楊朝杰，高強(qiáng)，劉丹，聶苗苗，王發(fā)艷，李柯懋，趙宏，張存芳*，祁得林*

（1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,西寧 810016;3.青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,西寧 810012;4.青海多美生態(tài)環(huán)?？萍加邢薰?西寧 810003）

軟刺裸裂尻魚(yú)屬鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae裂腹魚(yú)亞科Schizothoracinae裸裂尻魚(yú)屬，屬高原冷水性魚(yú)類，主要分布于青藏高原長(zhǎng)江水系上游寬谷河段或海拔較高的河流中，跨流域擴(kuò)散能力較弱、生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢，與其他裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類具有相同特點(diǎn)；該物種為產(chǎn)區(qū)內(nèi)主要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類（武云飛，1992；丁瑞華，1994；He&Chen，2007）。氣候變化、棲息地破壞和人類活動(dòng)等因素限制了種群的發(fā)展（祁得林，2009；王太等，2017）。因此，開(kāi)展軟刺裸裂尻魚(yú)保護(hù)生物學(xué)研究，對(duì)其種群管理和恢復(fù)具有重要意義。

目前，軟刺裸裂尻魚(yú)的相關(guān)研究集中在仔魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育、年齡鑒定、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等方面（Yu，2006；沈丹舟等，2007；胡睿等，2012），遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道較少，且集中在金沙江和雅礱江水系的種群。mtDNA具有進(jìn)化速度較快、嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn)（Avise&Ferguson，1995），在種群遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)地理學(xué)等方面的研究中得到廣泛應(yīng)用（Levin，2017；Biun，2021；Parmaksiz，2021）。Liu等（2009）采用mtDNA控制區(qū)序列分析了寶興裸裂尻魚(yú)的遺傳多樣性。Li等（2020）采用微衛(wèi)星和mtDNA控制區(qū)序列聯(lián)合分析了沙魯里山脈金沙江和雅礱江軟刺裸裂尻魚(yú)的系統(tǒng)地理學(xué)。長(zhǎng)江上游通天河段干流及支流的軟刺裸裂尻魚(yú)野生群體的種群結(jié)構(gòu)情況等未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)mtDNA控制區(qū)序列分析了玉樹(shù)軟刺裸裂尻魚(yú)的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)，為其資源管理和保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

軟刺裸裂尻魚(yú)樣品于2019年9月采自青海省玉樹(shù)藏族自治州隆寶灘國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（LBT）、巴塘河上游（UBR）和巴塘河下游（LBR），共3個(gè)種群72尾。野外采樣時(shí)使用掛網(wǎng)和地籠進(jìn)行捕撈，隨機(jī)挑選體質(zhì)量、體長(zhǎng)相近的個(gè)體，LBT的平均體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別為33 cm、424 g，UBR的平均體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別為23 cm、95 g，LBR的平均體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別為21 cm、74 g。每個(gè)樣品取肌肉或鰭組織2 g置于無(wú)水乙醇中固定保存后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

圖1 青海玉樹(shù)軟刺裸裂尻魚(yú)采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of Schizopygopsis malacanthus in Yushu,Qinghai

利用酚-氯仿法從肌肉或鰭組織中提取mtDNA，D-loop序列擴(kuò)增引物為：GEDL200：5’-CACCCCTGGCTCCCAAAGCCAG-3’；GEDH860 5’-AGGGGTTTGACAAGAATAACAGGA-3’（Zhao，2011），由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。25μL PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，10 mmol·L的2 條引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，雙蒸水 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95℃30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；最后72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程技術(shù)公司純化并測(cè)序，測(cè)序引物為擴(kuò)增引物。所有單倍型序列提交至Gen-Bank（登錄號(hào)為：OL870962～OL870977）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNASTAR和DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)（Burland，2000），用MAFFT進(jìn)行多序列比對(duì)（Katoh&Standley，2013），使用MEGA11.0計(jì)算核苷酸組成，以同亞科的瀾滄裂腹魚(yú)、厚唇裸重唇魚(yú)、青海湖裸鯉、花斑裸鯉、拉薩裸裂尻魚(yú)、溫泉裸裂尻魚(yú)、黃 河 裸 裂 尻 魚(yú)、前腹裸裂尻魚(yú)為外群，基于鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Tamura，2021），自舉檢驗(yàn)1 000次。利用DnaSP 6.0分析每個(gè)地理種群的單倍型數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、種群間凈遺傳距離和核苷酸錯(cuò)配分布（Rozas，2003）。利用Arlequin計(jì)算群體間的遺傳分化指數(shù)（F）、估計(jì)群體內(nèi)遺傳變異情況，計(jì)算基因流［=（1/F-1）/2］（Hudson.，1992）；進(jìn)行Tajima’s和Fu’s中性檢驗(yàn)（Tajima，1989；Fu，1997；Excoffier& Lischer，2010）。利用Popart基于中接法（median-joining）繪制單倍型最小網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（Leigh&Bryant，2015）。

2 結(jié)果

2.1 序列特征

獲得同源序列的最終長(zhǎng)度為610 bp，包含29個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)（簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)26個(gè)、單突變位點(diǎn)3個(gè)）。D-loop序列A、T、C、G堿基平均含量分別為32.8%、32.1%、19.3%、15.9%，A+T含量（64.9%）明顯高于G+C含量（35.2%）。

2.2 遺傳多樣性和單倍型分布

軟刺裸裂尻魚(yú)3個(gè)地理種群基于mtDNA D-loop序列的單倍型多樣性為0.438～0.676，核苷酸多樣性為0.003 4～0.008 6。其中，LBT的單倍型多樣性最高（0.676±0.076），UBR的核苷酸多樣性最高（0.008 6±0.001 3）（表1）。共檢測(cè)到16個(gè)單倍型，其中，H10由UBR和LBR共享，H8在UBR中出現(xiàn)次數(shù)最多，H4在LBR中出現(xiàn)次數(shù)最多，H2在LBT中出現(xiàn)次數(shù)最多（圖2）。

表1 軟刺裸裂尻魚(yú)樣本信息及遺傳多樣性指數(shù)Table 1 Sample information and genetic diversity index of Schizopygopsis malacanthus

2.3 種群分化與分子系統(tǒng)發(fā)育

LBR與LBT間的遺傳距離最遠(yuǎn)（0.023 3）；UBR與LBR間的最近（0.002 1）。3個(gè)種群間的為0.087 3～1.465 3，UBR 與LBR的為 1.465 3，UBR、LBR與LBT的分別為0.108 0和0.087 3。UBR與LBR的F最低（0.254 4）；UBR、LBR與LBT的分別為0.822 4和0.851 4；兩兩群體之間均呈現(xiàn)極顯著差異（表2）。

表2 軟刺裸裂尻魚(yú)種群間遺傳分化系數(shù)（對(duì)角線下）及種群間凈遺傳距離（對(duì)角線上）Table 2 The fixation index（below diagonal）and net genetic distance（above diagonal）between Schizopygopsis malacanthus populations

將軟刺裸裂尻魚(yú)看做一個(gè)地理種群時(shí)，79.49%的遺傳變異位于不同采樣點(diǎn)的種群間，20.51%的遺傳變異位于種群內(nèi)，且群體間遺傳分化差異極顯著（F=0.794 9；＜0.001）。按照水系分組，不同組間的遺傳變異占74.40%，組內(nèi)群體間的遺傳變異占8.05%，不同群體內(nèi)的遺傳變異占17.55%（表3）。

表3 軟刺裸裂尻魚(yú)單倍型的分子變異等級(jí)分析Table 3 Hierarchical analysis of molecular variance of haplotypes of Schizopygopsis malacanthus

單倍型序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，軟刺裸裂尻魚(yú)3個(gè)種群的單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上大體分為2支，分別對(duì)應(yīng)隆寶灘國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和巴塘河水系（圖2）。中接法構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，相鄰2個(gè)單倍型之間經(jīng)過(guò)1～5步突變，巴塘河水系2個(gè)種群的單倍型呈混雜分布，2個(gè)種群之間存在共享單倍型，與LBT之間沒(méi)有共享單倍型（圖3）。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析。

圖2 3個(gè)軟刺裸裂尻魚(yú)種群16個(gè)D-loop單倍型的NJ樹(shù)及在其中的分布Fig.2 NJ tree of 16 D-loop haplotypes and haplotype distribution among 3 Schizopygopsis malacanthus populations

圖3 軟刺裸裂尻魚(yú)mtDNA D-loop序列單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Haplotype network of mtDNA D-loop sequence of Schizopygopsis malacanthus

2.4 種群擴(kuò)張

Tajima’s和Fu’s結(jié)果顯著性檢驗(yàn)差異均不顯著（表4），核苷酸錯(cuò)配分布曲線均顯示為多峰（圖4）。

圖4 軟刺裸裂尻魚(yú)群體錯(cuò)配分布曲線Fig.4 Mismatch distribution of the Schizopygopsis malacanthus

表4 軟刺裸裂尻魚(yú)中性檢驗(yàn)Table 4 Neutral test of the 3 Schizopygopsis malacanthus populations

3 討論

種群遺傳學(xué)分析表明，分布于青海省玉樹(shù)州隆寶灘國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和巴塘河水系的軟刺裸裂尻魚(yú)3個(gè)種群的D-loop序列均表現(xiàn)出明顯的AT偏倚，與其他裂腹魚(yú)類的研究結(jié)果相似（張爭(zhēng)世等，2017）；單倍型多樣性和核苷酸多樣性比寶興裸裂尻魚(yú)遺傳多樣性豐富，這可能與現(xiàn)存種群大小有關(guān)（Liu，2009）；整體低于同亞科魚(yú)類塔里木裂腹魚(yú)和齊口裂腹魚(yú)，也低于其他鯉科魚(yú)類（Perdices，2004；海薩·艾也力汗等，2016；張爭(zhēng)世等，2017），可能是由于第四紀(jì)以來(lái)青藏高原經(jīng)歷了多次地質(zhì)和氣候變化，這些環(huán)境變化可能使高原魚(yú)類經(jīng)歷了數(shù)次瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致群體內(nèi)遺傳變異丟失，該結(jié)論與同亞科黃河裸裂尻魚(yú)及青海湖附近水系中裸鯉的研究結(jié)果一致（Zhao，2005；Qi，2007）。在本研究的3個(gè)地理種群中，LBT的單倍型多樣性最高，核苷酸多樣性低于其他2個(gè)種群，可能是長(zhǎng)期的地理隔離導(dǎo)致種群數(shù)量減小引起遺傳漂變，使遺傳多樣性降低；LBR的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較低，巴塘河下游靠近玉樹(shù)市區(qū)，可能與棲息環(huán)境發(fā)生改變、人類活動(dòng)影響有關(guān)。

LBT和巴塘河水系2個(gè)群體之間的F值較高，表明LBT和其他2個(gè)群體之間的遺傳分化較大，形成了顯著的地理結(jié)構(gòu)，該結(jié)果得到種群間凈遺傳距離和基因流分析的支持。盡管巴塘河水系上、下游2個(gè)種群之間也具有顯著的遺傳分化，但是巴塘河水系2個(gè)種群之間的＞1，2個(gè)種群之間具有較低的凈遺傳距離，暗示這2個(gè)種群基因交流廣泛；AMOVA分析顯示，無(wú)論將軟刺裸裂尻魚(yú)看做一個(gè)地理種群，還是按照不同水系分組分析，都表明軟刺裸裂尻魚(yú)的遺傳變異主要來(lái)自不同地理種群之間，而不是種群內(nèi)；3個(gè)軟刺裸裂尻魚(yú)種群按照隆寶灘國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和巴塘河水系形成2個(gè)類群，巴塘河水系2個(gè)種群之間未形成明顯的地理種群結(jié)構(gòu)，單倍型NJ樹(shù)和進(jìn)化關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析也支持這一結(jié)果。地質(zhì)資料表明，斷裂帶走滑運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致玉樹(shù)地區(qū)古河流改向，隆寶灘周圍地區(qū)形成分水嶺，中心區(qū)域形成斷陷盆地，從而形成現(xiàn)今巴塘河水系，并且在隆寶灘國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)與巴塘河之間形成天然地理屏障（李躍華等，2013；吳中海等，2014；于洋等，2018）。如果群體處于擴(kuò)張狀態(tài)或經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張事件，其非重組DNA區(qū)域錯(cuò)配分布曲線為平滑單峰曲線（Harpending，1994）；軟刺裸裂尻魚(yú)的種群擴(kuò)張分析表明，玉樹(shù)軟刺裸裂尻魚(yú)在近期歷史上群體大小保持穩(wěn)定，未經(jīng)歷顯著的種群擴(kuò)張事件。

本研究結(jié)果表明，軟刺裸裂尻魚(yú)3個(gè)種群整體遺傳多樣性均較低，而由于LBT和巴塘河水系上、下游2個(gè)種群之間存在顯著的遺傳分化，建議將巴塘河水系上、下游2個(gè)種群和LBT作為2個(gè)進(jìn)化顯著單元分開(kāi)進(jìn)行管理保護(hù)。