段睿潔，張航瑜，武 玲，楊衛(wèi)星，徐昆龍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

蚯蚓又名地龍，是中國(guó)重要的中藥材之一[1]，其體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、鈣和磷等[2]?！侗静菥V目》中用蚯蚓入藥的處方有40多種[1]，不僅可防治多種家畜疾病，如豬丹毒、豬黃白痢和牛瘤胃臌氣等，還可用于治療人的慢性支氣管炎、支氣管哮喘、中風(fēng)偏癱和消化道潰瘍等疾病[3]。目前對(duì)蚯蚓提取物的研究主要集中在活性蛋白，如小分子蛋白、多肽和酶等，其在抗氧化、提高免疫力、預(yù)防血栓和溶血等方面均有較好的效果[4]。WANG等[5]研究表明：蚯蚓提取物在調(diào)節(jié)免疫功能上具有積極作用。蚯蚓提取物能夠有效促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬能力和細(xì)胞因子上調(diào)；同時(shí)促進(jìn)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和廓清指數(shù)升高，提高脾細(xì)胞自發(fā)分泌或經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后分泌一氧化氮的水平[6]，從而刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

腸道是機(jī)體消化和吸收的主要場(chǎng)所，同時(shí)由于其龐大的黏膜表面積，也被認(rèn)為是機(jī)體最大的免疫器官[7]。腸道免疫屏障能夠抵御外界對(duì)腸道的有害刺激，成為機(jī)體免疫防御系統(tǒng)最重要的一部分。腸道免疫是機(jī)體整體免疫系統(tǒng)的重要指標(biāo)[8]，腸道屏障一旦被破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌侵入機(jī)體，引起腸源性膿毒血癥等疾病，誘發(fā)全身嚴(yán)重反應(yīng)和多器官功能障礙，從而危及生命[9]。動(dòng)物蛋白可促進(jìn)免疫抑制小鼠腸道樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和細(xì)胞因子表達(dá)，修復(fù)腸道黏膜損傷，從而增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能[10]。但是，目前鮮有蚯蚓提取物中活性蛋白對(duì)腸道黏膜免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)會(huì)破壞機(jī)體的免疫細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥與抗炎反應(yīng)，且常伴有胃腸道不良反應(yīng)[11]，是應(yīng)用最廣泛的免疫抑制模型抑制劑。研究表明：CTX能降低腸道細(xì)胞因子含量，損傷腸道黏膜及屏障蛋白[12]，而動(dòng)物蛋白可修復(fù)CTX造成的腸道損傷[10]，從而調(diào)節(jié)腸道免疫功能。本研究利用CTX建立免疫抑制小鼠模型，以蚯蚓蛋白為受試物，通過(guò)ELISA檢測(cè)腸道TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10和sIgA 的分泌，采用qPCR分析腸道黏膜蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin基因的表達(dá)，探究蚯蚓提取物對(duì)免疫抑制小鼠腸道黏膜免疫功能的影響。本研究將為動(dòng)物免疫疾病的預(yù)防和治療提供新思路，對(duì)進(jìn)一步挖掘蚯蚓提取物的藥用價(jià)值、促進(jìn)蚯蚓養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性昆明種小鼠30只，8周齡，體質(zhì)量(20±2) g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK (滇) K2020-0006。

1.1.2 藥品和試劑

(1) 蚯蚓提取物(earthworm extract，EE)的制備：鮮活蚯蚓(自養(yǎng)，品種為掘穴環(huán)爪蚓)經(jīng)組織勻漿器充分研磨后4 ℃、12 000 r/min離心，取上清液；加入硫酸銨后靜置12 h，4 ℃、12 000 r/min離心，取沉淀；沉淀重溶后，灌入透析袋，透析過(guò)夜；透析結(jié)束后，4 ℃、12 000 r/min離心得到蚯蚓蛋白。按每日灌胃量分裝于2 mL無(wú)菌離心管，置于-80 ℃冰箱保存。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)，蚯蚓蛋白質(zhì)量濃度為3.44 mg/mL。

(2) 試劑：環(huán)磷酰胺(德國(guó)百特腫瘤制藥有限公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司)；sIgA、IL-2、IL-10、TNF-α和IFN-γ ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (perfect real time)[寶生物工程(大連)有限公司] ；TBGreen?Premix ExTaq? II (Tli RNaseH Plus)[寶生物工程(大連)有限公司] 。

1.1.3 主要儀器

高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司] ；熒光定量PCR儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

動(dòng)物分組：30只昆明種小鼠均飼喂普通飼料，適應(yīng)期7 d，分為6組，每組5只小鼠，分別為空白對(duì)照組、免疫抑制模型組、免疫抑制+蚯蚓蛋白高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[13]，免疫抑制+蚯蚓蛋白高劑量組和蚯蚓蛋白組為蚯蚓蛋白液原質(zhì)量濃度(344.0 mg/kg)試驗(yàn)組，免疫抑制+蚯蚓蛋白中劑量組為5倍稀釋(68.8 mg/kg)試驗(yàn)組，免疫抑制+蚯蚓蛋白低劑量組為10倍稀釋(34.4 mg/kg)試驗(yàn)組。

適應(yīng)期結(jié)束后，各組連續(xù)灌胃不同質(zhì)量濃度的蚯蚓蛋白液20 d，除空白對(duì)照組和蚯蚓蛋白組外，其余4組于灌胃第18天腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，連續(xù)注射3 d，建立免疫抑制小鼠模型。試驗(yàn)期間小鼠自由飲食、飲水。每日觀察小鼠活動(dòng)狀況，每3 d稱體質(zhì)量。

1.2.2 免疫器官指數(shù)測(cè)定

灌胃試驗(yàn)結(jié)束后解剖小鼠，取胸腺和脾臟并稱其質(zhì)量；經(jīng)PBS洗凈和吸水紙干燥后再稱其質(zhì)量。根據(jù)公式計(jì)算免疫器官(脾臟或胸腺)指數(shù)：免疫器官指數(shù)=免疫器官平均質(zhì)量/平均體質(zhì)量。

1.2.3 ELISA方法測(cè)定腸道sIgA和細(xì)胞因子的含量

用PBS和預(yù)冷的研缽搗碎腸道組織制備10%小腸組織勻漿液(冰上操作)[10]，將腸勻漿液收集于離心管中，3 000 r/min離心20 min，收集上清液于離心管內(nèi)，隨后根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定腸道組織中細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-2)和分泌型免疫球蛋白 A (sIg A)的含量。

1.2.4 RT-qPCR測(cè)定腸道ZO-1、Claudin-1、Occludin的基因表達(dá)量

(1) 提取總RNA

按Takara RNAiso說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

通過(guò)基因組DNA去除反應(yīng)得到第1步反應(yīng)液。反轉(zhuǎn)錄體系為：第1步反應(yīng)液 10.0 μL、Prime-Script RT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer 24.0 μL和RNase Free dH2O 4.0 μL?；靹蚝?，于PCR儀內(nèi)37 ℃反應(yīng)15 min，再85 ℃反應(yīng)5 s。

(3) 熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量引物見(jiàn)表1。qPCR反應(yīng)體系為：TB Green Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus)(2×) 12.5 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、DNA模板 2 μL和滅菌水 8.5 μL。qPCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95 ℃，30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃，10 s；65 ℃，5 s；95 ℃。以管家基因β-actin作為內(nèi)參，mRNA的結(jié)果采用相對(duì)定量法，即用2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算每個(gè)處理組基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物列表Tab.1 List of primers

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用IBM SPSS Statistics 23進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯檢驗(yàn)，P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠體質(zhì)量的影響

由圖1可知：隨著灌胃蚯蚓蛋白時(shí)間的增加，小鼠體質(zhì)量逐漸上升。在20 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，蚯蚓蛋白組小鼠體質(zhì)量顯著高于免疫抑制組(P<0.05)，表明蚯蚓蛋白可增加小鼠體質(zhì)量。

圖1 蚯蚓蛋白對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of earthworm protein on the body weight of mice

2.2 蚯蚓蛋白對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由圖2 可知：與空白對(duì)照組相比，免疫抑制組、免疫抑制+高、中、低劑量組胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制組相比，蚯蚓蛋白組胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，免疫抑制組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，蚯蚓蛋白組脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組的脾臟指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明免疫抑制小鼠模型建立成功，且蚯蚓蛋白可提高免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數(shù)。

圖2 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig.2 Effects of earthworm protein on the immune organ indexes in immunosuppressed mice

2.3 蚯蚓蛋白對(duì)小腸sIgA分泌水平的影響

由圖3 可知：與免疫抑制組相比，免疫抑制+高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組的sIgA含量均顯著升高(P<0.05)，表明蚯蚓蛋白可增加免疫抑制小鼠腸道內(nèi)sIgA分泌量，從而改善小鼠腸道免疫抑制情況。

圖3 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠腸道sIgA含量的影響Fig.3 Effect of earthworm protein on the intestinal sIgA content in immunosuppressed mice

2.4 蚯蚓蛋白對(duì)小腸組織內(nèi)細(xì)胞因子分泌水平的影響

由圖4可知：與空白對(duì)照組相比，免疫抑制組的TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-10含量均顯著降低 (P<0.05)。與免疫抑制組相比，免疫抑制+高、低劑量組的TNF-α和IFN-γ含量均顯著升高 (P<0.05)，蚯蚓蛋白組的IL-2含量顯著升高(P<0.05)，免疫抑制+高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組的IL-10含量均顯著升高 (P<0.05)。說(shuō)明蚯蚓蛋白可不同程度地增加TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-10含量，改善免疫抑制小鼠腸道免疫功能。

圖4 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effects of earthworm protein on the cytokines in immunosuppressed mice

2.5 蚯蚓蛋白對(duì)腸道屏障功能因子基因表達(dá)的影響

由圖5可知：與空白對(duì)照組相比，免疫抑制+低劑量組和蚯蚓蛋白組的Occludin表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，且蚯蚓蛋白組的表達(dá)量比對(duì)照組高4倍；蚯蚓蛋白組和免疫抑制+中劑量組的Claudin-1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；免疫抑制+高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組的ZO-1表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。與免疫抑制組相比，免疫抑制+高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組的Occludin表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，免疫抑制+低、中劑量組和蚯蚓蛋白組的Claudin-1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，免疫抑制+高、中、低劑量組和蚯蚓蛋白組的ZO-1表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。表明蚯蚓蛋白可增加免疫抑制小鼠和正常小鼠腸道內(nèi)Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)量，且其表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組，提示蚯蚓蛋白不僅能修復(fù)環(huán)磷酰胺造成的損傷，還能增強(qiáng)正常小鼠腸道屏障功能。

圖5 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠腸道屏障功能因子基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of earthworm protein on the gene expression of intestinal barrier functional factors in immunosuppressed mice

3 討論

3.1 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其發(fā)育好壞決定機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱[16]。胸腺是T細(xì)胞分化和成熟的場(chǎng)所，對(duì)免疫器官和免疫細(xì)胞都具有調(diào)節(jié)作用[17]。脾臟是T細(xì)胞和B 細(xì)胞的定居場(chǎng)所，可產(chǎn)生各種免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。研究發(fā)現(xiàn)：環(huán)磷酰胺能顯著降低正常小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：免疫抑制+高、中、低劑量組脾臟指數(shù)均顯著高于免疫抑制組，表明蚯蚓蛋白能夠恢復(fù)環(huán)磷酰胺對(duì)免疫器官的影響；但是，由于環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠胸腺的抑制作用過(guò)強(qiáng)，無(wú)法使胸腺的質(zhì)量恢復(fù)至正常水平。蚯蚓蛋白組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組，表明蚯蚓蛋白能夠提高正常小鼠免疫能力，與李榮[4]的研究結(jié)果一致，提示蚯蚓蛋白能提高小鼠機(jī)體免疫力。

3.2 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠腸道內(nèi)細(xì)胞因子的影響

腸道免疫是機(jī)體整體免疫的重要指標(biāo)，腸道黏膜免疫和腸道屏障是其重要組成部分，故本研究進(jìn)一步檢測(cè)了腸道黏膜免疫和腸道屏障的變化情況。細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、刺激免疫細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用。因此，檢測(cè)腸道細(xì)胞因子的含量可反應(yīng)腸道黏膜免疫功能。IL-2是預(yù)防胃腸道慢性炎癥所必需的多效性細(xì)胞因子，使用小劑量IL-2可治療炎癥性腸病[20]。IL-10是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的重要抗炎細(xì)胞因子，IL-10或IL-10受體缺陷的小鼠易誘發(fā)自發(fā)性結(jié)腸炎[21]。TNF-α是推動(dòng)腸道炎癥過(guò)程的重要介質(zhì)，IFN-γ可以活化巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等增強(qiáng)抗腫瘤和抗病毒的能力[22]。

蚯蚓活性肽能促進(jìn)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2并提高小鼠血清細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ含量[6]；蚯蚓提取物能夠提高小鼠血清IgG、IFN-γ和IL-6的含量[4]。本研究發(fā)現(xiàn)：與免疫抑制組相比，免疫抑制+高、低劑量組的TNF-α含量顯著升高，免疫抑制+低劑量組的IFN-γ含量顯著升高，表明蚯蚓蛋白可增加免疫抑制小鼠腸道內(nèi)炎癥因子的分泌，刺激腸道免疫功能，從而緩解腸道的免疫抑制。提示蚯蚓蛋白可刺激IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α分泌，改善腸道內(nèi)細(xì)胞因子異常。

腸道中的sIgA能增強(qiáng)腸道免疫屏障功能，是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)[23]。本研究表明：與免疫抑制組相比，免疫抑制+高、中、低劑量組的sIgA含量顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)：多糖可通過(guò)增加腸道內(nèi)sIgA恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的腸道免疫受損[19]，這與本研究結(jié)果一致。表明蚯蚓蛋白可通過(guò)增加腸道內(nèi)sIgA改善環(huán)磷酰胺致腸道免疫受損，提示長(zhǎng)期服用蚯蚓蛋白能夠增加sIgA含量，提高腸道黏膜免疫能力。

3.3 蚯蚓蛋白對(duì)免疫抑制小鼠腸道黏膜屏障的影響

通常認(rèn)為主要通過(guò)細(xì)胞旁途徑和細(xì)胞間途徑破壞腸道黏膜屏障。構(gòu)成細(xì)胞間途徑的腸上皮細(xì)胞間連接從頂端到基膜依次為緊密連接、黏附連接、橋粒和縫隙連接[24]。Claudin-1、Occlidun和ZO-1作為緊密連接的蛋白標(biāo)記物對(duì)腸道結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，其表達(dá)下降可能會(huì)造成腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷而增加腸上皮細(xì)胞的通透性，并伴隨細(xì)菌移位和血清中內(nèi)毒素升高等[25]。本研究表明：免疫抑制+中劑量組的Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)量均顯著高于免疫抑制組，蚯蚓蛋白組的Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組。有研究發(fā)現(xiàn)：殼聚糖能促進(jìn)緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)，維持腸黏膜屏障功能，減輕潰瘍性結(jié)腸炎[26]。ZHUANG 等[27]通過(guò)H2O2模擬體外氧化模型造成豬小腸上皮細(xì)胞損傷，發(fā)現(xiàn)小腸Occludin、ZO-1和Claudin-1表達(dá)量下降，而白藜蘆醇可提高Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)水平，以上結(jié)果與本研究結(jié)果相似。此外，本研究中蚯蚓蛋白組的基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組，提示蚯蚓蛋白可增加腸道黏膜屏障基因Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)量，修復(fù)腸道屏障受損，并增強(qiáng)正常小鼠腸道屏障功能。

4 結(jié)論

經(jīng)蚯蚓蛋白提取物干預(yù)能夠顯著提高免疫抑制小鼠機(jī)體免疫能力，并刺激腸道內(nèi)細(xì)胞因子和sIgA分泌，對(duì)腸道屏障損傷有預(yù)防和修復(fù)作用。