王立，李嚴(yán)，岳碧松，陳黎，沈富軍，寇潔，王也，侯蓉，張亮*

（1.四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都大熊貓繁育研究基地,成都 610081;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065;3.四川蜂桶寨國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)中心,四川 雅安 625700）

綠尾虹雉是國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，僅分布在青海、四川、甘肅等省，是高山草甸生態(tài)系統(tǒng)中的傘護(hù)物種（雷富民等，2002；Wang.，2017）。我國于1955年建立了綠尾虹雉圈養(yǎng)種群：北京動(dòng)物園、北京瀕危動(dòng)物馴養(yǎng)繁殖中心等多家單位曾在綠尾虹雉人工孵化、育雛等技術(shù)上取得了多項(xiàng)突破（程彩云等，1996；陳冬梅等，2015），然而最終大部分圈養(yǎng)種群都消失了。國內(nèi)譜系上現(xiàn)存的綠尾虹雉繁育機(jī)構(gòu)僅剩四川寶興蜂桶寨國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)1家。

目前圈養(yǎng)綠尾虹雉種群繁殖的雌雄配比為1只雄鳥配1～2只雌鳥（張敬等，2019）。由于配種過程中存在更換雄鳥的現(xiàn)象，1只雌鳥在一個(gè)繁殖期內(nèi)產(chǎn)蛋的父本可能來自多只雄鳥。此外，由于繁殖期多只雌鳥混合飼養(yǎng)，雌鳥產(chǎn)蛋期交錯(cuò)，無個(gè)體特定產(chǎn)蛋位，管理者無法對(duì)同一間鳥舍的鳥蛋進(jìn)行母本精準(zhǔn)識(shí)別（楊本清等，2011），更無法推斷其父本，由此導(dǎo)致了錯(cuò)誤的親緣關(guān)系記錄，給未來種群內(nèi)近交埋下隱患，因此開展綠尾虹雉的親緣關(guān)系鑒定非常必要。

常見的用于親緣關(guān)系鑒定的遺傳標(biāo)記有微衛(wèi)星標(biāo)記（Visscher.，2002）和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（周子文等，2021）等。微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常成熟，并在多種瀕危動(dòng)物的親子鑒定中進(jìn)行了廣泛應(yīng)用，如大熊貓（張志和等，2003）、小熊貓（陳玲等，2020）等。如何從大基因組中識(shí)別微衛(wèi)星，并從龐大的結(jié)果數(shù)據(jù)集中篩選微衛(wèi)星進(jìn)行引物設(shè)計(jì)仍然是一個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)問題。

早期微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選采用磁珠富集法（沈富軍等，2005），但耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低。隨著生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，學(xué)者們從基因組中直接獲取微衛(wèi)星位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，將設(shè)計(jì)出的上、下游引物分別比對(duì)到參考基因組上，利用大型數(shù)據(jù)庫如NCBI、UCSC和ENSEMBL，基于BLAST功能查看引物特異性。引物合成后，經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。目前基于生物信息數(shù)據(jù)庫比對(duì)的分析方法并不能解決微衛(wèi)星引物3’端堿基唯一性以及預(yù)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物豐富度的問題。成都大熊貓繁育研究基地開發(fā)的微衛(wèi)星PCR引物特異性鑒定程序（specific PCR production prediction，SPE）（李嚴(yán)等，2021）基于上、下游引物序列在基因組中進(jìn)行條件匹配，并根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行引物特異性評(píng)估，不僅將極大地降低前期篩選工作量，也能很好地排除微衛(wèi)星引物存在的特殊多位點(diǎn)擴(kuò)增（多PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度接近）問題。

目前還沒有綠尾虹雉特異性微衛(wèi)星分子標(biāo)記的公開發(fā)布。在缺乏物種特異性分子標(biāo)記的情況下，鳥類保護(hù)遺傳學(xué)研究常采用近緣物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行交叉擴(kuò)增分析，如從來自雉科Phasianidae的多種屬58個(gè)位點(diǎn)中篩選4種8個(gè)近源鳥類微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)黃腹角雉進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析（劉園園，2012）等。但某些雉科鳥類間微衛(wèi)星交叉擴(kuò)增率不高（曹露莎等，2008；劉園園，2012）?？紤]到親緣關(guān)系鑒定對(duì)分子標(biāo)記的高要求，本研究針對(duì)綠尾虹雉進(jìn)行了物種特異性微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)與篩選。

本研究首次在微衛(wèi)星篩選過程中，應(yīng)用SPE軟件進(jìn)行特殊多位點(diǎn)擴(kuò)增排查，同時(shí)對(duì)經(jīng)典微衛(wèi)星方法篩選的位點(diǎn)情況進(jìn)行了驗(yàn)證分析，最后得到的12對(duì)穩(wěn)定性高、多態(tài)信息含量豐富的引物，并在綠尾虹雉同圈舍鳥蛋親緣關(guān)系的鑒定中進(jìn)行了成功應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

采集2018—2019年四川蜂桶寨國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)綠尾虹雉圈養(yǎng)種群6個(gè)圈舍蛋殼樣品15份（孵化后蛋殼12份，死胎蛋殼3份）、野外救護(hù)個(gè)體的羽毛樣品3份，合計(jì)18份樣品（表1）。

表1 綠尾虹雉樣品采集表Table 1 Sample collecting of Lophophorus lhuysii

DNA提取采用血液/組織提取試劑盒（Qiagen，Germany），詳細(xì)步驟參考說明書。樣品中的DNA濃度用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）測(cè)定，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.2 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)與多態(tài)性驗(yàn)證

利用Krait（Du.，2017）在綠尾虹雉基因組（崔凱，岳碧松，2018）中進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選，隨機(jī)選取大量微衛(wèi)星位點(diǎn)，合并成上、下游普通引物。

隨機(jī)選取3個(gè)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為10 μL，反應(yīng)混合物含10～20 ng DNA，1 μL 10×Taq緩沖液，0.2 μL dNTP混合 0.1μL Taq DNA聚 合 酶 ，引 物 各 0.2 μL（10 μmol·L），0.8 μL 25 mmol·LMgCl，加水至終體積。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，70 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶清晰的微衛(wèi)星位點(diǎn)，合成熒光引物，再進(jìn)一步檢測(cè)位點(diǎn)的多態(tài)性和穩(wěn)定性。

將最后篩選出的引物，應(yīng)用到18份綠尾虹雉DNA樣品中進(jìn)行基因分型。為了確保分型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，所有PCR均進(jìn)行3次重復(fù)，基因分型在生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.3 引物特異性評(píng)估

SPE軟件（李嚴(yán)等，2021）的參數(shù)設(shè)置為：3’端完全匹配堿基數(shù)目為10，模擬PCR產(chǎn)物的最大長(zhǎng)度為3 000 bp，運(yùn)行軟件獲得引物特異性評(píng)估文件：上游引物ID、上游引物所在染色體編號(hào)、上游引物起始基因組位置、上游引物終止基因組位置、上游引物匹配鏈的方向、下游引物ID、下游引物所在染色體編號(hào)、下游引物起始基因組位置、下游引物終止基因組位置、下游引物匹配鏈的方向和預(yù)測(cè)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用 Cervus3.0（Kalinowski.，2007）對(duì)得到的分型數(shù)據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)聯(lián)合非親排除概率、聯(lián)合同胞排除概率、各等位基因雜合度及多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（0＜PIC＜0.25為低度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)，0.5＜PIC＜1為高度多態(tài)；Botstein.，1980）；利用ML-Relate（Kalinowski.，2006）計(jì)算15份蛋殼DNA樣品的同胞關(guān)系。將分析結(jié)果與《2020年中國動(dòng)物園協(xié)會(huì)綠尾虹雉譜系簿》（內(nèi)部資料）進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

對(duì)綠尾虹雉基因組上微衛(wèi)星序列的搜索和統(tǒng)計(jì)結(jié)果與崔凱和岳碧松（2018）的一致。隨機(jī)選取三堿基及以上重復(fù)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了274對(duì)普通引物序列（三堿基86對(duì)、四堿基72對(duì)、五堿基116對(duì)），退火溫度統(tǒng)一設(shè)置為56℃。引物合成后對(duì)隨機(jī)選取的3份綠尾虹雉DNA樣品進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行引物初篩，得到93個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上合成93對(duì)熒光引物，在6份DNA樣品中進(jìn)行PCR擴(kuò)增及基因分型，進(jìn)一步篩選得到13對(duì)引物。其中，引物CM3227基因分型圖上，stutter峰值顯示偏高（圖1）。

圖1 2種基因分型的stutter峰Fig.1 Two types of stutter in genotype

排除了初步擴(kuò)增失敗的引物后，對(duì)212對(duì)微衛(wèi)星引物序列利用SPE進(jìn)行分析（表2）。除去11個(gè)堿基及以上匹配的多位點(diǎn)擴(kuò)增標(biāo)記，共篩選出的10個(gè)堿基匹配的分子標(biāo)記為122個(gè)。

表2 212對(duì)微衛(wèi)星引物的多位點(diǎn)擴(kuò)增情況分析Table 2 Analyze of multiple amplification of 212 pairs of SSR primers

篩選出的13對(duì)引物對(duì)的SPE分析數(shù)據(jù)顯示，CM3227在基因組上存在特殊多位點(diǎn)擴(kuò)增（172 bp、173 bp）（表3），因此，分型圖中異常的stutter峰其實(shí)反應(yīng)的是多位點(diǎn)擴(kuò)增的另一PCR產(chǎn)物。此外，用經(jīng)典方法篩選出來的其他12對(duì)位點(diǎn)均不具有11個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配。

表3 引物CM3227特殊多位點(diǎn)擴(kuò)增Table 3 Specific multiple amplification of CM3227

12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在18份綠尾虹雉DNA樣品中的基因多態(tài)性分析結(jié)果顯示，觀察雜合度為0.278～0.941，期望雜合度為0.303～0.797，平均PIC為0.428 2；其中，8個(gè)位點(diǎn)（0.25＜PIC＜0.5）屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)，4個(gè)位點(diǎn)（PIC＞0.5）屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)；標(biāo)記組合的聯(lián)合同胞排除概率為0.998 4（表4）。

表4 綠尾虹雉12 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性特征Table 4 Polymorphic characteristics of 12 microsatellite loci in Lophophorus lhuysii

對(duì)蛋殼樣品進(jìn)行同胞關(guān)系（全胞、半同胞）計(jì)算（表5）：5組為譜系記錄的全胞關(guān)系，1組在譜系中無完整記錄。經(jīng)鑒定，3組同胞關(guān)系與譜系記錄完全一致；1組（2份樣品）內(nèi)個(gè)體無同胞關(guān)系；1組（3份樣品）內(nèi)2只存在全胞關(guān)系，另一只與其余2只無親緣關(guān)系；另鑒定出了1組（2份樣品）內(nèi)的全胞關(guān)系。

表5 15只綠尾虹雉的同胞關(guān)系鑒定Table 5 Kinship testing for 15 Lophophorus lhuysii from 6 groups

3 討論

采用生物信息學(xué)的方法從基因組中開發(fā)微衛(wèi)星位點(diǎn)的技術(shù)手段已經(jīng)十分成熟（Warren.，2010；Zhan.，2013；Hou.，2018）。經(jīng)典篩選流程在前期會(huì)設(shè)計(jì)大量引物，后期經(jīng)PCR、瓊脂糖凝膠電泳及基因分型等方式對(duì)引物進(jìn)行逐步篩選。多位點(diǎn)擴(kuò)增是微衛(wèi)星引物在應(yīng)用時(shí)最常見的問題之一，是導(dǎo)致設(shè)計(jì)出的引物高淘汰率的主要原因。以本研究為例，PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)典方法初期篩選率為33.9%（93/274），淘汰率近70%。本研究引入SPE軟件進(jìn)行引物特異性分析，旨在針對(duì)引物多位點(diǎn)擴(kuò)增現(xiàn)象進(jìn)行篩選。數(shù)據(jù)顯示，SPE介入后的初期篩選率達(dá)到57.5%（122/212），接近經(jīng)典方法的2倍，可以預(yù)見，在項(xiàng)目前期引入SPE軟件進(jìn)行特異性篩選，將節(jié)約近一半的時(shí)間及測(cè)試成本。

此外，SPE介入分析方法的特殊之處還在于：篩選剔除PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度接近的特殊多位點(diǎn)擴(kuò)增。在微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用中，有一種特殊多位點(diǎn)擴(kuò)增值得警惕，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段差異極小，無法用瓊脂糖凝膠電泳或基因分型的方法進(jìn)行鑒別。此類標(biāo)記在應(yīng)用中，容易形成分型數(shù)據(jù)的誤讀，從而降低標(biāo)記體系整體的準(zhǔn)確率。SPE軟件分析可以對(duì)此風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行規(guī)避，如本研究就從經(jīng)典方法篩選后的13對(duì)引物中剔除了1對(duì)引物，該引物的2個(gè)PCR產(chǎn)物片段間僅有1個(gè)堿基的差異。

數(shù)據(jù)顯示，設(shè)計(jì)出的大量綠尾虹雉微衛(wèi)星引物在基因組上存在10個(gè)堿基及以上匹配的多位點(diǎn)擴(kuò)增現(xiàn)象（78.8%），但11個(gè)堿基及以上位點(diǎn)匹配的多位點(diǎn)擴(kuò)增現(xiàn)象銳減（21.2%）。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格控制PCR條件（如溫度、Mg濃度等）可降低大量10堿基匹配的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，不具有11個(gè)堿基及以上多位點(diǎn)匹配可作為進(jìn)行SPE多位點(diǎn)擴(kuò)增篩選的基本條件。

瀕危野生動(dòng)物數(shù)量稀少，且動(dòng)物管理者責(zé)任大，樣品采集非常困難，其中血液采集的難度最大。綠尾虹雉應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)，特殊情況下，采血甚至可能誘發(fā)個(gè)體死亡，一般不進(jìn)行個(gè)體采血。與血液相比，蛋殼與羽毛的DNA含量相對(duì)較少，且提取出的DNA常存在一定程度的降解，若以其為模板，則所應(yīng)用的分子標(biāo)記需要能在相對(duì)質(zhì)量較低的基因組DNA中穩(wěn)定擴(kuò)增。本研究開發(fā)的12對(duì)引物穩(wěn)定性高、多態(tài)信息含量豐富，在蛋殼及羽毛DNA中擴(kuò)增效率高、穩(wěn)定性好，解決了綠尾虹雉采樣難、相關(guān)親緣關(guān)系研究長(zhǎng)期受制的局面。

應(yīng)用以上12對(duì)引物，對(duì)采集到的18只綠尾虹雉樣品進(jìn)行多樣性分析，3只野外救護(hù)個(gè)體的平均PIC為0.373，15只圈養(yǎng)個(gè)體的為0.406，整體為0.401。劉園園（2012）用8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)黃腹角雉圈養(yǎng)種群77只個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，其平均PIC為0.619。貝永建（2014）用12對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)黑頸長(zhǎng)尾雉天峨縣種群16只個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，其平均PIC為0.234。本研究與其他雉類相比，PIC值偏低，這可能與樣品數(shù)量較少，且多個(gè)樣本間親緣關(guān)系較近有關(guān)。

受采樣限制，本研究未能獲取到鑒定個(gè)體對(duì)應(yīng)的父母本材料，因此只做了同胞關(guān)系分析。結(jié)果顯示，目前綠尾虹雉記錄中存在一定的錯(cuò)誤，提示需要開展種群內(nèi)親緣關(guān)系鑒定。本研究開發(fā)的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記可進(jìn)一步應(yīng)用于綠尾虹雉親子關(guān)系的鑒定。開展綠尾虹雉圈養(yǎng)種群遺傳管理，對(duì)提高小種群的維持能力，盡可能保持種群遺傳多樣性具有重要意義。

感謝陳玲、吳里霞在實(shí)驗(yàn)部分所提供的幫助。感謝James Edward Ayala潤(rùn)色英文摘要。