舒 驍 田海梅 張 偉 王 玲 和 龍

順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥，其抑制腫瘤的主要作用機(jī)制是通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞的DNA 復(fù)制而發(fā)揮作用[1-2]，是廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤治療中的重要抗腫瘤藥物，與多種抗腫瘤藥物有協(xié)同作用，且無(wú)交叉耐藥性。順鉑是周期性特異性藥物，注射后廣泛分布于肝、腎、前列腺、膀胱、卵巢，亦可到達(dá)胸、腹腔，極少通過(guò)血腦屏障。順鉑的藥動(dòng)學(xué)在人體內(nèi)符合二室模型，消除半衰期58～73 h，主要通過(guò)腎臟排泄。自從1978年順鉑被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于腫瘤化療以來(lái)[3]，因其具有療效確切、抗瘤譜廣、抗癌活性高等特點(diǎn)，作為基礎(chǔ)藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。順鉑具有許多其他藥物無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)，對(duì)睪丸癌的治愈率已超過(guò)95%[4]，對(duì)肺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤等有肯定的療效[5-10]，尤其是在非小細(xì)胞肺癌的藥物治療中作為基礎(chǔ)藥物被廣泛應(yīng)用[11-12]。

順鉑的劑型包括速溶干粉劑、水針劑、混懸劑、軟膏、栓劑、植入劑、順鉑微囊、順鉑脂質(zhì)體等[13]，臨床供靜脈使用的順鉑制劑多為凍干粉針劑和水針劑。目前，國(guó)內(nèi)外多家制藥企業(yè)生產(chǎn)的順鉑制劑獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于腫瘤治療，由于在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)生產(chǎn)的順鉑制劑不良反應(yīng)差異較大，但全球未見(jiàn)不同企業(yè)生產(chǎn)的順鉑制劑是否會(huì)對(duì)療效具有影響的研究，本研究針對(duì)不同制藥企業(yè)生產(chǎn)的順鉑注射制劑進(jìn)行了體外細(xì)胞毒作用的實(shí)驗(yàn)觀察和比較，可為進(jìn)一步研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器熒光檢測(cè)儀，北京濱松光子技術(shù)有限公司，BHP9504。二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司，F(xiàn)orma 3111。

1.1.2 試劑盒ATP 生物熒光藥物敏感性檢測(cè)試劑盒，北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。96 孔培養(yǎng)板，Costar 產(chǎn)品。

1.1.3 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞Bel7402，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所生物檢測(cè)中心提供。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)藥4 種不同來(lái)源順鉑制劑見(jiàn)表1。

表1 順鉑制劑來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥的處理1）注射液：直接使用。2）凍干型：用0.9%氯化鈉注射液溶解，終濃度均為1 mg/ml，55 ℃水浴使其完全溶解。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將處理好的試驗(yàn)藥分別稀釋成2.500、1.250、0.625、0.313、0.156 和0.078 μg/ml等6 個(gè)濃度，并將此溶液分別加入96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl，每個(gè)濃度設(shè)定3 個(gè)平行孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分散成單細(xì)胞后計(jì)數(shù)。向含藥孔中加入各種細(xì)胞，每孔接種3 500 個(gè)細(xì)胞。37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)72 h。同時(shí)設(shè)立無(wú)藥對(duì)照孔和ATP 生產(chǎn)抑制孔。

1.2.3 測(cè)定向96 孔培養(yǎng)板中每孔加入ATP 提取液50 μl，室溫下放置5 min。取每孔ATP 提取液50 μl，加入到測(cè)定白板中，向每孔加入50 μl 熒光酶/熒光素測(cè)定液，混勻后于熒光測(cè)定儀上測(cè)定吸收值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析1）半數(shù)抑制濃度：用SPSS 11.5 for Windows PSS 統(tǒng)計(jì)軟件中probit 法計(jì)算。2）檢驗(yàn)方法：SPSS 11.5 for Windows 中Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 半數(shù)抑制濃度

4 種藥品對(duì)人Bel7402 肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同藥品對(duì)人Bel7402 肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(μg/ml)

2.2 數(shù)據(jù)分析

由表3和表4可知：4 種藥物對(duì)該瘤株抑制作用效果的平均秩分別為2.00、6.00、7.00、11.00；K-W統(tǒng)計(jì)量為9.462，概率P值為0.024。若取顯著性水平α=0.05，則由于概率P值小于顯著性水平α，應(yīng)拒絕原假設(shè)，認(rèn)為4 種藥物作用效果存在顯著性差異。

表3 幾種實(shí)驗(yàn)藥對(duì)某種疾病的秩和（Kruskal-Wallis） 檢驗(yàn)結(jié)果（1）

表4 幾種實(shí)驗(yàn)藥對(duì)某種疾病的秩和（Kruskal-Wallis） 檢驗(yàn)結(jié)果（2）

2.3 兩兩比較

表5用方差分析法得出假設(shè)檢驗(yàn)的結(jié)果，由group 一欄的數(shù)據(jù)可知，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為秩后的F統(tǒng)計(jì)量為16.4，P=0.001。當(dāng)顯著性水平取0.05 時(shí)，則拒絕H0，這與用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)的結(jié)果一致，即認(rèn)為不同藥物對(duì)該疾病作用效果不同。

表5 經(jīng)秩變變換后的方差分析結(jié)果

表6經(jīng)SNK 法（兩兩比較）分析得出的結(jié)果，由表中的數(shù)據(jù)可以看出，藥物B 和藥物C 作用效果的差異不大（0.461＞0.05），該4 種藥物的作用效果分屬于不同的層次，其中藥物D（日本化藥）與其他3 種藥物的作用效果不同，效果最好。

表6 不同藥物對(duì)某種瘤株作用效果的多重比較

3 討論

在4 種不同來(lái)源順鉑注射制劑中，4 種藥物的作用效果分屬于不同的層次，B 和C 的作用效果差異不大，A 種順鉑的體外抑瘤效果最弱，D 種順鉑對(duì)人Bel7402 肝癌細(xì)胞體外抑瘤作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)的順鉑在抑瘤作用上有顯著性差異。由于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果僅為體外研究，不同來(lái)源的順鉑制劑在體內(nèi)的抑瘤作用和藥效學(xué)研究尚需隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。我國(guó)是典型的仿制藥大國(guó)，并不是仿制藥強(qiáng)國(guó)，藥品的質(zhì)量和療效與國(guó)人的健康密切相關(guān)。仿制藥一致性評(píng)價(jià)工作可使仿制藥在質(zhì)量和療效方面與原研藥品一致，在臨床中實(shí)現(xiàn)替代原研藥品，不僅節(jié)約了醫(yī)療費(fèi)用，同時(shí)也提高了仿制藥在我國(guó)的質(zhì)量和醫(yī)藥行業(yè)的整體發(fā)展水平，同時(shí)可確保公眾用藥的安全性和有效性。我國(guó)仿制藥品種數(shù)量繁多，但相應(yīng)一致性評(píng)價(jià)工作卻很不完善，本研究結(jié)果就充分暴露了個(gè)別藥品的質(zhì)量差異，值得引起業(yè)界關(guān)注。

順鉑的化學(xué)結(jié)構(gòu)是簡(jiǎn)單的平面四方形，以二價(jià)鉑為中心，兩個(gè)氨基為配體，同時(shí)連接兩個(gè)氯作為離去基團(tuán)。順鉑的活性主要取決于氯離子的濃度[14]，不同價(jià)態(tài)配位數(shù)的鉑衍生物與其抗腫瘤活性及毒性的強(qiáng)弱密切相關(guān)[15]。順鉑的臨床作用發(fā)揮有賴于有效的劑量濃度和生物學(xué)活性。本研究中4 種不同來(lái)源的順鉑是來(lái)自市售企業(yè)生產(chǎn)的合格產(chǎn)品，在臨床上較常見(jiàn)。按照現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》（ChP2020）、《歐洲藥典》（EP9.0）、《美國(guó)藥典》（USP40）和《日本藥典》（JP17），順鉑注射制劑含量測(cè)定均采用高效液相色譜法（HPLC）[16-19]，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)比較一致，說(shuō)明不同企業(yè)生產(chǎn)的順鉑制劑在含量上差異不大，但本研究發(fā)現(xiàn)在體外抑瘤作用存在顯著差異，筆者分析，也正因?yàn)橛羞@種現(xiàn)象的存在，所以國(guó)家必須要對(duì)注射劑進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)。長(zhǎng)期以來(lái)，注射劑型一直在國(guó)內(nèi)腫瘤化療藥市場(chǎng)占據(jù)著主導(dǎo)地位[20]，注射劑的一致性評(píng)價(jià)是對(duì)我國(guó)仿制藥的一次重新洗牌，將全面提升我國(guó)仿制藥的質(zhì)量，保證與原研產(chǎn)品質(zhì)量和療效的一致。注射劑一致性評(píng)價(jià)的技術(shù)要求已逐漸與國(guó)際要求接軌，將對(duì)我國(guó)注射劑的研發(fā)和生產(chǎn)提出更高的要求，以充分保障藥品的安全、有效和質(zhì)量可控。仿制藥的一致性評(píng)價(jià)工作對(duì)中國(guó)醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的影響，通過(guò)一致性評(píng)價(jià)的產(chǎn)品必將在未來(lái)醫(yī)藥市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中發(fā)揮積極作用。在國(guó)家政策的大力支持下，大型企業(yè)紛紛轉(zhuǎn)型升級(jí)。仿制藥是一種巨大的社會(huì)公共財(cái)富，與原研藥相比價(jià)格較低，能夠提升醫(yī)療服務(wù)水平，降低醫(yī)療支出，維護(hù)公眾的健康，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。我國(guó)仿制藥起步雖晚，但是發(fā)展迅速，目前已成為世界上最大的仿制藥生產(chǎn)國(guó)。由于我國(guó)早期批準(zhǔn)上市的仿制藥沒(méi)有強(qiáng)制要求與原研藥進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)，有些藥品在療效上與原研藥存在差距，在此背景下，我國(guó)提出了仿制藥一致性評(píng)價(jià)工作要求，隨著注射劑仿制藥一致性評(píng)價(jià)工作有序推進(jìn)，國(guó)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)仿制藥在滿足我國(guó)人民群眾基本醫(yī)療保障的同時(shí)也會(huì)帶動(dòng)中國(guó)逐步從制藥大國(guó)走向制藥強(qiáng)國(guó)[21]。

本研究在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的順鉑在抑瘤作用上有顯著性差異，但在體內(nèi)試驗(yàn)中是否也會(huì)出現(xiàn)同樣的結(jié)果，有待于相關(guān)臨床專家開(kāi)展隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)逐步驗(yàn)證。