劉寶玲，楚品品，李春玲，楊冬霞，蔣智勇，張昆麗，宋 帥,勾紅潮，蔡汝健

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510225)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，能引起多種疾病，嚴(yán)重時(shí)能引起人和豬的死亡，屬于危害較大的傳染性人獸共患病原[1]。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展及抗生素的不規(guī)范使用，豬鏈球菌的耐藥情況日趨嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)豬行業(yè)及公共衛(wèi)生造成重大威脅[2]。

四環(huán)素類抗生素是常用的廣譜抗生素，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的感染,是治療豬鏈球菌病最有效的抗生素之一[3]，2020年之前畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，四環(huán)素常被用作抗菌促生長(zhǎng)劑[4-5]。四環(huán)素(tetracycline)、多西環(huán)素(doxycycline)和米諾環(huán)素(minocycline)都是臨床常用四環(huán)素類抗生素，長(zhǎng)期使用導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥性情況嚴(yán)峻。Hoa等[6]報(bào)道1997-2008年間從越南成年人腦脊液中分離的175株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性達(dá)到91%，黃文明等[7]報(bào)道了2010-2012年間廣東地區(qū)分離的豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥率高達(dá)98.2%。

四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制主要為藥物外排和核糖體保護(hù)及滅活或鈍化四環(huán)素酶[8-9]，四環(huán)素耐藥基因多達(dá)四十多種，包括編碼外排泵的基因、編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因及編碼滅活酶的基因[10-13]。細(xì)菌可通過獲得編碼相關(guān)蛋白的耐藥基因產(chǎn)生耐藥性[4,14]，耐藥基因的水平傳播被認(rèn)為是細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥的重要原因之一[15-16]。四環(huán)素類抗生素對(duì)豬鏈球菌耐藥機(jī)制包括：①由tetL、tetB、tetK或tet(40)基因介導(dǎo)的外排泵機(jī)制；②由tetO、tetM、tetS、tetW、tet(O/W/32/O)或tet(O/32/O)基因編碼核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制[17]。Chen等[18]分離得到的豬鏈球菌中攜帶的耐藥基因主要為tetM、tetO、tet(O/W/32/O)、tet(O/32/O)、tetS、tetW、tetL、tet(40)；Petrocchi-Rilo等[19]報(bào)道西班牙分離的207株豬鏈球菌中有84.1%的菌株含耐藥基因tetO。

因此，了解細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥性及耐藥基因的攜帶情況對(duì)疾病的臨床用藥具有十分重要的意義。為了解廣東地區(qū)分離的豬鏈球菌對(duì)部分四環(huán)素類抗生素的耐藥情況及耐藥基因的攜帶情況，本研究調(diào)查了近幾年來廣東分離的34株豬鏈球菌對(duì)3種臨床常用四環(huán)素類抗生素的耐藥性，并分析了6種四環(huán)素耐藥基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX的攜帶情況，以期對(duì)臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2016-2020年從廣東不同地區(qū)分離的豬鏈球菌34株，其中9型鏈球菌19株，2型鏈球菌15株，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病研究室，菌株具體來源信息如表1所示。

表1 豬鏈球菌菌株來源信息

1.1.2 主要試劑與儀器 四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司)；2×PremixTaq、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；新生牛血清(廣州蕊特生物技術(shù)有限公司)。恒溫箱(PYX-DHS500,中國(guó)上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZWYR-2101C,中國(guó)上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將凍存的細(xì)菌劃線接種于TSA平板上，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑取單個(gè)菌落接種于TSB，于37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h(本試驗(yàn)所使用的TSB、TSA均加入了5%已滅活的新生牛血清)。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測(cè)34株豬鏈球菌對(duì)3種四環(huán)素類抗生素的敏感性。取200 μL菌液，用無菌棉拭子均勻涂布在TSA平板上，然后用無菌鑷子夾取藥敏紙片，將其貼在平板表面，將平板放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑及所使用的藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 K-B試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 參照黃文明等[7]、王學(xué)君等[20]、關(guān)琳等[21]設(shè)計(jì)耐藥基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO、tetX引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表3。

表3 引物信息

1.2.4 耐藥基因檢測(cè) 將細(xì)菌接種于TSB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫箱中振蕩培養(yǎng)12 h，收集細(xì)菌，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。用上述6種引物將提取的34株豬鏈球菌的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，將PCR檢測(cè)陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqMix 12.5 μL,DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表3)30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 34株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的敏感性檢測(cè)結(jié)果

34株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的耐藥率見表4。由表4可知，34株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高，為100%(34/34)，其次為米諾環(huán)素82.4%(28/34)、多西環(huán)素47.1%(16/34)。

表4 豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的敏感性

2.2 耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

34株豬鏈球菌中，tetA、tetC、tetD、tetX基因PCR檢出率均為0；tetO和tetM基因PCR檢出率分別為100%(34/34)和14.7%(5/34)，且5株檢出tetM基因的菌株均為2型。tetO和tetM基因擴(kuò)增片段大小分別為515和406 bp(圖1、2)，與預(yù)期結(jié)果相符，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。

表5 34株豬鏈球菌耐藥基因的攜帶情況

①A，2016-2017年樣品；B，2018-2020年樣品。②M，DL2000 DNA Marker；1～17，樣品；18，陰性對(duì)照。圖2同

PCR產(chǎn)物測(cè)序所得的核苷酸序列在NCBI上在線BLAST，結(jié)果顯示，與tetO基因核苷酸序列相似性最高的為D16-010262(MT383669.1，99.58%)，與基因tetM核苷酸序列相似性最高的為豬鏈球菌NJ3(CP082203.1，100%)。

圖2 tetM基因的PCR結(jié)果

2.3 34株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥基因和耐藥表型分析

各菌株的耐藥情況見表6。由表6可知，34株豬鏈球菌至少對(duì)1種四環(huán)素類抗生素耐藥，3重耐藥菌株有15株，占比44.1%(15/34)，其中9型豬鏈球菌10株，占比29.4%(10/34)，2型豬鏈球菌5株，占比14.7%(5/34)；2重耐藥菌株14株，占比41.1%(14/34)，其中9型豬鏈球菌9株，占比26.5%(9/34)，2型豬鏈球菌5株，占比14.7%(5/34)；只耐1種藥物的5株，占比14.7%(5/34)，5株全部為2型鏈球菌。2或3重耐藥菌株中9型豬鏈球菌為19株，占比55.9%(19/34)，2型豬鏈球菌10株，占比29.4%(10/34)，說明多重耐藥菌株中9型豬鏈球菌比例較高。2重耐藥菌株中耐四環(huán)素和米諾環(huán)素有13株，占比38.2%(13/34)，只有1株菌耐四環(huán)素和多西環(huán)素。

表6 豬鏈球菌耐藥情況統(tǒng)計(jì)

各菌株的耐藥基因攜帶情況見表7。由表7可知，同時(shí)攜帶tetO和tetM基因的菌株有5株，占比14.7%(5/34)，這5株菌全部為2型豬鏈球菌；單獨(dú)攜帶tetO基因的菌株有29株，占比85.3%(29/34)。

表7 各菌株的耐藥基因攜帶情況

3 討 論

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，并帶來嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全[22]?？股刈鳛橹委熦i鏈球菌的首選方法，常在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，但抗生素的廣泛應(yīng)用及不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來了困難。

四環(huán)素類抗生素是養(yǎng)殖業(yè)最常用的抗生素之一，耐藥情況也較為嚴(yán)峻。Arndt等[23]報(bào)道了加拿大安大略豬場(chǎng)分離的豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性達(dá)84.2%；Ichikawa等[24]研究發(fā)現(xiàn),日本東海地區(qū)的豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性為80.7%；Yongkiettrakul等[1]研究報(bào)道泰國(guó)不同地區(qū)豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素類藥物的普遍耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)從廣東不同地區(qū)分離得到的34株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為100%(34/34)、82.4%(28/34)和47.1%(16/34)，說明廣東地區(qū)的豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素類耐藥情況非常嚴(yán)重，僅有多西環(huán)素有較好的治療效果，但其耐藥率也已接近50%，因此臨床用藥時(shí)應(yīng)盡量減少或謹(jǐn)慎使用該類抗生素。本研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類藥物2或3重耐藥較為常見，34株豬鏈球菌中3重耐藥菌株占比達(dá)到44.1%(15/34)，2重耐藥菌株占比41.1%(14/34)，耐1種藥物的菌株占比14.7%(5/34)。本研究中多重耐藥菌株中9型豬鏈球菌比例較高，高達(dá)58.8%(20/34)，說明9型豬鏈球菌更容易造成耐藥，其機(jī)理尚未清楚，需進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制主要為藥物外排、核糖體保護(hù)及滅活或鈍化四環(huán)素酶等機(jī)制[5]，由不同tet耐藥基因決定。國(guó)內(nèi)外對(duì)豬鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的研究表明，tetO是豬鏈球菌中最常見的耐藥基因[17,25]。Aradanas等[26]研究報(bào)道了2013-2018年間分離的豬鏈球菌主要攜帶的耐藥基因?yàn)閠etO。Tan等[27]研究表明，從江西省分離的豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率較高，且tetO是主要的耐藥基因。本研究對(duì)外排泵機(jī)制相關(guān)的基因tetA、tetC和tetD，編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因tetM和tetO，編碼滅活酶的基因tetX共6種不同耐藥機(jī)制相關(guān)基因分析發(fā)現(xiàn)，tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX基因攜帶率分別為0、0、0、14.7%(5/34)、100%(34/34)和0，說明廣東地區(qū)的豬鏈球菌主要攜帶的耐藥基因?yàn)閠etM和tetO，提示這些豬鏈球菌分離菌株主要通過主動(dòng)核糖體保護(hù)機(jī)制造成耐藥。不同血清型豬鏈球菌攜帶耐藥基因也存在一定的差異，許曉燕等[28]研究結(jié)果表明，中國(guó)大部分地區(qū)的2型豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素具有很強(qiáng)的耐藥性，主要耐藥機(jī)制是由tetM基因介導(dǎo)的核糖體保護(hù)作用。關(guān)琳等[21]研究報(bào)道了9型豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥主要是由tetO基因介導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)34株鏈球菌都攜帶tetO基因，有5株菌同時(shí)攜帶tetO和tetM基因，且發(fā)現(xiàn)這5株豬鏈球菌全部為2型豬鏈球菌，其中機(jī)理有待于進(jìn)一步研究和探討。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，2016-2020年廣東不同地區(qū)分離的34株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為100%(34/34)、82.4%(28/34)和47.1%(16/34)，2重以上耐藥菌株占比較高。34株豬鏈球菌主要攜帶tetO和tetM基因，其中tetO基因攜帶率為100%，表明分離菌株對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制與tetO和tetM基因介導(dǎo)的核糖體保護(hù)蛋白有關(guān)。