程剛 鄭金紅 李國臣 劉陽 張華妮 曹賢達 殷莉

隨著人口老齡化的趨勢及快節(jié)奏生活方式的改變,諸如精神分裂癥、抑郁癥、阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢,嚴重威脅著人們生命健康和生活質(zhì)量,已成為醫(yī)藥領(lǐng)域及社會各界都高度關(guān)注的焦點。但血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)功能性濾過機制使得幾乎全部大分子和98%的小分子物質(zhì)難以從血液進入腦組織［1］。BBB的這種低通透性是藥物滲透進入CNS的主要限速因素［2］,給CNS疾病的治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。由于傳統(tǒng)動物模型種屬差異與影響因素的多重性(如實時藥物穩(wěn)態(tài)的血藥濃度、給藥途徑、劑型、劑量、藥物在腦內(nèi)代謝情況及與血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)等),導致各藥物穿透BBB的參數(shù)差異很大,無法實現(xiàn)真實模擬人體BBB的目的。所以,研究人員亟需建立能準確預(yù)測和評價藥物在體內(nèi)穿透BBB能力的高仿真體外模型,以此為載體促進CNS藥物的篩查。本文對BBB的生理結(jié)構(gòu)及功能、體外細胞模型的構(gòu)建以及藥物BBB通透性評價方法等方面的研究進展進行闡述,以期能為后續(xù)穿透BBB的靶向制劑開發(fā)提供參考。

1 BBB的生理學基礎(chǔ)

BBB的相關(guān)研究已有近百年歷史,得益于現(xiàn)代生物膜理論與神經(jīng)生理學科的迅速發(fā)展,極大加深了人們對這一機能現(xiàn)象的再認識。BBB系一層介于外周血液與腦、脊髓神經(jīng)元細胞之間的動態(tài)界面,其低通透性、高選擇性阻礙能力對維護CNS的穩(wěn)態(tài)至為關(guān)鍵。BBB主要結(jié)構(gòu)可分為三部分：最內(nèi)層為腦毛細血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)及其之間的緊密連接(tight junction,TJ)；中間層為基膜(basement membrane,BM)和周細胞(Pericyte)；外層為星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte)和細胞外基質(zhì)。解剖生理結(jié)構(gòu)見圖1［3］,其各主要結(jié)構(gòu)的功能特點見表1。

表1 BBB主要結(jié)構(gòu)的功能特點

圖1 BBB解剖生理圖

BBB的屏障效應(yīng)除了受其機械結(jié)構(gòu)和物理電荷的影響也與功能方面息息相關(guān)。在BBB上與毛細血管結(jié)合的高活性神經(jīng)肽降解酶(胺肽酶、內(nèi)肽酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等)組成的“酶化屏障”可進一步限制特異性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。如治療CNS疾病的藥物常因其代謝基團與神經(jīng)肽耦聯(lián)時,受到“酶化屏障”的干擾使得不穩(wěn)定而影響療效。此外,BBB還存在著“免疫屏障”,即BMECs上大量與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的內(nèi)源性受體及轉(zhuǎn)運系統(tǒng)［7］,如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、胰島素受體、P-糖蛋白(P-gp,又稱MDR逆轉(zhuǎn)劑)［9］及多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)等。這些轉(zhuǎn)運受體通過吸收周圍循環(huán)系統(tǒng)中的營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、己糖、維生素、膽堿、低密度脂蛋白、神經(jīng)肽及核酸等)并克隆出對應(yīng)的特異性抗體,若在主動腦靶向遞藥系統(tǒng)中能利用該克隆抗體作為藥物前體,將對CNS新藥研發(fā)大有裨益。另外,小膠質(zhì)細胞(Microglia)和Astrocyte分別充當腦內(nèi)巨噬細胞與抗原遞呈細胞參與免疫反應(yīng)［10］。

2 BBB體外模型的建立

2.1 單層BMECs模型 建立單層內(nèi)皮細胞模型的核心在于腦微血管的分離和獲取的BMECs純性。常采取機械分散或膠原酶消化及密度梯度離心法將腦微血管與其他雜質(zhì)細胞(如周皮細胞、成纖維細胞等)分離,降低污染程度。一般多使用牛腦微血管內(nèi)皮細胞(BBMVEC)和豬腦微血管內(nèi)皮細胞(PBMVEC)進行原代培養(yǎng),但這些大型動物細胞因為取材難度較大也會用大鼠腦內(nèi)皮細胞替代培養(yǎng)。盡管各研究者培養(yǎng)的單層BMECs模型在相差顯微鏡下存在部分形態(tài)學差別,但在超微結(jié)構(gòu)與細胞特征性抗原表達上仍表現(xiàn)出較好的一致性,保持了BBB典型的轉(zhuǎn)運蛋白和酶的表達。如可對體內(nèi)激素和生理刺激產(chǎn)生反應(yīng),保證血管的完整性和張力；表達外周血管內(nèi)皮細胞膜標志物Ⅷ因子相關(guān)抗原(vWF)；與植物血凝素特異性結(jié)合,吸收低密度脂蛋白等［11］。而由于單層細胞模型的分離、培養(yǎng)方法較繁瑣、純化不夠以及離體培養(yǎng)的BMECs忽略了真實在體BBB微環(huán)境,通常表現(xiàn)出緊密連接的通透性增高、低至中等的跨膜電阻值(TEER)、特異性酶和功能性蛋白表達減弱等特征。這種重要特性喪失的“表型漂移”(Phenotypic drift)現(xiàn)象隨細胞培養(yǎng)的傳代而加重,往往因缺失關(guān)鍵的BBB結(jié)構(gòu)蛋白表達,不能充分發(fā)揮其屏障功能［12］,因此單獨用內(nèi)皮細胞構(gòu)建BBB模型有其自身的局限性。

2.2 BMECs與Astrocyte共培養(yǎng)模型 實踐證明將BEMCs與Astrocyte共培養(yǎng)可以克服單層細胞模型中的“表型漂移”,保留住BBB完整特性來更好地模擬BEMCs的微環(huán)境。該模型借助Transwell系統(tǒng)將BEMCs接種在上室,Astrocyte接種在微孔膜下方或小室底壁,多室微孔膜(0.4 μm)使得兩種細胞彼此間隙2～3 nm,既能透過各種小分子及生長因子相互作用而又阻止細胞直接接觸［13］。不過Astrocyte誘導BEMCs增強屏障特性的機制尚未完全闡明,學界普遍認為可能與其分泌的活性細胞因子有關(guān),如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)誘導細胞極性的產(chǎn)生使胞間緊密連接更嚴實［14］。在實踐中多以BEMCs同種屬和原代培養(yǎng)的Astrocyte共培養(yǎng)的表現(xiàn)型最為接近在體狀態(tài)［15］,形成的轉(zhuǎn)運體和酶的表達更具活性。陳雪等［16］使用大鼠原代BEMCs和Astrocyte在Transwell小室中建立共培養(yǎng)BBB模型,用免疫熒光檢測各細胞特征標記物并觀察跨內(nèi)皮細胞電阻TEER的動態(tài)變化。研究顯示：共培養(yǎng)生長后的原代BEMCs具有典型的梭形“鋪路石”樣形態(tài),內(nèi)皮細胞間形成緊密連接,而Astrocyte則表現(xiàn)出多個突起的典型外觀；免疫組化鑒定BEMCs和Astrocyte分別表達vWF抗原與神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP),且細胞純度均達到95%以上；共培養(yǎng)BBB模型的TEER為(65±1.42)Ω·cm2較單獨BEMCs培養(yǎng)模型顯著升高,以上表明通過共培養(yǎng)融合使模型結(jié)構(gòu)更具真實模擬在體BBB特性的能力。於曉東等［17］利用小鼠BEMCs和Astrocyte建立共培養(yǎng)BBB模型,進一步研究來源于非小細胞肺癌A549細胞的外泌體對其功能的影響。分別于共培養(yǎng)24、48、72 h后進行TEER檢測及48 h辣根過氧化物酶滲透試驗,結(jié)果顯示共培養(yǎng)48 h及72 h后接種外泌體實驗組TEER較對照組明顯降低(P＜0.01),表明人非小細胞肺癌細胞外泌體可使BBB通透性增加。

2.3 三維BBB模型 為了最大限度地模擬在體BBB微環(huán)境,目前,有研究者［18,19］構(gòu)建出BMECs-周細胞-Astrocyte或神經(jīng)元等在同一Transwell中培養(yǎng)出三維BBB模型,充分發(fā)揮細胞間的相互作用。三維培養(yǎng)模型中一些BBB大分子標記物(如Claudin-1、Claudin-3、Claudin-5、Claudin-12、ZO-1及ZO-2)在mRNA水平和蛋白水平表達量均不同程度上調(diào),同時跨膜電阻明顯增強,滲透率降低,結(jié)構(gòu)與體內(nèi)環(huán)境最相似［20］,具有較高的研究價值。曲園［8］將人體原代BMECs-周細胞-Astrocyte在低粘附瓊脂糖凝膠培養(yǎng)板內(nèi)建立新一代3D-BBB體外模型,分別采用細胞示蹤技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù),對模型內(nèi)細胞分布及模型表面具有的功能蛋白(如緊密連接和P-gp等)進行鑒定,證實該模型內(nèi)細胞排列及表征與人體內(nèi)BBB結(jié)構(gòu)高度擬合,特異性蛋白表達量遠高于傳統(tǒng)模型。

2.4 動態(tài)BBB模型 隨著研究表明,血流剪切力會對BEMCs的分化和信號轉(zhuǎn)導會產(chǎn)生影響,從而改變其屏障能力。近年來出現(xiàn)的微流控芯片BBB模型發(fā)展十分迅速,在體內(nèi)BEMCs與膠質(zhì)細胞的相互作用暴露于血流的剪切作用力之下,將生化信息和幾何性綜合起來,更好地模擬體內(nèi)組織的動態(tài),并可實時監(jiān)控分子轉(zhuǎn)運遷移［21］。微流體BBB代表最現(xiàn)實的體外系統(tǒng)來研究血流動力學變化和誘導炎癥是如何影響大腦微血管的完整性。通過引入改性后具有較大透孔的中空纖維,既能克服模型不允許免疫細胞的跨內(nèi)皮遷移的問題,而不損害系統(tǒng)的模仿阻隔性的能力。實踐中可通過對血流進行干擾等方式降低切應(yīng)力模擬BBB損害狀態(tài),可以極大地促進內(nèi)皮細胞-白細胞相互作用(釋放活性氧和細胞因子)及各種導致免疫細胞外滲進入腦基質(zhì)的研究。微流體BBB可廣泛應(yīng)用于各種CNS疾病的分子病理學研究如腦缺血再灌注損傷和癲癇等改變。Cucullo等［22］利用中空纖維技術(shù)設(shè)計出具有體外BBB人性化動態(tài)的毛細管系統(tǒng)(DIV-BBB),即在三維流動環(huán)境中使BEMCs與Astrocyte共同培養(yǎng)發(fā)育,形成一個功能性BBB。1周后,通過對14C-蔗糖、TEER及乳酸生產(chǎn)/葡萄糖消耗率等通透性功能測定,證明了此模型良好的再現(xiàn)了一個體內(nèi)有氧代謝模式下的生理環(huán)境。

2.5 永生型細胞株模型 鑒于原代BEMCs的分離、純化技術(shù)繁瑣且難以定期獲取等不足,而永生型細胞株表型比較穩(wěn)定、易傳代和大量增殖的特點恰是復(fù)制BBB體外模型理想的材料。目前開發(fā)最普遍的永生細胞系有hCMEC/D3、大鼠RBE4、小鼠bEnd.3等,而尤以大鼠腦內(nèi)皮細胞系RBE4建立的模型最具代表性。雖永生細胞有望克服不同轉(zhuǎn)運子的底物和抑制劑的重復(fù)交叉影響［23］,但RBE4往往不能形成緊密連接結(jié)構(gòu),不具備限制小分子通透的性能,導致該模型不適用于滲透性的研究［24］。hCMEC/D3細胞系則會表達具有連接性的結(jié)構(gòu)蛋白,主要作用于BBB物質(zhì)轉(zhuǎn)運機制的研究。另外,人多能干細胞(human placental stem cells,hPSC)可通過誘導分化提供可再生、可持續(xù)的腦內(nèi)皮細胞,很好地復(fù)制出相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白和屏障性能［25］,在干細胞治療腦系疾病研究中前景深遠。

3 藥物BBB通透性評價方法

3.1 體內(nèi)評價 藥物BBB通透性的體內(nèi)評價主要指測定腦血比lg(Cbr/Cbl),即計算穩(wěn)態(tài)下的藥物透過BBB的量與血液中的化合物濃度的比值,常有腦組織勻漿法、微透析法等技術(shù)方法［26］。原梅等［27］建立大鼠穩(wěn)態(tài)腦分布模型后,LC-MS/MS定量分析安替比林、阿替洛爾和ZZB系列新藥候選化合物的血漿和腦組織藥物濃度,測出安替比林、阿替洛爾的腦血比KP值與Caco-2細胞跨膜表觀滲透系數(shù)Papp值均符合已知透腦性質(zhì),表明測定穩(wěn)態(tài)藥物腦血比適用于藥物BBB通透程度的評價。腦組織勻漿法優(yōu)勢在于樣品采集操作性高、提取量大,可對微量成分進行濃縮測定,但采集的腦組織樣品并非來自活體動物,因此并不完全真實。

腦微透析則結(jié)合灌流取樣和透析技術(shù)以此實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測活體腦內(nèi)完整細胞外液物質(zhì)動態(tài)變化。葉勇等［28］經(jīng)大鼠鼻腔或靜脈注射給予芎冰噴霧劑后,利用微透析技術(shù)進行腦內(nèi)藥動學研究,HPLC法測定透析液樣品中磷酸川芎嗪(TMPP)的濃度,經(jīng)鼻和靜注給藥后TMPP都能快速進入腦內(nèi)達到峰濃度,且吸收均符合一室模型,經(jīng)鼻給藥TMPP在腦內(nèi)保留時間更長。表明微透析法能實現(xiàn)芎冰噴霧劑鼻腔給藥后TMPP的藥動學研究。此法可多次多部分同時取樣,取樣量少對體內(nèi)平衡干擾小,保持穩(wěn)定生理狀態(tài)。不可避免的是腦部探針的埋植對腦組織有一定損傷,而且透析結(jié)果只能反映特定時間范圍內(nèi)突觸間隙的遞質(zhì)濃度變化,還要考慮透析膜回收率對測定數(shù)據(jù)的影響。

3.2 體外評價 由于BBB的生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜使得體內(nèi)評價受限于多種因素影響(如實時藥物穩(wěn)態(tài)的血藥濃度、給藥途徑、劑型、劑量、藥物在腦內(nèi)代謝分布及與血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)等),而通過臨床直接考察藥物跨BBB更不現(xiàn)實。因此,藥物BBB通透性評價更多是借助高效簡便的體外細胞模型來完成。理想的體外模型在研究BBB的生理病理改變、物質(zhì)轉(zhuǎn)運機制、信號傳導及篩選潛在腦靶向藥物方面優(yōu)勢顯著。體外評價的關(guān)鍵要素不僅應(yīng)考察模型的細胞形態(tài)、TEER、內(nèi)皮滲透系數(shù)、緊密連接(如Claudin、Occludin、ZO-1和ZO-2等特異性蛋白)等生理結(jié)構(gòu)和基本參數(shù),還要具備諸如葡萄糖轉(zhuǎn)運子、胰島素受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體及外排泵(如P-gp及MRP)等功能性轉(zhuǎn)運體的表達作用。另外,良好的模型更要從藥物體內(nèi)外代謝與活體BBB的相關(guān)性進行分析,同時兼顧模型的簡單性、實用性和可及性。常見BBB模型體內(nèi)外相關(guān)性的檢測見表2［29］。

表2 BBB模型標記物與檢測方法

張水華等［30］采用大鼠原代BCEC細胞與Astrocyte建立體外BBB模型并評價藥物滲透能力。非接觸式培養(yǎng)后可見到典型的細胞形態(tài)(短梭形BCEC細胞和分枝狀突起Astrocyte)；免疫組化分別檢測出高表達因子Ⅷ抗原和膠質(zhì)纖維酸性蛋白,TEER及熒光素鈉的通透性符合建模要求；LC-MS檢測西咪替丁等6個化合物體內(nèi)外透過BBB模型滲透系數(shù)具有一定相關(guān)性(R2=0.7679)。查雨鋒等［31］則建立大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞與周細胞、Astrocyte三重培養(yǎng)體外BBB模型,各細胞均呈現(xiàn)出典型形態(tài)(BMECs鋪石路樣、BMPC胞體較大且呈分枝狀,AS細長突觸)；TEER及熒光素鈉滲透系數(shù)及對堿性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶1(γ-GT1)的表達測定滿足模型要求；測定計算出阿替洛爾等5個陽性藥通過BBB模型的滲透量Papp與已知體內(nèi)數(shù)據(jù)具有較高擬合度(R2=0.92)。以上研究表明通過對特征性標記物評價BBB模型體內(nèi)外的相關(guān)性有利于準確、快速地篩察各藥物跨BBB的通透性。

3.3 其他方法 近年來同位素標記法也應(yīng)用于藥物BBB通透性的評價。如給藥后跟蹤腦部14C、3H標記物發(fā)射的β射線和125I標記物γ射線,無須組織勻漿后繁瑣的藥物提取操作就能開展藥動學研究,且檢測靈敏性高、特異性強。姜國華等［32］為了解鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基(CNB)的BBB通透性,采用Iodogen法進行125I標記,標記率高達85%,產(chǎn)物125I-CNB放化純度為95.7%。小鼠靜脈注射125I-CNB結(jié)果顯示完整的CNB分子未能穿透BBB,而其降解肽段卻能透過BBB進入腦組織。

此外,也有通過一定精確度的數(shù)學模型及計算機輔助設(shè)計來評價藥物穿透BBB的研究報道［33-36］。隨著生物信息技術(shù)發(fā)展,直接在體內(nèi)成像的納米材料也是一個令人激動的領(lǐng)域［37］,提供實時跟蹤這些內(nèi)在和外源性生物標記的納米載體,利用正電子發(fā)射斷層掃描(PET),單光子發(fā)射計算機斷層顯像(SPECT),磁共振成像(MRI),以及各種基于光學對比度的成像方法,如生物發(fā)光成像,熒光分子斷層和光聲斷層成像(FMT),可以實現(xiàn)定量監(jiān)測結(jié)構(gòu)、功能和CNS疾病的分子通路。高分辨率的實時性能范式轉(zhuǎn)移可視化成像平臺的構(gòu)建必將給評價指標提供最直接有效的證明。

4 結(jié)語與展望

BBB是保護CNS的天然屏障,可防止病原體及神經(jīng)毒性物質(zhì)影響大腦功能,同時也是CNS疾病中重要的病理損傷所在,在維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有重要作用。目前通過多種分離培養(yǎng)方法,從許多物種中進行內(nèi)皮細胞的培養(yǎng),甚至開展多重細胞立體培養(yǎng),而動物的腦容量、腦組織分布、血液流速、微血管彈性及張力等因素都與人體有差異,導致數(shù)據(jù)相關(guān)性評價存在一定缺陷。然而,當前許多藥物的CNS轉(zhuǎn)運均采用正常的組織或動物作為BBB模型進行評價,忽視了CNS病理損傷狀態(tài)時BBB通透性的變化,得出偏頗性結(jié)論。但在篩選CNS藥物研發(fā)［38］、探究病原體感染機制［39,40］和干細胞個體化治療［41］等應(yīng)用中,構(gòu)建高性價的體外BBB模型仍是不可或缺的研究工具。據(jù)報道［42］,以人干細胞培養(yǎng)的3D模型分化出的內(nèi)皮細胞、緊密連接及外排轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能表達是目前最契合人體解剖生理的模型。雖然體外細胞模型的建立途徑有多種,但二元共培養(yǎng)模型在體內(nèi)外相關(guān)性上優(yōu)于單一模型,三元模型在多細胞的協(xié)同促進下整體又優(yōu)于二元模型。不過每種模型都有其自身缺點和優(yōu)勢,需要研究者選擇更符合自己研究目的、藥性及可行條件的模型,并建立更為合理嚴謹?shù)脑u價方法。

現(xiàn)已表明在不破壞BBB生理結(jié)構(gòu)的情況下,通過結(jié)構(gòu)修飾、制劑改造及聯(lián)合用藥等途徑可不同程度改善藥物BBB通透性［43］。如脂質(zhì)體、納米粒等新型遞藥系統(tǒng)能夠靶向穿透BBB直達中樞神經(jīng)病灶［44,45］,被視為治療CNS疾病領(lǐng)域的戰(zhàn)略方向。另一方面,中醫(yī)學認為腦為奇恒之府、元神之官,所謂《靈樞·邪氣臟腑病形》載：“十二經(jīng)脈之三百六十五絡(luò),其血氣皆上于面而走空竅”,《靈樞·海論》載:“人始生,先成精,精成而腦髓生”,而傳統(tǒng)中藥的多靶點、多途徑的特點使其在腦系疾病的治療中具有獨特優(yōu)勢。如薄荷、冰片、麝香、川芎、石菖蒲等芳香類中藥具有“醒腦開竅,引藥上行”的功效,研究表明它們能不同程度上提高BBB的通透性［46-50］,其作用可能與中藥有效成分能促進穿透BBB或改善BBB的超微結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達有關(guān)［51］。若利用納米技術(shù)通過包封中藥有效成分或在其轉(zhuǎn)運蛋白表面靶向修飾制成中藥納米制劑,促進藥物透過BBB,以此提高腦內(nèi)藥物濃度蓄積,發(fā)揮中藥減毒增效的效果［52,53］,無疑將為開發(fā)CNS疾病藥物創(chuàng)造巨大潛力。本課題組目前已初步開展相關(guān)中藥與新劑型有機結(jié)合在治療腦卒中方面的研究。雖然制備工藝、藥效等方面處于探索階段,但隨著對BBB的生理機制以及CNS病理認識的深入,并借助生物信息技術(shù)的高新發(fā)展,建立更為科學理想的BBB模型與評價體系,必定能推動新型中藥納米腦靶向制劑的突破。