劉皎皎，李粉萍，楊躍青，何瑾瑜，曹雪艷，薛敬東，葉苗青

作者單位：陜西省中醫(yī)醫(yī)院肝病科，陜西 西安 710003

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，且在我國腫瘤致死原因中位居第二［1-2］。目前臨床常用的抗腫瘤藥物多是以傳統(tǒng)的核酸和蛋白質(zhì)為靶點的細胞毒性藥物，具有選擇性差、毒性作用強、作用機制單一、易產(chǎn)生耐藥性等特點，因此在中藥中尋找毒副作用小、療效顯著的抗腫瘤藥物已然是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點［3-4］。白花蛇舌草屬于茜草科耳草屬植物，全草入藥，研究表明，白花蛇舌草提取物（hedyotis diffusa extract，HDE）對肝癌HepG2 細胞有較好的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用［5］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路與多種腫瘤（如肝癌）發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其家族成員JNK、p38 與細胞分化、凋亡等有關(guān)［6］。然而，有關(guān)HDE 對肝癌細胞JNK/p38MARK通路的影響鮮有報道，因此本研究自2019 年8 月至2020 年4 月通過分析不同濃度HDE對肝癌細胞JNK/p38MARK 通路的影響，探討HDE抗癌的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌QGY 細胞株（購買于中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所）；白花蛇舌草提取物（HDE）（10∶1）購自陜西昊辰生物科技有限公司；全反式維甲 酸（all-transretinoic acid，AT-RA）（ 批 號H20093943，純度99.99%）購自成都恒瑞醫(yī)藥公司，二甲基亞砜（DMSO，批號Q2258）購自美國Sigma 公司，RPMI-1640培養(yǎng)基（批號NBC1255）購自美國Hyclone 公司，10%胎牛血清（批號42G5642）購自美國Gibco 公司，3-2（4，5-二甲基噻唑-2）-2-四甲基偶氮噻唑藍（MTT，批號M5176）購自美國Sigma 公司，胰蛋白酶（批號J1510032）購自廣州Ruka公司生產(chǎn)；鼠抗人增殖細胞核抗原（PCNA）、凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細胞瘤基因-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白基因（Bax）、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3（caspase-3）、p-JNK、p-p38、β 肌動蛋白（β-actin）一抗及羊抗鼠二抗購自賽默飛世爾科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（貨號HUDY03）購自上海碧云天公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本Sanyo 公司，Hochest33258 購自美國Sigma-Aldrich 公司；酶標儀（型號HBS-1096C）、凝膠成像系統(tǒng)（型號Gel Doc1000）購自美國Bio-Rad 公司；光學(xué)顯微鏡（型號WMSC-1037）購自上海無陌光學(xué)廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇肝癌QGY 細胞，培養(yǎng)于含15%滅活胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 g/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，防止細菌污染，培養(yǎng)于37 ℃飽和濕度、5%二氧化碳、20%氧培養(yǎng)箱中，每2～3 天更換一次培養(yǎng)液，無菌操作，待細胞生長良好，且達對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

1.2.2 藥物處理及分組 取“1.2.1”中對數(shù)生長期的肝癌QGY 細胞，以密度為1×104個/孔接種于接種在96孔板中，分為對照組、陽性對照組、低中高HDE組。（1）對照組：RPMI-1640 培養(yǎng)基組；（2）陽性對照組：AT-RA（5μmol/L）；（3）HDE 低、中、高劑量組：分別給予20、40、80 g/L HDE［7］。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 MTT 法檢測HDE 對QGY 細胞增殖能力的影響 取“1.2.2”各組QGY 細胞接種于96 孔板進行培養(yǎng)，每個孔細胞密度為1×104個，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)12、24、48 h 后向各孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄去上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使藍紫色結(jié)晶充分溶解。全自動酶標儀測定570 nm 波長處吸光度A 值。細胞增殖抑制率=［1-藥物組A值/對照組A值］×100%。

1.2.4 Hoechest33258 熒光染色法檢測細胞凋亡形態(tài) 收集“1.2.2”中各組細胞，按照Hoechest33258熒光染色法說明進行操作，置于熒光顯微鏡下觀察48 h時的細胞凋亡形態(tài)并拍照。

1.2.5 流式AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測各組

QGY 細胞凋亡情況 取“1.2.2”中各組細胞，嚴格按照AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒說明書，胰酶消化細胞后生理鹽水洗滌后制成1×109個/升單細胞懸液，取其中100 μL 后加入5 μL AnnexinVFITC 與5μL PI 混合均勻，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀進行檢測培養(yǎng)48 h 各組QGY 細胞凋亡情況，并通過Modfir LT 軟件分析試驗結(jié)果。每組設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測增殖、凋亡及JNK/p38MARK 通路相關(guān)蛋白表達變化 取“1.2.2”各組細胞，每組均設(shè)3個重復(fù)，PBS洗滌2遍，冰上加裂解液，裂解30 min，離心取上清，通過蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定細胞總蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后，添加（1∶500）鼠抗人PCNA、Bcl-2、caspase-3、JNK、p-JNK、p-p38、p38一抗，以β-actin為內(nèi)參，4 ℃過夜后，TBST洗膜3次，添加羊抗鼠二抗（1∶5 000）稀釋液孵育2 h，TBST 洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色后，于凝膠成像儀中觀察蛋白表達并保存圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以± s 表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進行方差齊性檢驗，組間有差異采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDE 對肝癌QGY 細胞增殖的影響 與對照組比較，24 h 時HDE 組、陽性對照組QGY 細胞增殖增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48、72 h時20、40、80 g/L HDE 組、陽性對照組QGY 細胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，80 g/L HDE組QGY細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，20、40、80 g/L HDE組、陽性對照組QGY細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 QGY細胞增殖抑制率變化/（%，±s）

表1 QGY細胞增殖抑制率變化/（%，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與HDE（20 g/L）組比較，P＜0.05。③與HDE（40 g/L）組比較，P＜0.05。④與24 h 比較，P＜0.05。⑤與48 h比較，P＜0.05。

組別對照組陽性對照組HDE組6 20 g/L 40 g/L 80 g/L F值P值重復(fù)次數(shù)66 12 h 12.23±3.10 14.45±3.62 24 h48 h 16.56±3.15④19.27±3.33 60.43±17.09①②③④⑤64.63±17.15①②③④⑤36.56±10.03①④⑤50.59±13.87①②④⑤63.61±16.99①②③⑤12.50 0.000 12.36±3.13 13.15±3.17 13.78±3.33 0.50 0.739 33.37±11.36①④47.57±13.62①②④59.37±16.95①②③④11.48 0.000

2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 對照組QGY 細胞呈淺藍色熒光，顏色分布均勻。經(jīng)不同濃度的HDE 處理后的QGY 細胞72 h 后均呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征，隨著濃度的增加，細胞數(shù)量逐漸減少，呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀態(tài)的凋亡細胞數(shù)增加，細胞核染色質(zhì)聚集，斷裂成塊狀，并伴有明顯的細胞碎片形成。見圖1。

2.3 不同濃度HDE 對肝癌QGY 細胞凋亡率的影響 與對照組（4.65±0.91）%相比，不同濃度HDE 組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），且隨HDE 濃度（20、40、80 g/L）升高細胞凋亡率逐漸升高［（15.83±3.11）%、（17.27±3.25）%、（20.69±4.03）%，P＜0.05］；與陽性對照組（20.73±4.05）%相比，HDE 為80 g/L時，細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 不同濃度HDE 處理對肝癌QGY 細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達影響 與對照組相比，HDE 組PCNA、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），Bax、caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與陽性對照組相比，HDE 為80 g/L 時，PCNA、Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2，表2。

表2 不同濃度HDE處理對肝癌QGY細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達影響/±s

表2 不同濃度HDE處理對肝癌QGY細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達影響/±s

注：PCNA為增殖細胞核抗原，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白基因，caspase-3為半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3，Bcl-2為B淋巴細胞瘤基因-2。①與對照組比較，P＜0.05。②與HDE（20 g/L）組比較，P＜0.05。③與HDE（40 g/L）組比較，P＜0.05。

組別對照組陽性對照組HDE組20 g/L 40 g/L 80 g/L值F P值重復(fù)次數(shù)666 PCNA 1.08±0.23 0.39±0.07①②③Bax 0.19±0.04 0.41±0.08①②③caspase-3 0.22±0.05 0.90±0.15①②③Bcl-2 0.93±0.18 0.21±0.03①②③0.87±0.17①0.59±0.11①②0.23±0.04①②③45.96＜0.001 0.96±0.19①0.85±0.17①②0.46±0.09①②③21.58＜0.001 0.22±0.05①0.28±0.06①②0.39±0.08①②③14.30＜0.001 0.35±0.07①0.55±0.11①②0.89±0.15①②③44.41＜0.001

圖2 不同濃度HDE處理對肝癌QGY細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

2.5 不同濃度HDE處理對JNK/p38MARK通路相關(guān)蛋白表達影響 與對照組相比，HDE 組p-JNK、pp38 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴；與陽性對照組相比，HDE 濃度為80 g/L 時，p-JNK、p-p38 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表3。

表3 不同濃度HDE處理對JNK/p38MARK通路相關(guān)蛋白表達影響

圖3 不同濃度HDE處理對JNK/p38MARK通路相關(guān)蛋白表達影響

3 討論

我國是肝癌高發(fā)國家之一，肝癌死亡率占我國全部惡性腫瘤死亡率的19%左右［8］。肝癌發(fā)病確切分子機制尚不清楚，多認為是多因素（如多基因突變、多條細胞信號傳導(dǎo)通路、腫瘤新生血管生成異常等）、多環(huán)節(jié)過程［9-10］。目前，分子靶向治療肝癌取得了一定成效，但化學(xué)抗腫瘤藥物研發(fā)成本昂貴且有較大的毒副作用［11-12］，因此從天然產(chǎn)物及中草藥中挖掘低毒、高效抗腫瘤藥物意義重大。

白花蛇舌草是茜草科植物，具有清熱解毒、利尿消腫等作用，研究表明其對多種腫瘤細胞株具有誘導(dǎo)凋亡作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)當不同濃度HDE 作用于肝癌細胞株QGY，處12 h 時，細胞增殖抑制率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能此時藥物還未發(fā)生作用，當處理24 h、48 h 時，細胞增殖抑制率隨濃度升高而增高，提示HDE 可抑制肝癌QGY 細胞增殖，且隨HDE 濃度的增加增殖抑制率升高。細胞凋亡是一個錯綜復(fù)雜過程，有較多蛋白、基因參與細胞凋亡啟動及執(zhí)行過程，在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用［14］。本研究通過Hoechest33258 熒光染色法觀察得到，各濃度HDE 處理細胞48 h后均呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征，隨著濃度增加，細胞數(shù)量逐漸減少，呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀態(tài)的凋亡細胞數(shù)增加，細胞核染色質(zhì)聚集，斷裂成塊狀，并伴有明顯的細胞碎片形成。雙染試驗中不同濃度HDE 處理后QGY 細胞凋亡率均顯著升高，且呈濃度依賴性，80 g/L HDE對QGY細胞凋亡率的影響與陽性對照組相當，提示HDE 可誘導(dǎo)HDE 細胞凋亡。PCNA 是一種酸性核蛋白，對調(diào)節(jié)DNA 的復(fù)制意義重大，其與細胞增殖密切相關(guān)，表達水平可在腫瘤癌變組織中顯著上升［15］。Bcl-2 是一種原癌基因，能抑制細胞凋亡［16］。Bax 是Bcl-2 家族中最主要的促進凋亡蛋白［17］。caspase3 是凋亡途徑關(guān)鍵執(zhí)行者［18］。本研究進一步探究顯示，HDE 處理組PCNA、Bcl-2 蛋白表達降低，Bax、caspase-3 蛋白表達升高，且呈劑量依賴性，提示HDE 可抑制肝癌QGY 細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。

MAPK 通路是一種重要的腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通常由JNK、p38 通路和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶等通路組成［19-20］。賈蕾蕾、王愛玲［21］研究結(jié)果顯示，棉子酚可能通過MARK 信號通路中ERK、p38 的激活，緩解再灌注心肌組織氧化應(yīng)激損傷及凋亡損傷。本研究HDE 處理后，p-JNK、p-p38 蛋白表達水平均顯著降低，且隨HDE 濃度的增加而降低，猜測HDE 能顯著抑制JNK、p38 蛋白磷酸化，抑制JNK、p38 信號通路激活，進而發(fā)揮抑制QGY 細胞細胞增殖、促進QGY細胞細胞凋亡的抗腫瘤作用。

綜上所述，HDE能抑制人肝癌細胞株QGY細胞增殖，促進QGY 細胞凋亡，可能是通抑制JNK、p38MAPK 信號通路活化實現(xiàn)的。但本研究也存在一定不足，肝癌是多途徑過程，抑制MAPK通路激活可能僅為其中一條途徑，對HDE 抑制QGY 細胞增殖，促進凋亡的潛在機制尚有待進一步探索。

（本文圖1見插圖8-1）