保志鵬，涂興調(diào)，張自芳，谷麗嬌，范新陽，錢林東，苗永旺

(1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650212；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

FEZ家族鋅指蛋白2 (FEZ family zinc finger protein 2，F(xiàn)EZF2)又稱前腦胚胎鋅指樣蛋白2(forebrain embryonic zinc finger-like protein 2)，是鋅指蛋白超基因家族的重要成員，包含6個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)和1個甘氨酸重復(fù)區(qū)域[1-5]。FEZF2作為一種轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子，參與神經(jīng)元發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)：動物神經(jīng)元發(fā)育通過下游細(xì)胞因子的表達(dá)與機體免疫關(guān)聯(lián)[2,5-7]。奶牛乳腺炎的易感性與信號素5A (semaphorin 5A，SEMA5A)的轉(zhuǎn)錄活性下降而導(dǎo)致的免疫反應(yīng)受損有關(guān)[2]。乳腺炎可誘導(dǎo)FEZF2基因在乳腺中表達(dá)，導(dǎo)致SEMA5A的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)與機體免疫相關(guān)的TNF-α和IL-8等多個基因表達(dá)[2]。在乳腺炎中，F(xiàn)EZF2均能誘導(dǎo)SEMA5A表達(dá)上調(diào)，但在易感奶牛中其表達(dá)水平低于乳腺炎抗性牛[2]。在奶牛中發(fā)現(xiàn)：FEZF2基因編碼產(chǎn)物的多個甘氨酸殘基重復(fù)區(qū)存在12G重復(fù)和13G重復(fù)2種等位基因，13G型的FEZF2等位基因降低了SEMA5A的表達(dá)水平，導(dǎo)致13G/13G基因型奶牛對乳腺炎易感，發(fā)病率是12G/12G 基因型奶牛的2倍[8]。FEZF2基因位于普通牛第22號染色體，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，編碼序列 (coding sequence，CDS)全長為1 380 bp (登錄號：NM_001038198.2)；水牛FEZF2基因定位于第21號染色體，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，CDS全長也為1 380 bp (登錄號：XM_045163982.1)。魏偉等[5]對河流型和沼澤型水牛群體FEZF2基因的檢測發(fā)現(xiàn)：河流型水牛中存在c.165G>A，屬于同義替換，且河流型與沼澤型水牛的FEZF2基因多個甘氨酸殘基重復(fù)編碼區(qū)都為13G型。張廣樂等[6]研究發(fā)現(xiàn)：FEZF2基因在12個水牛組織中都有表達(dá)，其中在大腦的表達(dá)量最高，該基因可能在水牛中作為一類核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與基因的表達(dá)調(diào)控過程。FEZF2分別位于山羊的第22號、綿羊的第19號染色體上，它們都含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼區(qū)長度與普通牛和水?；疽恢隆?/p>

?？萍茵B(yǎng)動物包括普通牛、水牛、牦牛、綿羊和山羊等，具有奶用、肉用和役用等多種用途，在全球畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。FEZF2作為一種轉(zhuǎn)錄因子，參與神經(jīng)元的發(fā)育，可能與動物的先天免疫和奶牛的乳腺炎緊密相關(guān)[1-4]，但目前有關(guān)?？莆锓NFEZF2基因的研究還十分有限?；诖耍狙芯繌腘CBI和Ensembl數(shù)據(jù)庫下載?？萍倚驠EZF2基因及其編碼蛋白序列，并以下載的非?？苿游锏耐葱蛄袨閷φ眨捎蒙镄畔W(xué)和比較基因組學(xué)方法，對牛科主要家畜FEZF2基因的結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的氨基酸組成、理化特征、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、參與的生物學(xué)路徑及分子功能等進(jìn)行深入的比較分析，旨在解析牛科物種FEZF2基因的分子特征、基本功能及進(jìn)化關(guān)系，為深入研究FEZF2基因調(diào)控動物免疫的機制和?？萍茵B(yǎng)動物的抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 FEZF2序列及其注釋文件的獲取

用于數(shù)據(jù)分析的水牛、普通牛、瘤牛、雜交牛、牦牛、山羊和綿羊等牛科物種的FEZF2基因及其編碼蛋白序列以及用于比較分析的一些非?？苿游锏耐葱蛄校鶑腘CBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)下載。經(jīng)初步比較分析，過濾不完整的序列或可能存在錯誤的序列后，用于本研究的序列數(shù)據(jù)信息見表1。用于數(shù)據(jù)分析的各物種基因組注釋GTF文件由NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=)下載得到。

表1 FEZF2基因序列的來源Tab.1 Sequence source of FEZF2 gene

1.2 基因結(jié)構(gòu)、一致性及差異分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載各物種FEZF2基因的核苷酸序列，然后用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)通過開放閱讀框(open reading frame，ORF)查找確定每條序列的CDS，進(jìn)一步利用Lasergene軟件包(DNAStar Inc.，USA)中的MegAlign程序分析各物種序列的一致性；FEZF2基因的堿基組成和核苷酸序列差異采用MEGA 7[9]進(jìn)行計算或輸出。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載牛科家畜及常見非?？苿游锏幕蚪M注釋GTF文件，使用TBtools軟件[10]對每個物種的FEZF2基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行信息完整化處理，進(jìn)一步使用在線軟件Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-ab.org/)對每個物種的基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.3 分子特征、進(jìn)化關(guān)系及生物學(xué)過程和分子功能

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載FEZF2基因的氨基酸序列，利用MegAlign程序分析各物種的序列一致性；采用MEGA 7[9]分析氨基酸序列差異并構(gòu)建FEZF2蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；將FEZF2蛋白氨基酸序列提交至MEME Suite網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/)獲得其基序結(jié)構(gòu)信息；將各物種蛋白序列提交至NCBI的Conserved Domains數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)獲得保守結(jié)構(gòu)域。采用TBtools程序整合基序和保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果。序列一致性、基序和保守結(jié)構(gòu)域分析所使用的序列與基因結(jié)構(gòu)分析使用的序列相對應(yīng)。

FEZF2蛋白的理化特征與疏水性、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域采用在線軟件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale (https://web.expa sy.org/protscale/)、SignalP 5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM 2.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別進(jìn)行預(yù)測；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及其二級和三級結(jié)構(gòu)分別采用在線軟件ProtComp (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)、SOPMA (http://npsa-pbil.ib cp.fr/)和SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行分析。與FEZF2蛋白相互作用的蛋白、FEZF2參與的生物學(xué)過程和分子功能分別使用在線工具STRING (https://string-db.org/)和InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequencesearch)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?？莆锓NFEZF2基因序列分析

2.1.1 編碼區(qū)堿基組成、序列一致性與差異

由表2可知：?？莆锓N間FEZF2基因編碼區(qū)的堿基組成相似，與非?？莆锓N的編碼區(qū)堿基組成差異較大。在?？莆锓N中，表現(xiàn)為牛屬和羊?qū)賱游锏膶賰?nèi)一致性更高，水牛與牛屬和羊?qū)賱游镉幸欢ú町?。由?和圖1可知：在FEZF2基因編碼區(qū)序列一致性上，?？莆锓N間序列一致性在97.8%～100.0%之間，序列差異性較??；牛科與非?？撇溉閯游镄蛄幸恢滦栽?8.5%～98.2%之間，序列間差異相對較大；?？莆锓N與雞的序列一致性僅在71.8%～72.1%之間，序列差異性最大。值得注意的是，牛科物種FEZF2基因CDS第313～351位核苷酸之間存在1個編碼連續(xù)甘氨酸的序列區(qū)，該區(qū)域存在長度多態(tài)性，有12G(編碼12個連續(xù)的甘氨酸)和13G (編碼13個連續(xù)的甘氨酸) 2種類型，兩者在長度上相差1個密碼子。除雞外，非?？莆锓N在第303位核苷酸之后也存在這個連續(xù)編碼甘氨酸的序列區(qū)，但該區(qū)域在非?？莆锓N間長度差異較大，與?？莆锓N也不一致。核苷酸位點c.247A、c.480T和c.537T是牛屬動物與水牛和羊?qū)賱游锵嗷^(qū)分的核苷酸位點；c.771T是水牛與牛屬動物和羊?qū)賱游锵嗷^(qū)分的核苷酸位點。

圖1 牛科物種FEZF2基因核苷酸序列差異Fig.1 Nucleotide sequence differences of FEZF2 gene in species of Bovidae

表2 FEZF2基因編碼區(qū)堿基組成Tab.2 Base composition in the coding region of FEZF2 gene

2.1.2 基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)

由圖2可知：?？莆锓NFEZF2基因的CDS長度由于在多個連續(xù)甘氨酸殘基編碼區(qū)存在長度多態(tài)性而略有不同。普通牛和瘤牛的FEZF2基因在該區(qū)域都存在12G和13G類型，前者比后者少1個密碼子，其CDS長為1 377 bp；在水牛、牦牛、山羊和綿羊中，該區(qū)域只存在13G型，CDS長度均為1 380 bp。不同物種間FEZF2基因轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)不同，特別是非翻譯區(qū) (untranslated region：5′UTR和3′UTR)的長度及內(nèi)含子長度不一致。在?？莆锓N中，除瘤牛的FEZF2基因包含2個選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本(它們主要在5′UTR存在差異)外，普通牛、水牛、牦牛、山羊和綿羊均只包含1個轉(zhuǎn)錄本。結(jié)合表4還可知：水牛FEZF2基因與其他牛科物種的轉(zhuǎn)錄區(qū)組成與結(jié)構(gòu)差異較大，山羊和綿羊間的轉(zhuǎn)錄區(qū)組成與結(jié)構(gòu)也相差較大；但?？莆锓N間FEZF2的CDS區(qū)結(jié)構(gòu)組成與共線性關(guān)系較為一致，與其他非牛科物種相似性也較大。

表4 ?？坪头桥？苿游颋EZF2基因結(jié)構(gòu)的比較Tab.4 Comparison of FEZF2 gene structure between species of Bovidae and non-Bovidae

圖2 ?？莆锓N及非?？苿游锏腇EZF2基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of FEZF2 gene in Bovidae and non-Bovidae

2.2 氨基酸組成、理化特征及結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 FEZF2蛋白的氨基酸組成

由表5可知：在氨基酸組成上，?？莆锓N間相似性較大，與非?？苿游?特別是雞)的差異較大。在?？莆锓N中，水牛、普通牛、瘤牛和牦牛間FEZF2蛋白的氨基酸組成相似性較大，它們與山羊和綿羊在丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和纈氨酸等氨基酸組成上存在一定差異。

表5 ?？莆锓N與非牛科動物FEZF2氨基酸組成Tab.5 Amino acid composition of FEZF2 in species of Bovidae and non-Bovidae %

2.2.2 基本理化特征分析

由表6可知：牛科物種FEZF2的基本理化特征基本相似，都是親水性蛋白質(zhì)，但水牛屬、牛屬與羊?qū)賱游锏膶匍g有一定差異，主要表現(xiàn)在疏水性氨基酸與極性氨基酸的含量、不穩(wěn)定指數(shù)和疏水性等方面。普通牛和瘤牛FEZF2的12G型和13G型除疏水性有一定差異外，其他指標(biāo)較一致。?？莆锓NFEZF2的基本理化特征與人和家鼠的特別是與雞的差異較大。

2.2.3 FEZF2蛋白的基序和結(jié)構(gòu)域

由圖3可知：除豬和雞的FEZF2蛋白含有9個基序外，其他物種的FEZF2蛋白均含有10個基序。預(yù)測結(jié)果(表6)顯示：?？坪头桥？苿游锏腇EZF2蛋白都不含有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，但都含有1個COG5048保守結(jié)構(gòu)域，由6個C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)域組成(圖3和圖4)，由基序3、2、9和1構(gòu)成。?？婆c和非?？苿游锏腇EZF2的COG5048保守結(jié)構(gòu)域所在位置一致，在靠近多肽鏈的C端一側(cè)(?？苿游镌诙嚯逆湹腁A288～440之間)。人、家鼠和豬除含有1個COG5048保守結(jié)構(gòu)域之外，在AA385～441之間還含有1個SFP1超家族結(jié)構(gòu)域；家鼠在AA317～339之間還有1個zf-H2C2_2結(jié)構(gòu)域。

表6 ?？萍胺桥？莆锓NFEZF2的基本理化特征Tab.6 Basic physicochemical characteristics of FEZF2 for species of Bovidae and non-Bovidae

2.2.4 二級結(jié)構(gòu)組成與三級結(jié)構(gòu)分析

由表7可知：水牛屬和牛屬動物與羊?qū)賱游锏腇EZF2氨基酸序列中形成各類二級結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量有一定差異，牛科與非?？苿游锊町惛?。同源建模顯示：構(gòu)建?？莆锓NFEZF2蛋白的最佳模型為鼠鋅指蛋白568模板(5wjq.1.C)。水牛、普通牛(12/13G)、瘤牛(12/13G)、牦牛和山羊的FEZF2蛋白三維結(jié)構(gòu)與模板一致性為43%，覆蓋率為37% (AA275～445之間)；綿羊13G的三級結(jié)構(gòu)與5wjq.1.C的覆蓋率為37%，一致性為41%，缺少1個鋅指結(jié)構(gòu)；預(yù)測的模板覆蓋區(qū)域在COG5048保守結(jié)構(gòu)域區(qū)，三維結(jié)構(gòu)顯示該區(qū)域含有6個典型的鋅指結(jié)構(gòu)(綿羊含5個)，與結(jié)構(gòu)域分析基本一致。從三維結(jié)構(gòu)來看，?？莆锓N的屬間有一定差異；水牛與普通牛、瘤牛的13G和12G型FEZF2都有差異，但與普通牛13G型差異相對較小(圖4)。

表7 形成各物種FEZF2蛋白二級結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量占比Tab.7 Proportion of amino acids that form the secondary structure of FEZF2 proteins in different species %

圖4 預(yù)測的?？苿游颋EZF2蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of FEZF2 protein predicted in Bovidae

2.3 亞細(xì)胞定位、生物學(xué)過程及分子功能

亞細(xì)胞定位分析表明：各物種FEZF2定位于細(xì)胞核內(nèi)的支持分?jǐn)?shù)值為10 (滿分)，表明FEZF2蛋白為在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能作用的蛋白質(zhì)。生物信息分析表明：FEZF2蛋白主要參與軸突成束、細(xì)胞去分化、細(xì)胞群增殖的負(fù)調(diào)控、神經(jīng)元分化的負(fù)調(diào)節(jié)、神經(jīng)元命運的決定和神經(jīng)元分化的正向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。它能與染色質(zhì)結(jié)合，具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活或抑制因子活性，能激活或抑制RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的特定基因集轉(zhuǎn)錄；還具有能與蛋白編碼基因順式調(diào)控序列特異性結(jié)合的功能。

2.4 蛋白質(zhì)互作分析

由圖5可知：與各?？莆锓N的FEZF2蛋白相互作用的蛋白不完全相同，其中共有的互作蛋白主要為BCL11B、CUX1、CUX2、ETV1、FOXP2、KCNN2、NEUROG2、NR2E1、OTP、PAX6、SATB2、SLC38A11、SOX5、TBR1和ZFPM2等，主要為參與胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中T淋巴細(xì)胞分化和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與控制大腦中神經(jīng)元的增殖和分化的轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄激活或抑制因子，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性鉀離子通道，參與神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜發(fā)育核受體亞家族2組E成員，參與下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分化的骨同源盒蛋白，在眼睛、鼻子、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺的發(fā)育中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，在核基質(zhì)或支架相關(guān)區(qū)域與DNA結(jié)合的蛋白，參與軟骨細(xì)胞分化和軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子，參與皮質(zhì)發(fā)育(包括神經(jīng)元遷移、板層和區(qū)域特征)以及軸突投射過程的轉(zhuǎn)錄抑制因子和具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。

圖5 ?？莆锓NFEZF2蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Interaction network of FEZF2 protein in species of Bovidae

2.5 氨基酸序列一致性與系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖6可知：各?？莆锓NFEZF2氨基酸序列的一致性在99.7%～100.0%之間；它們與非?？撇溉閯游颋EZF2氨基酸序列的一致性在94.1%～99.3%之間；與雞的序列一致性偏低，在78.9%～79.4%之間。各物種FEZF2氨基酸序列間的差異位點及其連續(xù)甘氨酸重復(fù)區(qū)的位置與差異見圖7。

圖6 ?？婆c非?？莆锓NFEZF2氨基酸序列一致性與分歧度Fig.6 Identify and divergence of FEZF2 amino acid sequences between species of Bovidae and non-Bovidae

圖7 ?？婆c非牛科物種FEZF2氨基酸序列差異Fig.7 Amino acid sequence differences of FEZF2 among the species of Bovidae and non-Bovidae

由圖8可知：在系統(tǒng)發(fā)育樹上，普通牛、瘤牛、牦牛、中亞馬鹿、水牛與山羊、綿羊等聚在一大支，支持率為99%；而人、馬、驢、單峰駝、野駱駝、人、家鼠、貓和獅子聚在另一支。

圖8 ?？坪头桥？苿游颋EZF2的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.8 Phylogenetic relationships of FEZF2 in species of Bovidae and non-Bovidae

3 討論

?？萍茵B(yǎng)動物是人類奶制品、肉類和畜力的重要來源，在畜牧業(yè)經(jīng)濟中占有十分重要的地位。近年研究表明：FEZF2參與動物的神經(jīng)元發(fā)育，是與動物先天免疫和奶牛乳腺炎抗性緊密相關(guān)的重要候選基因[1-4,8]，但目前對?？莆锓NFEZF2基因的研究主要針對普通奶牛，對其他?？萍茵B(yǎng)動物的涉及還十分有限[2-8]。闡明?？莆锓NFEZF2基因的分子特征、結(jié)構(gòu)、功能及其與非牛科物種的差異，有助于深入理解FEZF2基因與動物神經(jīng)發(fā)育和先天免疫的關(guān)聯(lián)機制，也可為?？萍茵B(yǎng)動物奶用和肉用性狀的抗病育種提供依據(jù)。為此，本研究從公共生物大分子數(shù)據(jù)庫和基因組數(shù)據(jù)庫下載了?？萍倚蠹坝糜诒容^的常見非牛科物種的FEZF2基因及其編碼蛋白序列，采用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法進(jìn)行深入的比較分析。結(jié)果表明：?？莆锓NFEZF2基因在CDS長度、堿基組成和CDS結(jié)構(gòu)組成模式上具有較高的一致性；其編碼產(chǎn)物的氨基酸組成、序列一致性、理化特征、基序、保守結(jié)構(gòu)域和三維結(jié)構(gòu)等雖具有一定的種屬間差異，但一致性非常高，與非?？苿游锏囊恢滦砸草^高。系統(tǒng)發(fā)育分析也顯示：牛科FEZF2蛋白序列聚集在一大支中，表明牛科家養(yǎng)動物的FEZF2蛋白有著較近的遺傳關(guān)系。本研究表明：?？艶EZF2蛋白與非牛科哺乳動物具有相似功能，牛科家養(yǎng)動物間一致性更高。

有研究發(fā)現(xiàn)：FEZF2蛋白是一種含有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和連續(xù)甘氨酸重復(fù)區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子，它能控制單胺能神經(jīng)元的發(fā)育[1,11-12]。FEZF2缺陷的小鼠呈現(xiàn)出過度活躍的行為，揭示FEZF2基因在神經(jīng)元發(fā)育中起作用[7]。SUGIMOTO等[2]報道FEZF2在普通牛大腦中強表達(dá)，在乳腺中弱表達(dá)。在泌乳期水牛中，F(xiàn)EZF2在大腦中的表達(dá)水平最高，在小腦、垂體、心、肺、脾和腎中有較高水平的表達(dá)，在乳腺、肌肉、小腸和十二指腸組織中有適量表達(dá)[6]。在奶牛中發(fā)現(xiàn)，乳腺炎能夠誘導(dǎo)乳腺中FEZF2表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞中SEMA5A表達(dá)，進(jìn)一步引起與機體免疫反應(yīng)相關(guān)的多個基因表達(dá)[2,8]。因此，F(xiàn)EZF2基因不僅與神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)，而且由于神經(jīng)元發(fā)育和免疫之間存在串?dāng)_，導(dǎo)致其與先天免疫相關(guān)[2,8]。本研究顯示：牛科動物FEZF2蛋白都是在核內(nèi)發(fā)揮功能的親水性蛋白，無信號肽序列及跨膜結(jié)構(gòu)域，都含有1個COG5048保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，其參與的生物學(xué)過程主要與神經(jīng)元發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)，分子功能主要與染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活或抑制有關(guān)[12-13]；與其相互作用的蛋白多為與神經(jīng)元發(fā)育和先天免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白。結(jié)合其在序列和結(jié)構(gòu)上的保守性，推測FEZF2蛋白參與牛科家養(yǎng)動物的神經(jīng)元發(fā)育和與先天免疫相關(guān)的生物學(xué)過程。

SUGIMOTO等[2,8]研究表明：FEZF2基因中連續(xù)甘氨酸重復(fù)區(qū)的多態(tài)性與奶牛乳腺炎抗性相關(guān)，但這種多態(tài)性對產(chǎn)奶量、乳中脂、蛋白和非脂肪固型物產(chǎn)量的估計育種值無不利影響。該區(qū)域13G型等位基因?qū)е履膛θ橄傺滓赘校?2G型等位基因使奶牛對乳腺炎具有抗性，這是因為12G型抗性等位基因促進(jìn)SEMA5A表達(dá)的能力顯著強于易感的13G型等位基因，即12G型等位基因引起的免疫應(yīng)答水平高于13G型的等位基因[2,8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：易感的13G型FEZF2含有的甘氨酸重復(fù)區(qū)能與胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)基因5′UTR中較長的胞嘧啶(C)伸展相結(jié)合，通過促進(jìn)IGF1R的表達(dá)而抑制乳腺上皮細(xì)胞的自噬過程，進(jìn)而介導(dǎo)對乳腺炎的易感性[3]。攜帶13G型的FEZF2與5′UTR中含較長C延伸的IGF1R的變異組合的奶牛更容易患乳腺炎[3]。本研究通過序列比對發(fā)現(xiàn)：哺乳動物的FEZF2蛋白都存在連續(xù)甘氨酸重復(fù)區(qū)，但各物種間甘氨酸重復(fù)的數(shù)量有差異。在?？萍茵B(yǎng)動物中，普通牛和瘤牛的FEZF2在該區(qū)域都存在12G和13G型等位基因，而在水牛、牦牛、山羊和綿羊中，該區(qū)域只存在13G型等位基因。前期魏偉等[5]對河流型和沼澤型水牛群體檢測發(fā)現(xiàn)：這兩類水牛的FEZF2都為13G型。在水牛、牦牛、山羊和綿羊中，F(xiàn)EZF2蛋白只存在13G型，它是否會導(dǎo)致這些?？莆锓N乳腺炎易感或先天免疫應(yīng)答受損有待進(jìn)一步深入研究。值得注意的是，截至目前，未見沼澤型水牛、牦牛、山羊和綿羊患乳腺炎的報道；奶用河流型水牛乳腺炎的發(fā)病率僅約4%，顯著低于普通奶牛[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)：在氨基酸序列一致性、理化特性和結(jié)構(gòu)上，各?？莆锓N的FEZF2雖然具有較高的一致性，但仍存在一定的種屬間差異，這些差異是否與水牛、牦牛、山羊和綿羊?qū)θ橄傺椎目剐杂嘘P(guān)尚不清楚，因此，有必要通過群體水平的試驗觀察和進(jìn)一步的細(xì)胞水平功能試驗予以證實。

本研究通過序列比對，發(fā)現(xiàn)了一些具有種屬特征的核苷酸或氨基酸差異位點，這些位點不僅反映了種屬間FEZF2功能的差異，而且也可作為種屬間相互區(qū)分的分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

?？莆锓N的FEZF2基因編碼蛋白在氨基酸組成、序列一致性、理化特征和結(jié)構(gòu)上雖然有種屬間差異，但一致性較高。在?？浦?，水牛、牦牛、綿羊和山羊FEZF2序列的連續(xù)甘氨酸重復(fù)區(qū)為13G型，而普通牛和瘤牛的同源區(qū)有12G和13G型。?？苿游颋EZF2蛋白都是在核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的親水性蛋白，都含有1個由6個鋅指結(jié)構(gòu)組成的COG5048保守結(jié)構(gòu)域，參與的生物學(xué)過程主要與神經(jīng)元發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)，分子功能主要與染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活或抑制有關(guān)。本研究揭示FEZF2蛋白可能參與了?？莆锓N神經(jīng)元發(fā)育和機體免疫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控過程。