許 萍，宋宜林，歐玉民

（北京建筑大學(xué)城市雨水系統(tǒng)與水環(huán)境省部共建教育部重點實驗室，北京 100044）

0 引 言

隨著我國城市化進程不斷推進，城市綠化率逐漸增大，灌溉用水資源供需矛盾愈發(fā)凸顯[1]，為解決灌溉水資源短缺問題，應(yīng)當(dāng)從節(jié)水灌溉、廣辟水源兩方面并行研究[2]。微潤灌溉是一種利用功能性半透膜作為灌溉輸水管，借助壓力迫使水分從微潤管中滲出，將水精準輸送至作物根區(qū)進行灌溉的節(jié)水灌溉技術(shù)[3,4]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對提升節(jié)水增產(chǎn)效應(yīng)有重大意義[5]，具有水利用率高，運行成本低等優(yōu)點[6,7]，同時能夠避免輸水與人體直接接觸，是利用再生水等非常規(guī)水資源灌溉的適宜方式。

當(dāng)前關(guān)于微潤灌技術(shù)的研究主要集中在水力特性及生產(chǎn)應(yīng)用等方面[8,10]。微潤管灌溉運行過程中，微潤管堵塞問題是影響系統(tǒng)運行安全及使用壽命的主要問題，但目前針對微潤灌系統(tǒng)堵塞問題的研究集中在水中泥沙等不溶性顆粒物方面[11,13]，而再生水中含有的微生物以及溶解性物質(zhì)對微潤灌系統(tǒng)的堵塞特性及機理缺乏相關(guān)成果支持。本文通過微潤管對比出流量變化，得到堵塞程度隨時間變化規(guī)律，并對微潤管堵塞物質(zhì)各組分含量進行檢測，明確生物膜中具體成分含量變化規(guī)律，基于Miseq 高通量測序技術(shù)檢測結(jié)果，分析管段內(nèi)微生物種群構(gòu)成以及物種演化過程，進一步研究微潤管的堵塞機理。旨在為解決微潤管微生物堵塞問題及更大范圍推廣微潤管應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗裝置與材料

試驗在課題組自行設(shè)計搭建的實驗平臺上進行，試驗裝置示意圖，見圖1。

圖1 試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of test device

平行設(shè)置兩個水箱，一個是再生水水箱，另一個是空白對照組自來水箱；再生水水質(zhì)指標值，見表1。水箱中設(shè)置電加熱裝置維持水溫為25 ℃（±1 ℃），采用潛水泵作為動力源，并設(shè)置回流管，結(jié)合分流原理維持系統(tǒng)供水壓力為0.02 MPa（±0.005 MPa）。每種水源條件設(shè)置微潤管15 根，微潤管外以PVC 管包裹用于收集出水，PVC 管另一端接排水管將水收集至置于天平上的錐形瓶中，測量累積出流量。補充集水器及壓力傳感器，保持每一根微潤管壓力相同。

表1 試驗再生水主要水質(zhì)指標Tab.1 Main water quality indexes of reclaimed water

本研究所采用的微潤管購買自北京微潤灌溉科技有限公司，內(nèi)徑16 mm，內(nèi)壁半透膜膜孔大小為10～900 nm，出水流量范圍在60～160 mL/(h·m)，為減少管段中水利偏差對試驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，試驗用管段長度均為1 m。

1.2 出流量及堵塞率測定

考慮到微潤管出水量微小，難以采用流量計等方式對出流量進行測量，因此采用天平稱重的方式進行計量，天平型號為AL104，精度0.1 g，試驗過程中每日22∶00 對天平讀數(shù)進行記錄，得到過去24 h 累計水量變化數(shù)據(jù)，換算成每小時流量數(shù)據(jù)。

微潤管的堵塞率采用公式（1）計算：

式中：EC為微潤管堵塞率，%；q0為微潤管起始流量，mL/h；qi為第i天微潤管出流量，mL/h。

1.3 胞外聚合物（EPS）組分分析

將不同流量下降率對應(yīng)的微潤管取出，選取每根管材中心位置5 cm 長的管段作為樣本，將其放入樣品袋中并加入15 mL蒸餾水，放入超聲波清洗機中進行震蕩脫膜處理3 h，脫模處理后將樣品袋均勻搖晃10 min 以防止堵塞物質(zhì)殘留并將液體混合均勻，收集樣品袋中渾濁液體進行離心處理（10 000 r/min，30 min），分離樣品上清液，吸取分離后的沉淀物進行EPS 物質(zhì)含量檢測。堵塞物質(zhì)中多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定[1]。

1.4 Miseq高通量測序

將微潤管堵塞50%（WR50）及堵塞100%（WR100）時的管段取出，按照1.3方法提取生物膜樣本，依次進行DNA抽取、PCR 擴增、熒光定量、高通量測序等分析。采用德國Qiagen 公司的QIAquick Gel Extraction Kit 試劑盒抽取DNA，以基因組DNA 為模板，采用引物CCTACGGGNGGCWGCAG/GACTACHVGGGTATCTAATCC 對16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列進行兩輪PCR 擴增。之后用2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，然后對目的片段進行切膠回收。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit Fluorometer 檢測定量合格后，對擴增產(chǎn)物進行Illumina MiSeq高通量測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 微潤管出流量隨時間變化規(guī)律

自來水及再生水條件下微潤管出流量隨時間的變化規(guī)律，見圖2。

根據(jù)圖2，自來水水質(zhì)條件下，整個實驗過程中，微潤管出流量緩慢下降，但始終不低于60 mL/h，沒有發(fā)生嚴重堵塞；而在再生水水質(zhì)條件下，隨時間變化微潤管出流量有明顯波動，在前312 h 內(nèi)微潤管出流量緩慢下降，趨勢與自來水工況大致相同，從73 mL/h 下降至63 mL/h 左右，之后直至實驗結(jié)束，微潤管出流量呈現(xiàn)不同幅度的下降趨勢，在第328 h時流量下降率達到25%，之后僅間隔114 h，在442 h時迅速下降至50%，隨后在第926 h 達到75%，第1 134 h 時升至90%，此時微潤管基本完全堵塞。

圖2 兩種水質(zhì)條件下微潤管出流量隨時間變化規(guī)律Fig.2 Variation of discharge of moistube with time under the condition of tap water and reclaimed water quality

根據(jù)圖2，微潤管出流量在不同時段內(nèi)與時間呈現(xiàn)不同的線性關(guān)系，因此在不同時段內(nèi)對其出流量Q與運行時間t進行線性擬合（即Q=ct+d，c、d為擬合常數(shù)），發(fā)現(xiàn)在不同時段內(nèi)，出流量隨時間變化分別呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，見表2。

表2 再生水水質(zhì)條件下微潤管出流量Q與運行時間t的擬合結(jié)果Tab.2 Fitting results of discharge Q and operation time t of moistube under the condition of reclaimed water quality

由表2可知，再生水工況下，微潤管堵塞程度隨時間變化大致分為4 個階段，c值整體呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，試驗開始后的前312 h 階段內(nèi)，c值為-0.782 4，微潤管流量下降幅度不大，堵塞程度增加較為緩慢；隨后在第312～456 h 期間，c值迅速減小為-4.377 0，對微潤管流量影響較大，堵塞程度迅速升高；到第456～696 h 期間，c值增大為-1.236 3，流量變化速度降低，堵塞程度變化趨緩；之后從第696 h 至試驗結(jié)束范圍內(nèi)，c值繼續(xù)增大為-0.882 6，流量下降及堵塞程度趨勢進一步變緩。4 個階段內(nèi)R2位于0.93～0.99 間，證明擬合結(jié)果能夠比較準確說明實際變化。對比結(jié)果說明，再生水灌溉更易導(dǎo)致微潤管堵塞，微潤管出流量變化總體呈現(xiàn)“緩慢下降-急劇下降-緩慢下降”的分段式下降趨勢。

根據(jù)TAYLOR等[12]的研究，引起再生水滴灌灌水器堵塞的原因中，有超過90%是由于沉積在灌水器流道內(nèi)表面的生物膜造成的；而ZHOU 等[13]認為再生水滴灌灌水器附生生物膜特征組分含量與灌水器堵塞程度間存在線性相關(guān)關(guān)系。已有研究發(fā)現(xiàn)[14,15]，由微生物引起的透水介質(zhì)堵塞主要是由其本身及代謝產(chǎn)物（EPS）積累引起的，EPS 在含水介質(zhì)的孔隙中聚集，導(dǎo)致含水層的滲透性大大降低，從而嚴重影響透水效率[16,17]。因此本文認為微潤管堵塞可能主要由微生物及其分泌的EPS 有關(guān)，并對微潤管堵塞程度與EPS 含量相關(guān)性進行分析。

2.2 堵塞程度與胞外聚合物含量相關(guān)關(guān)系分析

EPS 是微生物代謝過程中產(chǎn)生的黏性物質(zhì)，主要由蛋白質(zhì)、多糖、核酸、脂類等組分構(gòu)成，其中蛋白質(zhì)及多糖含量占EPS 總量的70%～80%[18,19]，因此主要考慮多糖及蛋白質(zhì)的含量。微生物數(shù)量及其分泌的黏性EPS 是生物膜生長的基礎(chǔ)，對微潤管管壁生物膜生長及其內(nèi)部堵塞物質(zhì)累計情況有直接影響[20]。再生水工況下，微潤管管壁附生生物膜中多糖含量與堵塞程度的相關(guān)關(guān)系，見圖3。

圖3 微潤管堵塞程度與EPS中多糖質(zhì)量增長的相關(guān)關(guān)系Fig.3 Correlation between the blockage degree of moistube and the quality growth of polysaccharide in EPS

根據(jù)圖3，當(dāng)微潤管生物膜EPS 中多糖含量達到49.91±8.89 μg/cm2時，堵塞程度達到25%，此時管段流量發(fā)生明顯變化；隨著EPS 中多糖含量逐漸增加，堵塞程度不斷增加，當(dāng)EPS 中多糖含量達到150.89±16.48 μg/cm2時，堵塞程度達到90%，導(dǎo)致管段幾乎完全堵塞。

參照再生水為水源的條件下，滴灌系統(tǒng)堵塞研究中較為常用的“S 形曲線”[公式（2）]，表征微潤管灌水器EPS 組分含量與堵塞程度之間的相關(guān)關(guān)系[23-26]。

式中：EC代表微潤管堵塞程度；BC代表EPS 物質(zhì)組分含量；A、B為擬合常數(shù)。

該方程的二階導(dǎo)數(shù)y′′可描述堵塞程度隨堵塞物質(zhì)含量增長速率的變化率，周博等[17]研究滴灌灌水器堵塞程度與附生生物膜組分關(guān)系認為y′′= 0.01 時是曲線的拐點，即增長速率變化的臨界點，據(jù)此可界定為堵塞程度隨堵塞物質(zhì)含量變化的敏感性差異。

根據(jù)“S 形曲線”方程對堵塞程度隨多糖含量增長情況進行擬合，發(fā)現(xiàn)堵塞程度與EPS 中多糖含量存在明顯相關(guān)關(guān)系，擬合方程為擬合度較高，因此認為“S 形曲線”方程可以準確描述堵塞程度隨EPS 中多糖含量增加而增長的趨勢。通過二階函數(shù)求得臨界點堵塞程度為54.16%（以54%計），78.02%（以78%計），結(jié)合圖3可以得出，當(dāng)堵塞程度不超過54%時，堵塞程度隨生物膜中多糖含量增加明顯加重，屬于堵塞程度變化敏感期；當(dāng)堵塞程度達到54%后，堵塞程度隨多糖含量變化敏感性降低；而堵塞程度超過78%后，重新進入敏感期，堵塞程度隨多糖含量變化速率加快。

再生水工況下，微潤管中堵塞程度與EPS 中蛋白質(zhì)質(zhì)量增長的相關(guān)關(guān)系，見圖4。

圖4 微潤管堵塞程度與EPS中蛋白質(zhì)質(zhì)量增長的相關(guān)關(guān)系Fig.4 Correlation between blockage degree of moistube and protein quality growth in EPS

根據(jù)圖4，當(dāng)EPS中蛋白質(zhì)含量達到16.48±0.57 μg/cm2時，堵塞程度達到25%，管段出流量發(fā)生明顯變化；之后堵塞程度隨著EPS中蛋白質(zhì)含量增加而逐漸增大，當(dāng)EPS中蛋白質(zhì)含量達到26.11±1.76 μg/cm2時，堵塞程度達到90%，導(dǎo)致管段幾乎完全堵塞。

根據(jù)“S形曲線”方程對堵塞程度隨蛋白質(zhì)含量增長情況進行擬合，發(fā)現(xiàn)堵塞程度與EPS 中蛋白質(zhì)含量存在明顯相關(guān)關(guān)系，擬合曲線為R2為0.908 4，因此認為“S 形曲線”方程可以準確描述堵塞程度隨EPS 中蛋白質(zhì)含量增長的趨勢。通過二階函數(shù)求得臨界點堵塞程度為61.18%（以61%計），74.46%（以75%計），結(jié)合圖4可以得出，當(dāng)堵塞程度在61 %以下時，EPS 中蛋白質(zhì)含量對堵塞程度影響明顯；堵塞程度在61%～75%時，EPS 中蛋白質(zhì)含量的增加對堵塞程度影響的敏感性減弱；而堵塞程度超過75%時，EPS中蛋白質(zhì)含量稍有增加即會導(dǎo)致微潤管堵塞程度大幅增加。

國內(nèi)外研究顯示介質(zhì)表面附生生物膜會按照微生物生長周期“S 形曲線”的趨勢生長，只是形式會存在一定的差異[27-29]。結(jié)合圖3及圖4發(fā)現(xiàn)，微潤管堵塞程度與EPS 中多糖及蛋白質(zhì)含量變化相關(guān)關(guān)系類似，均整體呈現(xiàn)出“敏感-弱敏感-敏感”的趨勢：在堵塞初期，水流流動速度較快，營養(yǎng)源較為充分，微生物進入快速增長階段后代謝產(chǎn)物增多導(dǎo)致多糖及蛋白質(zhì)含量快速升高，多糖具有的黏性更利于其吸附水中游離的固體小顆粒，進一步加重了微潤管的堵塞，但此時微潤管上空隙較多，多糖及蛋白質(zhì)含量的增加對微潤管出流量下降影響增長較小，當(dāng)堵塞程度超過25%后，多糖及蛋白質(zhì)含量稍有增長即會對出流量造成較大影響；隨著堵塞程度加劇，微潤管中流量大幅縮小，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸缺乏，微生物開始進入衰減期內(nèi)源呼吸階段導(dǎo)致多糖及蛋白質(zhì)含量降解消耗，增長速率減慢，微潤管出流量下降趨勢放緩；進入堵塞末期，部分細菌自溶死亡，胞內(nèi)聚合物溶出導(dǎo)致此階段內(nèi)多糖及蛋白質(zhì)含量升高速率加快，但此階段中微生物的自溶減緩了堵塞程度的加重，導(dǎo)致出流量下降趨勢持續(xù)減慢。綜上所述，微潤管堵塞程度與管壁附生生物膜多糖及蛋白質(zhì)含量間的確存在“S形曲線”相關(guān)關(guān)系，其中多糖含量與堵塞程度之間的相關(guān)性更為密切（R2=0.949），且多糖含量約是蛋白質(zhì)含量的5倍，因此微生物胞外聚合物中多糖的積累是引起微潤管堵塞的主要原因。

2.3 微潤管管壁生物膜微生物群落分析

再生水工況下，微潤管不同堵塞程度時，管壁生物膜在門水平上的物種占比，見圖5。樣本共包括29個細菌門類，其中占比小于0.01的合并為其他門類。

圖5 微潤管微生物種群構(gòu)成分析Fig.5 Analysis of moistube community structure in microtubule

根據(jù)圖5，對50%堵塞程度時（WR50）的管段提取物檢測發(fā)現(xiàn)，此時，管段中微生物主要包括25 個菌門，而堵塞程度達到100%（WR100）時，對管段提取物檢測發(fā)現(xiàn)管段中包含的菌門數(shù)擴大到29 個，可以發(fā)現(xiàn)，隨著微潤管堵塞程度的加重，管段中包含的菌門數(shù)量隨之增大。同時各菌門占比也出現(xiàn)了不同程度的改變，其中改變最明顯的菌門包括變形菌門（Proteo bacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。變形菌門的細菌廣泛存在于自然界中，在好氧和厭氧環(huán)境下均可存活，同時對碳、氮、磷循環(huán)起到重要作用[28,29]，在堵塞程度較嚴重，水中氧含量大幅下降情況下，仍能大量繁殖，在微潤管管壁生物膜群落中占比從WR50時的60.09%大幅上升至WR100時的81.66%；擬桿菌門主要利用多糖作為能源物質(zhì)，堵塞后期EPS 中可利用的多糖含量下降，對其生長繁殖產(chǎn)生不利影響，群落占比從WR50 時的14.39%下降至WR100 時的7.22%；疣微菌門主要為好氧異養(yǎng)菌，缺氧狀態(tài)下與其他菌體競爭中處于劣勢[30]，因此占比從WR50 時的12.88%下降至WR100 時的3.92%。微生物種群構(gòu)成的變化說明隨著堵塞程度的加深，變形菌門微生物更加適應(yīng)變化后的生存，成為管段內(nèi)部微生物中的絕對優(yōu)勢菌門。變形菌門且具有易附著的特性，相比其他菌門能夠分泌更多的EPS，而EPS 在生物膜中充當(dāng)“骨架”結(jié)構(gòu)[31]，使生物膜更易結(jié)合固體顆粒及水中漂浮的微生物，使得微生物從水中游離態(tài)轉(zhuǎn)為附著態(tài)[32]，形成網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)堵塞管道。結(jié)合堵塞程度與胞內(nèi)多糖及蛋白質(zhì)相關(guān)關(guān)系分析，推測隨著微潤管堵塞程度加劇，管段中變形菌門微生物含量逐漸增多，加速產(chǎn)生大量EPS，加劇微潤管堵塞程度。

3 結(jié) 論

本文通過對比在再生水即自來水條件下，微潤管出流量隨時間變化規(guī)律，以及再生水工況下，管段堵塞物質(zhì)中EPS含量隨時間進程累積導(dǎo)致管段堵塞程度的變化，并利用高通量測序技術(shù)，分析微潤管中微生物的種群構(gòu)成及其物種演化過程，探究以再生水為水源時，微潤管內(nèi)部的堵塞現(xiàn)象及其原因。主要結(jié)論如下：

（1）以再生水為水源時，微潤管出流量在為期1 344 h 的整個試驗周期內(nèi)，流量變化總體呈現(xiàn)“緩慢下降-急劇下降-緩慢下降”的進程，試驗開始后流量變化平穩(wěn)，從312 h 開始流量急劇下降，至456 h 時管段堵塞程度迅速增加至50%，之后管段流量變化逐漸趨緩，在第1 344 h微潤管基本完全堵塞。因此應(yīng)在微潤管運行312 h 后對管段及時清理，防止堵塞導(dǎo)致系統(tǒng)流量下降。

（2）以再生水為水源時，微潤管堵塞程度變化規(guī)律與管段堵塞物質(zhì)中多糖及蛋白質(zhì)含量增加規(guī)律存在明顯的相關(guān)關(guān)系，“S 形曲線”方程可以較為準確地說明堵塞程度隨EPS 中多糖及蛋白質(zhì)含量增長的相關(guān)趨勢，整體呈現(xiàn)出“敏感-弱敏感-敏感”的增長趨勢，其中多糖含量與堵塞程度的相關(guān)關(guān)系更為密切。

（3）隨著微潤管堵塞程度的加深，管段內(nèi)微生物種群構(gòu)成變化較大。WR50時占比前三的菌門包括變形菌門、擬桿菌門及疣微菌門，但到WR100 時，擬桿菌門及疣微菌門占比下降，而變形菌門占比增加了21.57%上升至81.66%，成為絕對優(yōu)勢菌門，其大量分泌的EPS 是導(dǎo)致微潤堵塞的重要原因之一。

（4）伴隨著微生物生長周期及群落變化，微潤管管壁生物膜中EPS 含量變化經(jīng)歷從快速增加到緩慢增加再到快速增加的過程，與EPS 導(dǎo)致堵塞程度增加趨勢相似，證明在再生水工況下，微生物是導(dǎo)致微潤管堵塞的關(guān)鍵誘因之一。