任秀美奧，姚旭東，蒙亞琦，郭延華，唐 紅，張譯元，趙興旺，王立民，周 平

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000；3.石河子總場(chǎng)農(nóng)業(yè)服務(wù)發(fā)展中心，石河子 832000)

在自然受精過(guò)程中，精子除提供單倍體基因組外，還提供精源性RNA(核糖核酸)并參與早期胚胎的發(fā)育調(diào)控[1]，精源性RNA的含量很少，但對(duì)受精、早期胚胎發(fā)育以及表觀遺傳等均發(fā)揮重要調(diào)控作用[2]。微小核糖核酸(miRNA)是大小為20～25 nt的單鏈非編碼 RNA，占脊椎動(dòng)物基因的1%～3%，約超過(guò)30%的基因被其調(diào)控[3]。精源性信使核糖核酸(mRNA)和miRNA對(duì)胚胎轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)有重要作用[4]。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)miR-449b在牛精子中高表達(dá)，提示miR-449b進(jìn)入卵母細(xì)胞中參與受精后胚胎的發(fā)育，同時(shí)miR-449b在受精卵重編程過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。對(duì)小鼠生殖細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，miR-449簇與miR-34b/c在調(diào)節(jié)小鼠睪丸組織發(fā)育過(guò)程中具有協(xié)同作用[6]。對(duì)牛體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染精源性miR-449b，通過(guò)靶向組蛋白去乙?；?(HDAC1)的表達(dá)，提高核移植2-細(xì)胞和8-細(xì)胞胚胎的組蛋白H3K9乙?；?，促進(jìn)表觀重編程[5]。以上研究表明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中精源性miR-449b調(diào)節(jié)因子具有重要作用。羊睪丸組織高通量測(cè)序顯示，miR-449b在羊睪丸組組中表達(dá)[7]。H3K9三甲基化(H3K9me3)依賴性異染色質(zhì)是早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的主要障礙之一[8]，參與早期胚胎基因調(diào)控和印跡X失活過(guò)程[9-11]。編碼H3K9me3相關(guān)染色質(zhì)因子的基因缺失會(huì)導(dǎo)致基因無(wú)法正常表達(dá)和胚胎致死[12-13]。Yuan等[14]和Conine等[15]在缺乏精子RNA的早期胚胎中未發(fā)現(xiàn)基因組甲基化異常，但Wang等[8]對(duì)小鼠早期胚胎中H3K9me3修飾的全基因組研究發(fā)現(xiàn)，H3K9me3在啟動(dòng)子和長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)中表現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)特征，受精后母系基因組與父系基因組都進(jìn)行大規(guī)模的H3K9me3重建,且H3K9me3能在原核期胚胎的雌原核和2-細(xì)胞期胚胎中檢測(cè)到。目前關(guān)于miR-449b對(duì)早期胚胎組蛋白H3K9me3影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)比較綿羊成纖維細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞與精子中miR-449b的含量，探索miR-449b的表達(dá)情況，通過(guò)顯微注射法為孤雌胚胎補(bǔ)充正常受精過(guò)程中帶入的miR-449b，同時(shí)使用免疫熒光染色觀察補(bǔ)充miR-449b對(duì)綿羊2-細(xì)胞期孤雌胚胎組蛋白H3K9me3的影響，研究miR-449b對(duì)綿羊早期胚胎組蛋白甲基化的影響，為綿羊早期胚胎發(fā)育機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 于石河子屠宰場(chǎng)采集綿羊卵巢；在新疆農(nóng)墾科學(xué)院綿羊新種質(zhì)資源培育基地采集1月齡純種薩?？斯?3只)的耳組織，以及3歲左右純種薩?？斯?5只)的精液。綿羊卵巢保存于加雙抗的37 ℃生理鹽水中2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采集的耳組織放入含雙抗的0.9%生理鹽水中，與采集的新鮮精液一起，常溫下2 h內(nèi)運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑及儀器 TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、無(wú)水乙醇、細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自TaKaRa公司；PBS緩沖液購(gòu)自Biological Industries公司；卵母細(xì)胞成熟液、胚胎培養(yǎng)液、顯微操作液、受精液、氯仿、Percoll、DEPC、二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、4，6-二脒基-2-苯基吲哚二月桂酸酯(DAPI)、透明質(zhì)酸酶、石蠟油均購(gòu)自Sigma公司；RNase-free水購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；4%多聚甲醛、透膜液、封閉液、清洗液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗H3K9me3抗體、山羊抗兔IgG均購(gòu)自Abcam公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 480 Ⅱ)購(gòu)自Roch公司；梯度PCR儀(Labcycler 48)購(gòu)自SensoQuest公司；超凈工作臺(tái)(VS-840垂直流)購(gòu)自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；CO2培養(yǎng)箱(Galaxy 48R)、顯微注射儀(Femtojet)、顯微操作系統(tǒng)(Transfer Man 4r)均購(gòu)自Eppendorf公司；拉針儀(PC-100)、斷針儀(MF-830)、生物顯微鏡(SMZ800)、激光共聚焦顯微鏡(Stellaris 5)均購(gòu)自Nikon公司。

1.1.3 miR-449b模擬物及其對(duì)照的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)miRBase中提供的miR-449b-5p的序列(登錄號(hào)：MIMAT0036232)設(shè)計(jì)miR-449b的模擬物(miR-449b mimic)及其模擬物對(duì)照(NC mimic)序列，miR-449b mimic：5′-AGGCAGUGUAUUGUU-AGCUGGC-3′，NC mimic：5′-UCACAACCUCCU-AGAAAGAGUAGA-3′。序列由上海吉熒生物技術(shù)有限公司合成。將miR-449b mimic與NC mimic粉末溶解并稀釋成20 μmol/L，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 精子、成熟卵母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的獲取

1.2.1 精子 將5只羊的精液混合后，用Percoll密度梯度離心法純化精子，在10 mL尖底離心玻璃管底部加入2 mL 90% Percoll離心液，在其上方傾斜緩慢加入45% Percoll離心液，將200 μL精液緩慢加入離心管中45% Percoll密度梯度離心液表面，2 000 r/min離心10 min，離心后玻璃離心管尖底有云霧狀精子，將離心管上層與中下層的渾濁液體和死、弱精子輕輕吸走，留少量底部精子和液體，用200 μL鈍化槍頭將精子吸走，加入37 ℃預(yù)熱的1 mL PBS液中，1 500 r/min離心5 min，將上清液盡可能吸掉，留精子沉淀用于精子RNA的提取。

1.2.2 成熟卵母細(xì)胞 用剪刀除去多余結(jié)締組織，用生理鹽水清洗3次至無(wú)血液和異物。用刀片刺破直徑為2～8 mm的卵泡，體視鏡下挑選包裹2～3層顆粒細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用采卵液清洗2遍，放入卵母細(xì)胞成熟液進(jìn)行體外培養(yǎng)，38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。將成熟卵母細(xì)胞用0.1%透明質(zhì)酸酶消化，脫去顆粒細(xì)胞，顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞備用。

1.2.3 成纖維細(xì)胞 在培養(yǎng)皿內(nèi)將耳組織剪碎至大小約0.1 cm3的小塊，按0.5 cm間距接種于培養(yǎng)皿中，待組織貼壁后，加細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換1次液，當(dāng)組織塊周圍爬出的細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 精子、成熟卵母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞中miR-449b的表達(dá)

1.3.1 精子、成熟卵母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞RNA的提取 按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取綿羊精子RNA，―80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?0個(gè)胚胎為1組，使用GenEluteTM單細(xì)胞RNA純化試劑盒，按步驟提取成熟卵母細(xì)胞RNA，―80 ℃保存?zhèn)溆?。待成纖維細(xì)胞鋪滿10 cm培養(yǎng)皿的90%左右，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS清洗2～3次，加入1 mL TRIzol裂解液后按照步驟提取總RNA，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 精子、成熟卵母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞RNA的反轉(zhuǎn)錄 將精子、成熟卵母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的RNA按照Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系10 μL：mRQ Buffer(2×)5 μL，RNA 3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR或―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-449b的表達(dá) 根據(jù)GenBank中綿羊miR-449b序列(登錄號(hào)：MIMAT0036232)用miRNA RT Primer軟件設(shè)計(jì)miR-449b正向引物F:GGGAGGCAGTGTAT-TGTTAGCTG，反向通用引物與U6內(nèi)參引物由Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit提供。PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Ⅰ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性50 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。

1.4 孤雌激活胚胎制備

卵母細(xì)胞成熟后，用0.1%透明質(zhì)酸酶消化，脫去顆粒細(xì)胞，顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至提前準(zhǔn)備好的注射微滴中，用固定針固定卵母細(xì)胞，視野下調(diào)至透明帶與注射針尖清晰可見(jiàn)，將0.9%生理鹽水(對(duì)照組，Con)、NC mimic、miR-449b mimic分別注射進(jìn)胞質(zhì)中，以均勻擴(kuò)散為標(biāo)準(zhǔn)，迅速撤出注射針。將注射后的卵母細(xì)胞在成熟液中恢復(fù)0.5～1 h，去除死亡的卵母細(xì)胞，剩余卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，激活步驟如下：將注射后的卵母細(xì)胞移至7%無(wú)水乙醇中激活8 min；用發(fā)育液清洗2次，再放入6-DMAP中激活4 h，用發(fā)育液清洗2次，放入發(fā)育液微滴中，在38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并拍照，收集2-細(xì)胞胚胎，第2、7天分別統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率。

1.5 IVF胚胎制備

將綿羊精子按照1.2.1方法處理，最后獲得活力>80%的精子，將精子稀釋成1×106～5×106/mL，在培養(yǎng)箱中平衡2 h，將帶有少量顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞置于受精液滴中并加入精子，于38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行IVF；受精18 h后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎發(fā)育液中，在38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)，收集2-細(xì)胞胚胎用于H3K9me3免疫熒光染色。

1.6 胚胎H3K9me3免疫熒光染色

收集IVF 2-細(xì)胞胚胎及Con、NC mimic和miR-449b mimic組2-細(xì)胞胚胎，用0.1% PVA洗3次,用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min，然后將固定好的胚胎放入透膜液中，孵育30 min后用封閉液封閉1～2 h，用0.1% PVA清洗3次，將4種類型胚胎與兔抗H3K9me3抗體(1∶500 稀釋)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，用PBS清洗3次，每次5 min，與山羊抗兔IgG(1∶100)二抗室溫共孵育2 h，用PBS清洗3次，每次5 min，再用DAPI復(fù)染5～8 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ 1.48對(duì)H3K9me3進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)熒光定量RCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。H3K9me3免疫熒光強(qiáng)度用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用Bonferroni法進(jìn)行比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊精子純化與卵母細(xì)胞培養(yǎng)

新鮮綿羊精液經(jīng)Percoll密度梯度離心純化后所得精子形態(tài)正常，活力為85%(圖1A)；綿羊成熟COCs顆粒細(xì)胞擴(kuò)散良好，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻(圖1B);綿羊耳組織培養(yǎng)3 d后周圍有梭形細(xì)胞爬出，體外培養(yǎng)具有貼壁生長(zhǎng)特性(圖1C)。

圖1 綿羊精子(A)、成熟卵母細(xì)胞(B)與成纖維細(xì)胞(C)形態(tài)(40×)

2.2 miR-449b在綿羊成纖維細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞與精子中的表達(dá)

由圖2可知，miR-449b在精子中的表達(dá)顯著高于成熟卵母細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(P<0.05)，成熟卵母細(xì)胞與成纖維細(xì)胞中miR-449b的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4同

2.3 各組胚胎的卵裂率與囊胚率

由表2、圖3可知，與Con組相比，miR-449b mimic和NC mimic組卵裂率均顯著降低(P<0.05)，且NC mimic組卵裂率顯著低于miR-449b mimic組(P<0.05)；miR-449b mimic組囊胚率提高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 各組胚胎發(fā)育情況(40×)

表2 各組胚胎的卵裂率與囊胚率

2.4 各組2-細(xì)胞胚胎中H3K9me3表達(dá)量的變化

由圖4A可知，IVF、Con、NC mimic與miR-449b mimic組2-細(xì)胞胚胎均表達(dá)組蛋白H3K9me3，且都在細(xì)胞核表達(dá)。由圖4B可知，與Con組相比，NC mimic組2-細(xì)胞胚胎組蛋白H3K9me3的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，miR-449b mimic組2-細(xì)胞胚胎組蛋白H3K9me3的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；miR-449b mimic組2-細(xì)胞胚胎組蛋白H3K9me3顯著低于NC mimic組(P<0.05)，且與IVF組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

A，各組2-細(xì)胞胚胎中組蛋白H3K9me3的免疫熒光檢測(cè)(40×)；B，組蛋白H3K9me3的相對(duì)熒光強(qiáng)度

3 討 論

成熟精子是攜帶最少細(xì)胞質(zhì)、高度特化壓縮的細(xì)胞，不發(fā)生復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯[2]，且含有少量mRNA、miRNA、內(nèi)源性小干擾RNA(endo-siRNA)和piwi相互作用RNA(piRNA)[16-17]。采用單精子顯微注射(ICSI)將部分缺失miRNA和endo-siRNA的精子與正常卵母細(xì)胞受精，所得胚胎發(fā)育能力明顯降低，當(dāng)補(bǔ)充正常精子總RNA或small RNA后胚胎發(fā)育能力與卵胞漿內(nèi)ICSI胚胎移植后的出生率得到提高，表明精子miRNA和endo-siRNA對(duì)正常胚胎發(fā)育至關(guān)重要[14]。miRNA能結(jié)合靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域，降低靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄后水平，調(diào)控基因表達(dá)從而影響細(xì)胞的分化、增殖、代謝等多個(gè)過(guò)程[18-19]。miR-449簇包括miR-449a、miR-449b、miR-449c、miR-449d，其中miR-449b具有組織特異性表達(dá)，在睪丸中高表達(dá)，其許多靶基因在生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]。本試驗(yàn)對(duì)比綿羊成纖維細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞與精子中miR-449b的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果表明miR-449b在精子中高表達(dá)，這與Wang等[5]結(jié)果一致，提示精子miR-449b參與胚胎的早期發(fā)育。

關(guān)于miRNA對(duì)早期胚胎發(fā)育的相關(guān)研究越來(lái)越多，包括在小鼠精子中高表達(dá)的miR-34c，其可以調(diào)控DNA的合成[21]，說(shuō)明miR-34c對(duì)小鼠胚胎的第一次卵裂至關(guān)重要。牛體外受精胚胎桑椹胚和囊胚階段高表達(dá)miR-130b，抑制miR-130b的表達(dá)顯著降低桑椹胚和囊胚的形成[22]。牛精子攜帶的miR-202b抑制靶基因胞裂蛋白7(SEPT7)的表達(dá),調(diào)節(jié)紡錘體的形成和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，從而延緩體細(xì)胞核移植胚胎的第一次分裂[23]。Wang等[5]通過(guò)制備牛體細(xì)胞核移植胚胎模型研究miR-449b的作用，結(jié)果顯示，miR-449b可延遲牛植入前克隆胚胎的第一次卵裂時(shí)間、促進(jìn)表觀遺傳重編程和降低凋亡指數(shù)。為探究miR-449b對(duì)綿羊早期胚胎的作用，本試驗(yàn)將miR-449b mimic顯微注射至綿羊成熟卵母細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-449b mimic組孤雌激活胚胎卵裂率比NC mimic組明顯提高，miR-449b mimic組孤雌激活胚胎囊胚率提高但不顯著。說(shuō)明miR-449b在綿羊早期胚胎卵裂率與囊胚形成方面發(fā)揮重要作用，綿羊miRNA參與早期胚胎發(fā)育過(guò)程。

基因組在胚胎發(fā)育早期被廣泛去甲基化對(duì)胚胎正常發(fā)育至關(guān)重要，在發(fā)育過(guò)程中必須經(jīng)過(guò)調(diào)控才能保持基因組穩(wěn)定性[24]。其中組蛋白甲基化是影響核重編程效率的主要因素之一，且組蛋白甲基化比組蛋白乙?；揎椄訌?fù)雜，其中H3氨基端的K4和K9作為組蛋白甲基化的多發(fā)位點(diǎn)，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶催化H3K4和H3K9位點(diǎn)進(jìn)行單甲基化、二甲基化和三甲基化水平的改變[25]。本試驗(yàn)利用免疫熒光染色檢測(cè)對(duì)成熟卵母細(xì)胞補(bǔ)充miR-449b后組蛋白H3K9me3水平的改變，結(jié)果表明miR-449b能降低綿羊早期胚胎中組蛋白H3K9me3的表達(dá)水平。小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，正常受精后H3K9me3異染色質(zhì)重編程清除啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me3的障礙，為合子基因組激活建立不受限制的表觀遺傳環(huán)境，這可能是胚胎達(dá)到全能性狀態(tài)所必需的[26]。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，H3K9me3標(biāo)記的基因相對(duì)較少且穩(wěn)定，而大部分LTRs逐漸被H3K9me3依賴性異染色質(zhì)標(biāo)記，2-細(xì)胞胚胎特異性LTRs的表達(dá)水平是提高細(xì)胞發(fā)育潛能的標(biāo)志[27-28]，一些逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子上H3K9me3水平的增加與LTRs在2-細(xì)胞階段后的沉默有關(guān)[8]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K9me3在miR-449b mimic組2-細(xì)胞胚胎顯著低于NC mimic與對(duì)照組胚胎，其表達(dá)水平與體外受精胚胎相似，表明miR-449b參與早期胚胎發(fā)育過(guò)程中組蛋白甲基化重編程。

4 結(jié) 論

miR-449b在綿羊精子中高表達(dá)，且能顯著提高綿羊早期胚胎的發(fā)育率，降低早期胚胎中組蛋白H3K9me3的表達(dá)水平，表明miR-449b在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探索早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制提供參考。