尚萬兵，吳文斌

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 a.法學(xué)院；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

胰腺癌是臨床常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤類型之一，其發(fā)病率和死亡率相當(dāng)，預(yù)后差，患者5 a總生存率為5%，接受根除術(shù)治療后患者的5 a生存率也低于20%，若不接受臨床治療，患者的生存期約4個月[1-2]。近年來，隨著臨床治療手段的不斷完善，胰腺癌的治療方案(尤其是手術(shù)治療)取得了較大突破，但胰腺癌患者的預(yù)后仍不理想[3]。神經(jīng)浸潤是指腫瘤細(xì)胞在相關(guān)分子生物學(xué)機制下侵犯神經(jīng)的現(xiàn)象[4-5]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰腺癌、直腸癌、胃癌等都存在神經(jīng)浸潤現(xiàn)象[6-8]，同時也是胰腺癌預(yù)后差的主要原因之一。胰腺癌發(fā)生神經(jīng)浸潤概率可高達(dá)80%，但胰腺癌神經(jīng)浸潤的分子機制目前仍未完全闡明。干細(xì)胞生長因子(stem cell growth factors，SCF)是一種多效性細(xì)胞因子，可通過與c-kit受體(酪氨酸激酶受體)結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)黏附以及調(diào)節(jié)因子分泌，可參與多種生理過程[9-10]。前期研究發(fā)現(xiàn)SCF因子在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，但其與胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的關(guān)系目前尚不清楚。本研究通過構(gòu)建SCF過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞系以分析SCF對胰腺癌細(xì)胞生長、遷移及神經(jīng)浸潤的影響。

1 一般資料

1.1 實驗材料和儀器裸鼠(6～8周)購自上海斯萊克生物有限公司；人胰腺癌PANC-1、AsPC-1和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6-C7購自美國ATCC公司；SCF慢病毒由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建、生產(chǎn)并濃縮；總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國QIAGEN公司；2×SYBR Green qPCR Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司；兔抗人SCF兔多克隆抗體購自美國Abcam公司；β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司；熒光顯微鏡和光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 SCF過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建將指數(shù)生長期的胰腺癌PANC-1細(xì)胞、AsPC-1細(xì)胞置于2.5 g·L-1胰酶中消化，接種細(xì)胞至6孔板(10 000個/孔)，細(xì)胞貼壁后，將PANC-1細(xì)胞分為對照組1和過表達(dá)組1，AsPC-1細(xì)胞分為對照組2和過表達(dá)組2，并分別向培養(yǎng)液中加入100 μL病毒溶液、SCF過表達(dá)病毒溶液，感染48 h，結(jié)束后嘌呤霉素處理，殺死未感染的細(xì)胞，存活的細(xì)胞即為穩(wěn)定細(xì)胞系，采用熒光定量PCR和免疫印跡試驗(Western blot)鑒定細(xì)胞中SCFmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.3 熒光定量PCR分析SCFmRNA表達(dá)各組細(xì)胞系和HPDE6-C7細(xì)胞生長至指數(shù)生長期，收集細(xì)胞1×106個/每個樣，離心細(xì)胞棄上清，細(xì)胞沉淀采用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，測定濃度備用。根據(jù)SCF基因序列設(shè)計如下引物：SCF-F為5’- AGGCAAGGTT TTCTACAGCATCAC-3’；SCF-R為5’-TAGTCTTTTGGAAGATTTGCC-3’。將合成的引物濃度稀釋為10 μmol·L-1，并對其特異性進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR Green Mix 10 μL、SCF-F/R各0.6 μL、cDNA 8.8 μL。將上述所配混合物加入熒光定量PCR板，上熒光定量PCR儀檢測，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，循環(huán)數(shù)40個，PCR結(jié)束后建立溶解曲線，并在儀器上直接讀數(shù)，分析兩組mRNA水平。

1.4 Western blot分析SCF的表達(dá)水平提取各組細(xì)胞系和HPDE6-C7細(xì)胞離心后細(xì)胞沉淀總蛋白，100 g·L-1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h，50 g·L-1的脫脂奶粉稀釋兔抗人SCF抗體(1∶500)在4 ℃孵育12 h，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 500)室溫孵育1 h，PBS洗滌3次后，增強型化學(xué)發(fā)光液處理，收集影像，觀察蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 MTT測定胰腺癌細(xì)胞的增殖能力將對照組1和過表達(dá)組1、對照組2和過表達(dá)組2細(xì)胞系培養(yǎng)至指數(shù)生長期，用2.5 g·L-1胰酶消化后，細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個·mL-1，接種100 μL細(xì)胞懸液于96孔板，預(yù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞貼壁，分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h時，吸干培養(yǎng)液，每孔加入100 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀測定在572 nm的吸光值，繪制增殖曲線。

1.6 Transwell分析胰腺癌細(xì)胞侵襲能力用50 mg·L-1Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干，吸出培養(yǎng)板中殘余液體，備用。將對照組1和過表達(dá)組1、對照組2和過表達(dá)組2細(xì)胞系培養(yǎng)至指數(shù)生長期，用2.5 g·L-1胰酶消化后，細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個·mL-1，取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)12～48 h，體積分?jǐn)?shù)為40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察單個視野細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.7 神經(jīng)浸潤小鼠模型的構(gòu)建24只6～8周齡去胸腺裸鼠分為對照組和過表達(dá)組，采用異氟烷麻醉，暴露出其左側(cè)坐骨神經(jīng)，分離肱二頭肌，采用顯微注射的方法分別將SCF過表達(dá)胰腺癌PANC-1細(xì)胞系、對照細(xì)胞系注入過表達(dá)組、對照組裸鼠坐骨神經(jīng)的神經(jīng)束膜，每只細(xì)胞水平為1×105個，體積為10 μL，建立坐骨神經(jīng)浸潤模型。注射后6周處死小鼠，免疫組化分析神經(jīng)浸潤情況。

1.8 免疫組化分析神經(jīng)浸潤情況小鼠在建模6周后，麻醉處死小鼠，切取坐骨神經(jīng)和腫瘤組織石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟3次，每次10 min，依次放入梯度無水乙醇中水化，按試劑盒說明步驟進(jìn)行NF-200免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1 SCF穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建情況分析結(jié)果如圖1所示，對照組1胰腺癌細(xì)胞系SCFmRNA表達(dá)(0.98±0.16)、蛋白表達(dá)(0.41±0.09)均低于過表達(dá)組1(4.32±0.78、2.18±0.37)(P<0.05)；對照組2胰腺癌細(xì)胞系SCFmRNA表達(dá)(1.01±0.12)、蛋白表達(dá)(0.48±0.10)均低于過表達(dá)組2(4.85±0.51、2.58±0.31)(P<0.05)；正常胰腺細(xì)胞中SCFmRNA表達(dá)(0.36±0.08)、蛋白表達(dá)(0.15±0.05)均低于對照組1、對照組2(P<0.05)。

A為熒光定量PCR電泳結(jié)果；B為SCF mRNA表達(dá)；C為SCF蛋白表達(dá)條帶；D為SCF蛋白表達(dá)；與對照組1比較，*P<0.05；與對照組2比較，#P<0.05。

2.2 SCF對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如圖2所示，與對照組1比較，過表達(dá)組1各個不同時間點的增殖能力增加(P=0.011)；與對照組2比較，過表達(dá)組2各個不同時間點的增殖能力增加(P=0.007)。

與對照組1比較，*P<0.05；與對照組2比較，#P<0.05。

2.3 SCF對胰腺癌侵襲能力影響結(jié)果如圖3所示，過表達(dá)組1細(xì)胞侵襲數(shù)目(85.41±12.19)高于對照組1(28.90±4.99)(P=0.001)，過表達(dá)組2細(xì)胞侵襲數(shù)目(93.28±10.95)高于對照組2(34.11±6.51)(P=0.001)。

A為結(jié)晶紫染色(100×)；B為細(xì)胞侵襲數(shù)目；與對照組1比較，*P<0.05；與對照組2比較，#P<0.05。

2.4 SCF對胰腺癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤能力的影響結(jié)果如圖4所示，在建立胰腺癌模型后6周，對照組12只小鼠4只出現(xiàn)了坐骨神經(jīng)功能障礙(33.33%)，過表達(dá)組12只小鼠10只出現(xiàn)了坐骨神經(jīng)障礙(83.33%)，其中4只完全癱瘓，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.171，P=0.013)；免疫組化結(jié)果顯示NF-200陽性表達(dá)升高。

圖4 SCF對胰腺癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤能力的影響

3 討論

胰腺癌是起源于胰腺導(dǎo)管上皮、腺泡細(xì)胞的臨床上常見消化道難治性腫瘤，其發(fā)病具有隱匿特點，早期診斷較為困難，且該疾病進(jìn)展迅速，導(dǎo)致胰腺癌患者的生存時間短，預(yù)后較差[11]。因此，胰腺癌也是病死率最高的腫瘤類型之一，位居全球前十位。胰腺癌的發(fā)病病因尚未完全闡明，目前普遍認(rèn)為其發(fā)病與多種因素有關(guān)，例如癌前病變、基因異常和遺傳等因素，同時不良的飲食習(xí)慣、肥胖、長期吸煙和胰腺慢性損傷是誘發(fā)胰腺癌發(fā)病的重要影響因素[12]。胰腺癌的發(fā)病、進(jìn)展機制是目前科學(xué)研究者和臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點和難點。

SCF定位于人12號染色體q22～q24區(qū)域，編碼248個氨基酸。SCF通過與其受體c-Kit結(jié)合，可激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，從而調(diào)節(jié)一些重要的基因轉(zhuǎn)錄[13]。目前已有研究顯示，C-KIT基因表達(dá)異?？纱碳つ[瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號的失控，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖，目前已經(jīng)在胃腸道間質(zhì)瘤、白血病、肺癌、結(jié)腸癌以及胰腺癌中觀察到C-KIT基因的異常表達(dá)[14-17]。本課題的前期研究表明，SCF在胰腺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其主要可能通過c-kit激活，誘導(dǎo)胰腺癌的惡化。Kuai等[18]研究顯示，SCF參與胃癌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)過程，本研究為進(jìn)一步探討SCF在胰腺癌中可能發(fā)揮的作用，體外構(gòu)建SCF穩(wěn)定過表達(dá)胰腺癌PANC-1細(xì)胞系和AsPC-1細(xì)胞系，并通過基因表達(dá)、蛋白表達(dá)實驗驗證穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功，同時還發(fā)現(xiàn)正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6-C7中SCFmRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)均低于胰腺癌細(xì)胞。胰腺癌病情進(jìn)展迅速、患者預(yù)后差與惡性腫瘤細(xì)胞不受限的細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵染能力強等因素有密切關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)SCF過表達(dá)PANC-1、AsPC-1細(xì)胞系的增殖活性較其陰性對照細(xì)胞系呈現(xiàn)出增長趨勢，說明SCF過表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖活力，也間接說明SCF在胰腺癌細(xì)胞增殖過程中扮演著重要的角色。

胰腺癌難治的原因眾多，其中包括癌細(xì)胞增殖迅速、容易轉(zhuǎn)移等。目前，普遍認(rèn)為神經(jīng)浸潤是惡性腫瘤細(xì)胞沿著神經(jīng)生長，或者是在神經(jīng)鞘的內(nèi)膜、神經(jīng)束膜、神經(jīng)外膜的層面有腫瘤細(xì)胞的現(xiàn)象，是導(dǎo)致胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、難治和病死率高的主要原因。目前對于神經(jīng)浸潤的機制存在不同的觀點，這些觀點包括低阻力通道學(xué)說、癌細(xì)胞神經(jīng)相互作用學(xué)說以及神經(jīng)重塑和再生學(xué)說，雖然上述各種學(xué)說在一定程度上解釋神經(jīng)浸潤特點，但還是無法完全闡明胰腺癌神經(jīng)高發(fā)的主要機制。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力能夠反映細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤的特性，本研究發(fā)現(xiàn)SCF過表達(dá)PANC-1、AsPC-1細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲數(shù)目高于其陰性對照細(xì)胞系，有研究發(fā)現(xiàn)SCF對間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用[19]，還有研究表明c-Kit與SCF結(jié)合可提高上皮性的卵巢癌中干細(xì)胞存活率[20]，本研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相似趨勢，說明SCF過表達(dá)可以增強胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力，同時也提示SCF可能參與胰腺癌腫瘤的神經(jīng)浸潤。為證實這一假設(shè)，本研究構(gòu)建坐骨神經(jīng)浸潤模型，并將SCF過表達(dá)細(xì)胞系和對照細(xì)胞系注射進(jìn)入坐骨神經(jīng)周圍，發(fā)現(xiàn)SCF過表達(dá)組裸鼠坐骨神經(jīng)障礙發(fā)生率為83.33%，陰性對照組裸鼠坐骨神經(jīng)障礙發(fā)生率為33.33%，兩組裸鼠坐骨神經(jīng)障礙發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時免疫組化結(jié)果顯示SCF過表達(dá)組裸鼠NF-200陽性表達(dá)升高，陰性對照組裸鼠的NF-200陽性表達(dá)很低，說明SCF過表達(dá)可以增強胰腺癌的神經(jīng)浸潤能力，并在胰腺癌神經(jīng)浸潤過程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，SCF表達(dá)升高可以增強胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)胰腺癌神經(jīng)浸潤的發(fā)生，但其中SCF是通過何種作用機制促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲以及神經(jīng)浸潤情況，還需從生物學(xué)分子層面開展研究。