗(yàn)中，證實(shí)銅對(duì)巨噬細(xì)胞中NLRP3典型激活誘導(dǎo)焦亡的調(diào)控具有特異性。第三，TTM預(yù)處理SOD1缺陷型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，再給予NLRP3炎性小體激活劑，發(fā)現(xiàn)其IL-1β釋放和細(xì)胞焦亡降低，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)降低，提示銅耗竭特異性地阻斷經(jīng)典NLRP3激活介導(dǎo)的焦亡，是由于銅依賴性SOD1活性下調(diào)所致。第四，體外試驗(yàn)中給予TTM處理人骨髓細(xì)胞系細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞IL-1β分泌和焦亡對(duì)銅耗竭不敏感；而從非感染性腹腔積液患者分離的腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)脂多糖和尼日利亞菌素引發(fā)后給予TTM銅螯合，可降低IL-1β分泌，提示巨噬細(xì)胞中典型NLRP3活化是銅穩(wěn)態(tài)介導(dǎo)的特有調(diào)控作用[47]。Tao等[48]采用氧化銅納米顆粒(copper oxide nanoparticles, CuONPs)處理小鼠巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NLRP3、Caspase-1和IL-1β等蛋白和mRNA水平以及IL-1β釋放增加；給予NLRP3siRNA和Z-YVAD-FMK可降低CuONPs誘導(dǎo)的Caspase-1 p20和IL-1β的表達(dá)；提示CuONPs可經(jīng)由NF-κB通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞NLRP3依賴性焦亡發(fā)生。透射電鏡顯示CuONPs沉積在溶酶體中，溶酶體滲透性增高，促進(jìn)組織蛋白酶B釋放和活性發(fā)揮；將CuONPs加入人工溶酶體液中孵育發(fā)現(xiàn)，酸性條件下可釋放大量Cu2+；并且H2O2使CuONPs和銅離子產(chǎn)生的羥基加合物的信號(hào)增強(qiáng)；提示銅離子通過(guò)Fenton反應(yīng)或Haber-Weiss反應(yīng)的價(jià)態(tài)躍遷引起氧化應(yīng)激，經(jīng)由多途徑級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的串聯(lián)激活。TTM預(yù)處理可減少CuONPs處理誘導(dǎo)的活性氧生成和NLRP3激活，表明巨噬細(xì)胞NLRP3依賴性焦亡發(fā)生需要銅的參與，減少銅的可利用性能緩解CuONPs誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡介導(dǎo)的免疫損傷[48]。Hufnagel等[49]在分化的巨噬細(xì)胞樣THP-1細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞共培養(yǎng)的肺組織模擬體系中，給予CuONPs處理，基因表達(dá)譜(包括細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)錄毒性譜)分析，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系的A549細(xì)胞中巨噬細(xì)胞衍生趨化因子CCL22和IL-1β基因上調(diào)、SOD2表達(dá)增高[49]。由此提示共培養(yǎng)模擬CuONPs的呼吸道暴露，可經(jīng)由誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)增強(qiáng)而引起肺部炎癥；其潛在機(jī)制為肺上皮細(xì)胞暴露于CuONPs后釋放趨化因子招募巨噬細(xì)胞參與炎癥應(yīng)答，而銅可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體依賴性細(xì)胞焦亡和促炎轉(zhuǎn)錄因子激活，通過(guò)放大反饋進(jìn)一步增強(qiáng)了IL-1β為代表的炎癥水平，表明銅與肺局部免疫功能調(diào)控相關(guān)。

銅暴露誘導(dǎo)Caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡介導(dǎo)肝細(xì)胞毒性。肝細(xì)胞是銅損傷和毒性的主要靶細(xì)胞之一。Tang研究團(tuán)隊(duì)Liao等[50]采用肉雞原代肝細(xì)胞給予CuSO4以及與N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine, NAC)聯(lián)合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cu2+誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因mRNA水平和Caspase-1蛋白表達(dá)升高，培養(yǎng)上清液中Caspase-1、IL-1β和IL-18含量增加，細(xì)胞空泡化，細(xì)胞體積和密度減?。籒AC可緩解Cu2+引起的上述mRNA、蛋白質(zhì)的變化；證明過(guò)量的Cu2+通過(guò)在肝細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。采用Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK聯(lián)合Cu2+處理，細(xì)胞形態(tài)更接近正常肝細(xì)胞，可減弱Cu2+誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性增加，且增加線粒體膜電位并減少細(xì)胞凋亡；表明抑制Caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡可減弱Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，緩解肝細(xì)胞毒性損傷和死亡，提示銅暴露誘導(dǎo)凋亡和焦亡之間的關(guān)聯(lián)性和信號(hào)通路串話[50]。

銅暴露誘導(dǎo)NLRP3依賴性細(xì)胞焦亡介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)毒性。Dong等[51]采用CuCl2與脂多糖聯(lián)合處理非突變對(duì)照小鼠來(lái)源的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NLRP3、切割的Caspase-1、ASC和IL-1β蛋白水平呈時(shí)間依賴性升高；提示CuCl2暴露引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3活化介導(dǎo)的炎癥和隨后的神經(jīng)毒性[51]。采用近交系的自然突變小鼠，即毒性牛奶(toxic milk, TX)小鼠作為一種WD動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)TX小鼠紋狀體、海馬、皮層和小腦中Caspase-1、ASC和IL-1β水平升高；小鼠尾靜脈注射慢病毒包封的siNlrp3干預(yù)，可下調(diào)TX小鼠腦部NLRP3蛋白水平，增加自發(fā)行進(jìn)總距離和攀爬行為，改善小鼠運(yùn)動(dòng)功能；給予小鼠NLRP3抑制劑MCC950干預(yù)，可減輕紋狀體、海馬、皮層和小腦中銅沉積導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失及梗死，并顯著增加TX小鼠自發(fā)行進(jìn)的總距離，逆轉(zhuǎn)其攀爬行為和運(yùn)動(dòng)功能的減少，改善其記憶力和空間學(xué)習(xí)能力，提示靶向干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3焦亡介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可改善其行為學(xué)缺陷并對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，抑制NLRP3炎性小體激活可防止WD小鼠中銅過(guò)載誘導(dǎo)的神經(jīng)病理學(xué)損傷。

銅暴露誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性細(xì)胞焦亡介導(dǎo)空腸上皮細(xì)胞毒性。Tang研究團(tuán)隊(duì)Liao等[52]發(fā)現(xiàn)，高銅喂養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致豬體重下降。采用CuCl2處理豬空腸上皮細(xì)胞，可引起細(xì)胞活性呈劑量依賴性下降、細(xì)胞破裂增多；Cu2+處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞焦亡標(biāo)志相關(guān)mRNA和蛋白水平升高，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)和Caspase-1熒光信號(hào)升高。采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-苯基丁酸和需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)抑制劑MKC-3946，可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的IRE1α-X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)通路，緩解銅誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。由此表明IRE1α-XBP1通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與促進(jìn)銅過(guò)量誘導(dǎo)的豬空腸上皮細(xì)胞焦亡；此為探討銅化合物作為一種常見(jiàn)食品添加劑時(shí)，因攝入過(guò)量(銅暴露)引發(fā)腸道吸收的毒性作用和健康危害提供線索[52]。

2.4 銅誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡及其分子機(jī)制

“鐵死亡(ferroptosis)”是一種鐵離子依賴的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、壞死、自噬的程序性細(xì)胞死亡，以鐵穩(wěn)態(tài)的破壞和脂質(zhì)活性氧的積累為主要特征；其形態(tài)特征變化主要表現(xiàn)為線粒體膜密度增加，線粒體嵴減少或消失，以及線粒體外膜破裂[2,4,53]。鐵死亡可通過(guò)外源性或內(nèi)源性途徑誘發(fā)；外源性途徑是通過(guò)抑制細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白而啟動(dòng)；內(nèi)源性途徑是通過(guò)阻斷細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)來(lái)激活[53]。研究表明，鐵死亡受到多種細(xì)胞代謝事件的調(diào)節(jié)，包括氧化還原穩(wěn)態(tài)、鐵穩(wěn)態(tài)、線粒體活性，氨基酸、脂質(zhì)和糖代謝，以及與疾病相關(guān)的信號(hào)通路等；鐵死亡調(diào)控和防御機(jī)制涉及細(xì)胞不同部位的抗氧化系統(tǒng)，如位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體的GPX4-GSH系統(tǒng)等[54]。因此，鐵死亡作為一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的紐帶，將代謝、氧化還原生物學(xué)和疾病聯(lián)系起來(lái)。目前，鐵死亡領(lǐng)域在許多方面方興未艾；本課題組關(guān)注于鐵死亡信號(hào)介導(dǎo)的抗腫瘤作用，及其與不同細(xì)胞器調(diào)控機(jī)制的關(guān)聯(lián)性[55]。

鐵死亡被認(rèn)為是與鐵相關(guān)的細(xì)胞死亡模式，但其他金屬在此過(guò)程中的作用在很大程度上被忽略了[56]。Chen等[57]發(fā)現(xiàn)鋅與鐵相似，對(duì)鐵死亡也起重要作用；鋅螯合劑可有效拮抗Erastin誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞和纖維肉瘤細(xì)胞鐵死亡，補(bǔ)鋅可逆轉(zhuǎn)鐵螯合劑保護(hù)的鐵死亡；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)鋅水平的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP7對(duì)于鐵死亡至關(guān)重要，這些對(duì)涉及鐵死亡和鋅失調(diào)的疾病具有治療意義。類似地，錳也具有與鐵類似的氧化還原活性；Mn2+通過(guò)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，Mn3+通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。錳暴露在大腦中積累，尤其蓄積在線粒體中刺激H2O2產(chǎn)生，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡；而采用鐵螯合劑去鐵胺聯(lián)合處理，經(jīng)由限制Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)和增加Mn2+吸收進(jìn)而誘導(dǎo)更強(qiáng)的類芬頓反應(yīng)，加劇細(xì)胞死亡[58]。特別的是，銅和鐵之間存在代謝串話，可以是通過(guò)依賴銅的CP催化Fe2+氧化為Fe3+；或通過(guò)腸道中的銅-鐵相互作用，由腸道表達(dá)的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白介導(dǎo)，具有CP相似的Fe2+/Fe3+催化功能。過(guò)量Cu+/Cu2+和Fe2+/Fe3+通過(guò)芬頓反應(yīng)影響細(xì)胞功能，催化反應(yīng)性羥基自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)的永久性修飾，誘導(dǎo)嚴(yán)重的氧化損傷和細(xì)胞死亡[59]。目前，已有研究表明銅可以誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生，可能與不同含銅外源物和對(duì)不同細(xì)胞類型的作用有關(guān)。

銅誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡。Maher[60]在小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的暴露模型中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl2和CuCl2都誘導(dǎo)GSH消耗，可增強(qiáng)Erastin、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SSZ)和丁硫氨酸亞砜亞胺誘導(dǎo)的鐵死亡和細(xì)胞活性下降；而且Cu2+增強(qiáng)SSZ和Erastin的毒性，如活性氧升高、GPx降低等，比Fe2+更有效；該結(jié)果為衰老相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的干預(yù)應(yīng)用提供線索。Southon等[61]在大鼠原代神經(jīng)元和永生化大鼠神經(jīng)元N27細(xì)胞中，采用RSL3抑制GPX4活性或Erastin阻斷胱氨酸攝取誘導(dǎo)鐵死亡模型，發(fā)現(xiàn)二乙酰-雙(4-甲基-3-氨基硫脲)CuⅡ[CuⅡ(atsm)]可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡；添加CuSO4無(wú)法挽救RSL3和Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明CuⅡ(atsm)可通過(guò)絡(luò)合游離銅離子介導(dǎo)抗鐵死亡作用；采用無(wú)金屬配體H2(atsm)可阻止N27細(xì)胞的鐵死亡，表明鐵死亡可以通過(guò)銅離子來(lái)調(diào)節(jié)。

靶向細(xì)胞內(nèi)銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的調(diào)節(jié)作用，可應(yīng)用于提高抗腫瘤作用敏感性。研究表明，鐵死亡可以作為癌癥脆弱性的靶點(diǎn)[54]；銅可通過(guò)氧化應(yīng)激刺激鐵死亡，提示根據(jù)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征設(shè)計(jì)新的銅配合物，可以使銅絡(luò)合物(如ES)和銅螯合劑成為潛在的抗癌劑。其中，ES作為銅離子載體，可作為新的靶向藥物發(fā)揮抗癌活性[28]。Gao等[56]采用ES處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，可提高線粒體中的Cu2+水平、降低ATP7A的表達(dá)，導(dǎo)致Cu2+滯留和活性氧積累，促進(jìn)SLC7A11降解，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)鐵死亡；表明ES通過(guò)降解ATP7A誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞銅依賴性鐵死亡，提示銅代謝在ES誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡中的重要性。研究表明，DSF可與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用以增強(qiáng)抗腫瘤作用，在人類癌癥治療方面具有巨大的潛力[62]。Li等[63]采用鼻咽癌細(xì)胞系和非惡性鼻咽上皮細(xì)胞，給予DSF和Cu2+聯(lián)合處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力比單獨(dú)DSF處理組明顯受到抑制；RNA-seq分析轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)鐵死亡通路參與DSF/Cu誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，7個(gè)鐵死亡相關(guān)基因發(fā)生顯著變化，證實(shí)了DSF對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的銅依賴性鐵死亡誘導(dǎo)作用。Sun等[64]采用合成的FeCuS-脂質(zhì)納米粒子(AIBA@FeCuS-FeCO)，給予人胃癌細(xì)胞孵育和超聲激活，或給予小鼠乳腺癌細(xì)胞荷瘤小鼠尾靜脈注射后超聲激活，發(fā)現(xiàn)該納米粒子可被降解并釋放出具有細(xì)胞毒性的AIBA自由基、CO、Fe2+和Cu2+，并通過(guò)CO介導(dǎo)的血管擴(kuò)張?jiān)鰪?qiáng)腫瘤對(duì)AIBA@FeCuS-FeCO的吸收，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Fe2+/Cu2+的積累，誘導(dǎo)羥基自由基和大量活性氧產(chǎn)生，以及線粒體膜電位降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；而使用DSF可進(jìn)一步與釋放的Cu2+螯合，產(chǎn)生有毒的雙(N,N-二乙基二硫代氨基甲酸)Cu2+螯合物，協(xié)同增強(qiáng)消融深部原位腫瘤的治療效果。

銅誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的抗腫瘤協(xié)同增效作用及其信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制已有報(bào)道。Ren等[65]研究發(fā)現(xiàn)，DSF/Cu可損害肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)，出現(xiàn)線粒體碎片化并聚集在細(xì)胞核周圍；DSF/Cu和索拉非尼單一或聯(lián)合處理組Huh7細(xì)胞中游離鐵池、超氧化物和脂質(zhì)過(guò)氧化物增多，激活p62S349的磷酸化；Huh7細(xì)胞皮下荷瘤模型裸鼠中，給予DSF口服和CuCl2肌內(nèi)注射以及口服索拉非尼聯(lián)合處理，證明DSF/Cu或索拉非尼可抑制腫瘤生長(zhǎng)，提示銅聯(lián)合抗癌藥物誘導(dǎo)HCC細(xì)胞鐵死亡發(fā)生具有協(xié)同增效作用。Yang等[66]研究顯示，細(xì)胞內(nèi)Cu2+增加有助于HCC細(xì)胞系的放射抗性；在HepG2細(xì)胞和小鼠輻射模型中，發(fā)現(xiàn)銅代謝MURR1結(jié)構(gòu)域10(copper metabolism MURR1 domain 10, COMMD10)是輻射劑量依賴性降低的獨(dú)特基因；COMMD10低表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)銅積累，抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF1α)的泛素化和降解，誘導(dǎo)HIF1α表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)下游CP和SLC7A11靶基因，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH合成和降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，協(xié)同抑制HCC細(xì)胞鐵死亡；在共表達(dá)COMMD10/CP的HCC細(xì)胞中，可以恢復(fù)由COMMD10過(guò)表達(dá)引起的Fe2+和脂質(zhì)過(guò)氧化的增加，促進(jìn)HIF1α表達(dá)，形成正反饋回路；表明通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Cu-Fe穩(wěn)態(tài)，抑制HIF1α/CP表達(dá)反饋環(huán)，可增強(qiáng)HCC細(xì)胞鐵死亡和放射敏感性，為抑制HCC細(xì)胞的放射抗性提供新的靶點(diǎn)和干預(yù)策略[66]。因此，探明銅誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的相關(guān)信號(hào)通路及其調(diào)控的分子機(jī)制，對(duì)探討銅介導(dǎo)鐵死亡等RCD參與毒性損傷作用和腫瘤化學(xué)預(yù)防具有重要意義。

3 銅依賴性細(xì)胞死亡(銅死亡)及其分子機(jī)制

新近，Tsvetkov等[3]研究顯示，在人類細(xì)胞中銅離子的異常升高可能以一種不同于已知RCD機(jī)制的途徑誘發(fā)細(xì)胞死亡；當(dāng)阻斷已知的細(xì)胞死亡方式，包括細(xì)胞凋亡、鐵死亡、焦亡和壞死性凋亡時(shí)，銅離子仍然可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，將這種銅依賴的、受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式命名為“銅死亡”[3]。

銅離子載體是結(jié)合銅離子的小分子，是研究銅死亡的重要工具[67]。Tsvetkov等[3]采用藥物再利用數(shù)據(jù)庫(kù)(該數(shù)據(jù)庫(kù)采用分子條形碼方法標(biāo)記578個(gè)人類癌細(xì)胞系，通過(guò)混合物中相對(duì)抑制譜同步分析技術(shù)，測(cè)試了4 518種藥物的抑癌活性)，通過(guò)分析1 448個(gè)載銅藥物對(duì)489種癌細(xì)胞系的殺傷效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載銅藥物對(duì)所有的細(xì)胞系均有殺傷作用[3,68]。重要的是，以強(qiáng)效銅離子載體ES為受試物，發(fā)現(xiàn)ES誘導(dǎo)的人腎平滑肌瘤G402細(xì)胞死亡并不涉及Caspase-3切割或激活；而且敲除凋亡關(guān)鍵效應(yīng)因子Bax和Bak，或者使用泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK和Boc-D-FMK，并不能逆轉(zhuǎn)ES誘導(dǎo)的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和NCIH2030細(xì)胞等的死亡；表明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與細(xì)胞凋亡不同。采用其他細(xì)胞死亡的抑制劑，包括ferrostatin-1(抑制鐵死亡)、Nec-1和NAC等，都未能消除ES誘導(dǎo)的NCIH2030和A549細(xì)胞死亡；表明ES誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制與已知細(xì)胞死亡不同[3]。

銅死亡的發(fā)生依賴于細(xì)胞內(nèi)銅的積累。單獨(dú)ES處理不影響惡性橫紋肌瘤MON細(xì)胞的生長(zhǎng)，但加入銅離子可使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，而其他金屬離子(如鐵、鈷、鋅、鎳等)并不能增強(qiáng)細(xì)胞的死亡。使用丁硫胺酸亞砜亞胺消耗細(xì)胞內(nèi)GSH，可增加ES誘導(dǎo)的人肝癌JHH7細(xì)胞死亡；而銅螯合劑TTM聯(lián)合ES處理人非小細(xì)胞肺癌ABC1細(xì)胞，其生長(zhǎng)并不受ES影響；由此表明，ES誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種依賴于銅的可調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[3]。

ES誘導(dǎo)的細(xì)胞銅死亡與線粒體呼吸密切相關(guān)。線粒體呼吸活躍的NCIH2030細(xì)胞(10 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng))對(duì)ES的敏感性是糖酵解活躍的細(xì)胞(10 mmol/L半乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng))近1 000倍。使用電子傳遞鏈復(fù)合物抑制劑(如魚(yú)藤酮、抗霉素A)以及線粒體丙酮酸攝取抑制劑，可減輕ES誘導(dǎo)的ABC1細(xì)胞死亡；但是，線粒體解偶聯(lián)劑對(duì)ES誘導(dǎo)的ABC1細(xì)胞死亡沒(méi)有影響。缺氧條件培養(yǎng)也減弱了ES誘導(dǎo)的ABC1細(xì)胞死亡；由此表明，ES誘導(dǎo)的細(xì)胞銅死亡需要線粒體呼吸參與，以糖酵解方式產(chǎn)生ATP對(duì)銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響較小。此外，ES處理沒(méi)有降低ABC1細(xì)胞的基礎(chǔ)或ATP相關(guān)耗氧率，但降低了呼吸備用能力；ES處理的ABC1細(xì)胞的代謝物組學(xué)分析顯示，三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物，如檸檬酸鹽、順烏頭酸、鳥(niǎo)苷二磷酸等，呈時(shí)間依賴性增加；由此表明，銅不直接靶向電子傳遞鏈，而是靶向干擾三羧酸循環(huán)[3]。

ES誘導(dǎo)銅死亡調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵基因表達(dá)改變。給予人卵巢癌OVISE細(xì)胞ES和二乙基二硫代氨基甲酸酯處理，進(jìn)行多重CRISPR-Cas9基因敲除篩選，確定了7個(gè)促進(jìn)銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵基因，包括鐵氧化還原蛋白1(ferredoxin 1,FDX1)，以及硫辛酸途徑中的脂酰轉(zhuǎn)移酶1、硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,LIAS)、二氫硫辛酰胺脫氫酶、二氫硫辛酰胺S-乙酰轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoamide S-acetyltransferase,DLAT)、丙酮酸脫氫酶E1-α1亞基和β亞基等基因，在ES暴露后均上調(diào)；上述基因的敲除均能抑制CuCl2和ES誘導(dǎo)的ABC1和OVISE細(xì)胞死亡[3]。

FDX1和蛋白質(zhì)脂?；钦{(diào)控ES誘導(dǎo)銅依賴性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因子。蛋白質(zhì)脂?；且环N高度保守的賴氨酸翻譯后修飾，通過(guò)將硫辛酸基團(tuán)附著至底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能。蛋白質(zhì)脂酰化僅發(fā)生在二氫硫辛酰胺S-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoamide S-succinyltransferase, DLST)和DLAT等丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的重要組成部分，這些酶的蛋白質(zhì)脂酰化修飾是調(diào)節(jié)和發(fā)揮酶促功能所必需的[69]。乳腺癌和卵巢癌樣本中FDX1與脂酰化蛋白表達(dá)高度相關(guān)；而且FDX1敲除的人胰腺癌PSN1細(xì)胞中脂?；鞍譊LAT和DLST的表達(dá)完全喪失，并導(dǎo)致細(xì)胞耗氧率下降。此外，F(xiàn)DX1敲除的人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的代謝物分析顯示，硫辛酸代謝途徑中丙酮酸和α-酮戊二酸出現(xiàn)積累，提示三羧酸循環(huán)的抑制。由此證實(shí)FDX1是蛋白質(zhì)脂酰化的上游調(diào)節(jié)因子，調(diào)控ES經(jīng)由三羧酸循環(huán)誘導(dǎo)的細(xì)胞銅死亡[3]。

銅結(jié)合脂?；揎椀娜人嵯嚓P(guān)循環(huán)蛋白，調(diào)節(jié)其寡聚化和導(dǎo)致鐵-硫(Fe-S)簇蛋白缺失，介導(dǎo)ES誘導(dǎo)的銅死亡。從ABC1細(xì)胞裂解物中純化的DLAT和DLST蛋白能與銅直接結(jié)合，而敲除FDX1的ABC1細(xì)胞中提取的DLAT和DLST蛋白(由于脂?；笔?不再結(jié)合銅。銅與脂?；牡鞍捉Y(jié)合，導(dǎo)致DLAT脂?；蕾囆怨丫刍?；ES敏感細(xì)胞(ABC1細(xì)胞)給予ES處理，可增加DLAT寡聚體和不溶性DLAT的水平，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)明顯DLAT“聚集斑點(diǎn)”；而ES不敏感細(xì)胞(A549細(xì)胞)或FDX1敲除和脂?；毕軦BC1細(xì)胞中，僅高濃度ES處理導(dǎo)致DLAT寡聚化；表明銅離子載體暴露可誘導(dǎo)脂?；鞍踪|(zhì)異常寡聚化介導(dǎo)生物毒性。進(jìn)一步分析顯示，ES處理的ABC1細(xì)胞中Fe-S簇蛋白LIAS、烏頭酸酶2、琥珀酸脫氫酶復(fù)合物鐵硫亞基B、DNA聚合酶δ1催化亞基等呈FDX1依賴性的缺失，并誘導(dǎo)毒性應(yīng)激蛋白中的熱休克蛋白家族A(heat shock protein family A, HSP70)成員1B升高[3]。

Cu2+化合物誘導(dǎo)銅死亡及其信號(hào)通路調(diào)控已有報(bào)道。與ES誘導(dǎo)銅死亡作用一致，生理性的CuCl2補(bǔ)充也會(huì)導(dǎo)致A673細(xì)胞線粒體呼吸蛋白、脂?；鞍?DLAT，DLST)和Fe-S簇蛋白(FDX1等)表達(dá)降低，HSP70表達(dá)增高。FDX1和LIAS敲除均能逆轉(zhuǎn)CuCl2誘導(dǎo)的ABC1細(xì)胞和人胚腎HEK293T細(xì)胞死亡；銅螯合劑消耗GSH可增加CuCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。過(guò)表達(dá)銅吸收載體CTR1的HEK293T和ABC1細(xì)胞中，CuCl2誘導(dǎo)細(xì)胞死亡顯著增加。而其他細(xì)胞死亡形式的抑制劑，不能逆轉(zhuǎn)CuCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[3]。

因此，銅死亡是通過(guò)銅與三羧酸循環(huán)的脂酰化成分直接結(jié)合而發(fā)生的，經(jīng)由脂酰化蛋白質(zhì)聚集和隨后的Fe-S簇蛋白丟失，導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激和最終的銅死亡[3]。同時(shí)也提示，銅離子載體誘導(dǎo)的銅死亡表型及其級(jí)聯(lián)信號(hào)通路調(diào)節(jié)，在外源物誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)銅代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)介導(dǎo)銅死亡等細(xì)胞命運(yùn)結(jié)局中的作用，及其靶向干預(yù)和調(diào)控機(jī)制等仍有待進(jìn)一步探索。

4 展望

綜上所述，經(jīng)由銅的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)銅代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞的生理功能；環(huán)境因素誘導(dǎo)的銅代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可經(jīng)由不同的RCD和新定義的銅死亡形式，介導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷和腫瘤細(xì)胞死亡。因此，銅代謝穩(wěn)態(tài)及其相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。其中，本課題組關(guān)注于外源物誘導(dǎo)肝臟毒性損傷相關(guān)局部先天免疫反應(yīng)及其線粒體調(diào)控機(jī)制，以及經(jīng)由線粒體關(guān)聯(lián)性多細(xì)胞器間的膜接觸，如線粒體關(guān)聯(lián)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間通訊，誘導(dǎo)肝毒性和神經(jīng)系統(tǒng)退行性損傷的分子機(jī)制[21,39]；提示局部細(xì)胞間代謝-免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞器間通訊串話在銅介導(dǎo)肝細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)毒性中的作用值得關(guān)注。另外，本課題組還關(guān)注于PP2A不同B亞基靶向特定靶點(diǎn)蛋白去磷酸化、介導(dǎo)不同外源物誘導(dǎo)RCD依賴性細(xì)胞毒性和抗腫瘤作用的調(diào)控機(jī)制[22,70]。因此，銅暴露-效應(yīng)與PP2A調(diào)控的關(guān)聯(lián)性研究可為銅代謝穩(wěn)態(tài)及其相關(guān)RCD和銅死亡提供新的分子機(jī)制。

目前，已有銅螯合劑和抑制銅吸收的藥物，包括二巰丙醇、青霉胺、曲恩汀、鋅鹽和TTM等，在WD治療中取得較好的效果[16]；ES和DSF等在凋亡抗性、誘導(dǎo)鐵死亡等癌癥敏感性中的作用，提示靶向銅轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以提高腫瘤化學(xué)預(yù)防和抗癌藥物的敏感性[28-29,56]；而且，利用脂?；鞍仔揎椩阢~依賴性細(xì)胞死亡中的獨(dú)特作用，探討基于銅死亡的靶向干預(yù)具有潛在的應(yīng)用前景[3,69]。因此，銅代謝穩(wěn)態(tài)及其介導(dǎo)細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，可成為銅代謝功能失調(diào)相關(guān)危害或疾病的潛在干預(yù)靶點(diǎn)，同時(shí)，可能提供一種新的抗腫瘤方法。

致謝

感謝廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院吳佳燊、杜澤邦、錢波和林忠寧為本文提供的材料。