閭怡清，金晶，胡美娟，葉紅燕，葉儉慧*，梁月榮

1.浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江 杭州 310058；2.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310000；3.浙江華茗園茶業(yè)有限公司，浙江 永康 321300

類黃酮化合物是茶樹（Camellia sinensis）重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎等多種生理功效[1-2]，是茶葉重要的品質(zhì)和功能成分。此外，類黃酮化合物參與茶樹的生長發(fā)育和逆境脅迫[3-4]，其生物合成受到光照、溫度、水分等外界環(huán)境條件以及生物脅迫的影響[5-8]。光照是植物生長的必要環(huán)境因子，為茶樹光合作用提供能量，同時(shí)參與調(diào)節(jié)茶樹生長發(fā)育和次生代謝。研究表明，茶樹類黃酮生物合成受到光照強(qiáng)度和光質(zhì)的影響[5,9]。

1 茶葉中主要的類黃酮物質(zhì)

類黃酮化合物占茶樹幼嫩新梢干物質(zhì)的15%～30%[10]。類黃酮是以2-苯基苯并吡喃為基本結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)，其基本骨架如圖1-A 所示。黃烷醇（圖1-B）、黃酮醇（圖1-C）和花青素（圖1-D）及其衍生物是茶樹主要的類黃酮物質(zhì)。黃烷醇類化合物又稱兒茶素類化合物，是茶樹主要的類黃酮物質(zhì)，占茶多酚總量的70%～80%[11]，主要包括兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）8種單體。茶葉中，黃酮醇類化合物是含量僅次于兒茶素類化合物的類黃酮物質(zhì)，約占多酚總量的13%[11]。根據(jù)苷元部分，黃酮醇類化合物可分為山奈酚苷、槲皮素苷、楊梅素苷三大類；根據(jù)糖基部分，可分為單糖苷、雙糖苷、三糖苷三大類?；ㄉ赵诓铇淙~片中有少量分布，一般占茶樹葉片干物質(zhì)的0.01%左右。但在紫化茶樹品種中，花色苷含量可達(dá)到葉片干重的0.5%～1.0%[12]。茶葉中花色苷主要有矢車菊素苷、飛燕草素苷和天竺葵素苷三大類。

圖1 類黃酮物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)示意圖

2 類黃酮生物合成途徑及調(diào)控

植物體內(nèi)的類黃酮生物合成途徑主要包括苯丙烷途徑和類黃酮合成途徑（圖2）。碳水化合物經(jīng)莽草酸途徑轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸，進(jìn)入苯丙烷途徑，生成香豆酰輔酶A，再經(jīng)查爾酮合成酶（CHS）催化，進(jìn)入類黃酮合成通路。在類黃酮合成途徑的下游，分支生成黃烷醇、黃酮醇苷及花色苷等[13]。其中，糖基化是類黃酮化合物的重要終反應(yīng)之一，而類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）是重要的催化酶。

圖2 類黃酮物質(zhì)的生物合成途徑

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）調(diào)節(jié)目的基因在特定的時(shí)間、空間，以特定的強(qiáng)度進(jìn)行表達(dá)，具有調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平的作用。類黃酮物質(zhì)的生物合成亦受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。MYBs、bHLHs和WD40s是調(diào)節(jié)類黃酮生物合成最重要的3 個轉(zhuǎn)錄因子家族。已從茶樹中克隆得到Cs-MYB4a 轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子能對結(jié)構(gòu)基因CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsLAR及CsANR2的轉(zhuǎn)錄起到負(fù)調(diào)節(jié)作用[14]。Zhao 等[15]發(fā)現(xiàn)CsMYB12和CsbZⅠP1，CsMYB4 和CsMYB7 均 能 與CsFLS和CsUGT78A14的啟動子區(qū)域發(fā)生互作。在煙草驗(yàn)證體系中，CsMYB5a 和CsMYB5b 能促進(jìn)原花青素在煙草中的積累[16-17]。除MYB 轉(zhuǎn)錄因子以外，研究表明CsbHLH62、CsWRKY57like 分別能與CsDFR、CsLAR、CCoAOMT基因啟動子區(qū)域發(fā)生互作，進(jìn)而參與茶樹甲基化EGCG 的合成調(diào)控[18-19]。MYB-bHLH-WD40 復(fù)合體（MBW 復(fù)合體）參與類黃酮生物合成通路下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如CsMYB85 與CsWD40、CsTT8s、Cs-GLs相互作用形成MBW復(fù)合物，調(diào)節(jié)原花青素的合成[20]。CsMYB196（CsMYB5b）與CsMYB184（CsMYB1）分別與CsWD40、CsTT8a 形成MBW三元復(fù)合物，調(diào)節(jié)CsANR的轉(zhuǎn)錄[17,20]。Liu 等[21]報(bào)道CsWD40 可 與bHLH 轉(zhuǎn) 錄 因 子CsGL3 和CsTT8，以及MYB 轉(zhuǎn)錄因子CsAN2 和CsMYB5e發(fā)生互作，形成MBW 復(fù)合物進(jìn)而調(diào)節(jié)花色苷和原花青素的積累。 CsMYB1 能與CsGL3 和CsWD40形成MBW復(fù)合物進(jìn)而促進(jìn)兒茶素合成基因 的 轉(zhuǎn) 錄，如CsANS、CsANR和CsSCPL1A[22]。此外，共表達(dá)分析法是篩選獲得參與類黃酮合成調(diào)控候選轉(zhuǎn)錄因子的重要方法[23-24]。

3 光照強(qiáng)度對茶樹類黃酮合成的影響

強(qiáng)光照促進(jìn)茶樹葉片類黃酮物質(zhì)的生物合成，尤其是黃酮醇苷類和花色苷的積累[25-26]。茶樹類黃酮合成相關(guān)基因啟動子序列含有多種光響應(yīng)元件，如G-box、ACE、GT1-motif、Box 4、Sp1、TCT-motif等，這是茶樹類黃酮合成易受到光照條件影響的重要原因。黑網(wǎng)遮陰能有效降低茶樹生長環(huán)境的光照強(qiáng)度，從而減少茶樹葉片苦澀味物質(zhì)的合成。黑網(wǎng)覆蓋遮陰能有效下調(diào)茶樹苯丙烷途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平， 例如CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H、CsF3'H，CsF3'5'H、CsDFR、CsANS、CsANR1、CsFLS和CsUFGT[7,15,27]。此外，類黃酮合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYBs 的表達(dá)，如MYB12，亦受到光信號的調(diào)節(jié)[20,28]。不同類黃酮物質(zhì)對光照強(qiáng)度的響應(yīng)存在差異，黃酮醇苷類物質(zhì)相較于兒茶素類物質(zhì)更容易受到光照的影響[15]。在相同遮陰條件下，龍井43、中茗192、望海1 號、景寧1 號和中黃2 號的黃酮醇苷類物質(zhì)降幅大于兒茶素類化合物[21]。Wang 等[7]亦發(fā)現(xiàn)經(jīng)遮陰處理后茶樹葉片的黃酮醇苷類物質(zhì)的降幅較其他類黃酮化合物大，而不同兒茶素類化合物亦對光照存在差異響應(yīng)。研究表明EC、EGC對遮陰處理響應(yīng)迅速[29]。由于茶樹葉片EGCG、ECG 的含量經(jīng)遮陰處理的降幅較小[28-30]，具體表現(xiàn)為遮陰后酯型兒茶素占比增加[28]。不同茶樹品種對黑網(wǎng)遮陰處理存在響應(yīng)差異。研究表明，玉綠新梢的茶多酚含量在遮陰后期不再降低，而毛頭種新梢的茶多酚含量在遮陰后期仍有明顯減少[31]。黑網(wǎng)覆蓋遮陰能普遍減少不同茶樹品種主要苦澀味物質(zhì)的合成和積累，這一原理已廣泛應(yīng)用于抹茶產(chǎn)品的田間栽培管理[32]。同時(shí)，覆蓋遮陰還能顯著提高茶葉葉綠素含量和氨基酸含量，使茶葉色澤更綠，滋味更鮮爽，改善茶葉口感，提升抹茶品質(zhì)。在實(shí)際生產(chǎn)中，一般采用90%～95%遮陽度的黑色遮陽網(wǎng)覆蓋20 d 左右[33-34]，能有效改變茶葉的內(nèi)質(zhì)成分[29,35-36]。然而，由于遮陰顯著降低茶樹生長的光照強(qiáng)度，延緩乃至抑制了茶樹新梢生育，同時(shí)大幅度降低了茶樹成熟葉片的光合效率，這對單位時(shí)間內(nèi)或單位面積的鮮葉產(chǎn)量有所影響。因此，可以通過補(bǔ)充大量肥料來減少遮陰對茶樹生長的影響。遮陽網(wǎng)的使用和損耗、有機(jī)肥的大量施用和茶樹生長量的減少，這些因素提高了抹茶生產(chǎn)的成本，不利于抹茶相關(guān)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步擴(kuò)張。

4 光質(zhì)對茶樹類黃酮生物合成的影響

太陽光由紫外光區(qū)段（400 nm以下）、可見光區(qū)段（400～710 nm）和紅外光區(qū)段（710～1 000 nm）組成，其中可見光區(qū)段由17%藍(lán)光（400～495nm）、44%綠光（495～570 nm）、30%黃光（570～590 nm）和9%紅光（590～710 nm）組成。研究表明，茶樹類黃酮生物合成對不同的光質(zhì)具有差異響應(yīng)。在密閉環(huán)境中，低照度（紫外照度＜1 μmol/m2·s）或短時(shí)間（30 min 以內(nèi)）的UVB 輻照能促進(jìn)茶樹葉片兒茶素類化合物的積累，而過量的UVB輻照會減少兒茶素類化合物的含量[37]。UVB 處理能夠降低茶樹葉片兒茶素化合物的含量[38]，增加黃酮醇苷類和花色苷的含量[15,38-39]。研究表明，紫外光在芽葉花色苷和黃酮醇苷的積累中起主要作用[40-41]。UVB 處理能促進(jìn)苯丙烷途徑CsPAL、Cs4CL、CsC4H的表達(dá)上調(diào)[38]，能誘導(dǎo)CsMYB4轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制類黃酮合成途徑CsLAR、CsANR、CsFLS的表達(dá)，使得花色苷生物合成加強(qiáng)，具體表現(xiàn)為花色苷含量顯著增加，兒茶素類化合物含量下降[39]。除結(jié)構(gòu)基因以外，類黃酮合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子亦能響應(yīng)UVB輻照。經(jīng)UVB輻照后茶樹葉片CsCPCa、CsCPCb、CsMYBL2b表達(dá)水平下調(diào)[20]，其中擬南芥突變體中已證明CsCPCa的過表達(dá)可積累更多的花色苷。UVB 輻照還能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子CsBZⅠP1和CsMYB12形成復(fù)合體，進(jìn)而促進(jìn)CsFLS和CsUGT78A14轉(zhuǎn)錄，提高黃酮醇苷類化合物的含量[15]。

茶樹類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)水平和酶活力受到不同可見光波段的影響。陳思肜[42]對茶樹進(jìn)行紅光、藍(lán)光補(bǔ)光處理，發(fā)現(xiàn)茶樹中兒茶素類化合物對有色光補(bǔ)光的響應(yīng)與其補(bǔ)光強(qiáng)度和補(bǔ)光時(shí)間有關(guān)。張澤岑等[43]報(bào)道經(jīng)黃色薄膜處理后茶樹葉片的花色苷含量增加。王加真等[44]發(fā)現(xiàn)100%的紅光能促進(jìn)茶樹多酚含量的積累。Zheng等[24]發(fā)現(xiàn)夜間采用藍(lán)光補(bǔ)光可以促進(jìn)茶樹葉片花青素和兒茶素的積累，藍(lán)綠光補(bǔ)光能增加主要兒茶素類化合物的含量，且藍(lán)光的效果要優(yōu)于藍(lán)綠混合光。紅藍(lán)光配比對茶樹葉片的類黃酮含量影響不大[45]，而夜間進(jìn)行紅藍(lán)光混合光補(bǔ)光，在一定程度內(nèi)能增加茶樹葉片多酚含量[46]。李智[40]發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫光能夠影響F3H、DFR 的酶活力，而紅橙光主要影響CHⅠ、ANS 的酶活力，但光質(zhì)對CHS、ANR的酶活力無明顯作用。有研究報(bào)道高強(qiáng)度藍(lán)紫光能提高F3H 的酶活力，而低強(qiáng)度藍(lán)紫光能提高ANR的酶活力[40]。

5 光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對茶樹類黃酮生物合成的調(diào)節(jié)作用

植物通過光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)響應(yīng)外界光環(huán)境，并進(jìn)而調(diào)節(jié)自身生長代謝。光受體是植物對光環(huán)境的重要感知器，主要包括UVB 光受體（UVR8）、光敏色素（PHYs）、向光素受體（PHOTs）和隱花色素（CRYs）。光受體在接受光信號后，啟動植物光形態(tài)建成和其他生理代謝過程中，光信號元件，如COP1、PⅠFs、SPAs、HY5等，也參與其中。UVR8 是植物感知UVB 的光受體[47]，與植物類黃酮合成密切相關(guān)[28,48-49]。在UVB處理下，UVR8蛋白能與COP1發(fā)生相互作用促進(jìn)HY5 的積累，進(jìn)而調(diào)控下游UVB 靶基因的轉(zhuǎn)錄[50-51]。HY5可與靶基因啟動子區(qū)域的G box元件發(fā)生互作[52]，還可以促進(jìn)自身轉(zhuǎn)錄[53]。在擬南芥hy5 突變體中已證明CsHY5 能夠響應(yīng)UVB 促進(jìn)類黃酮的生物合成，體現(xiàn)在CsHY5 能與CsDFRa、CsFLS、CsLARa基因的啟動子區(qū)域發(fā)生互作[38]。HY5 還通過誘導(dǎo)介導(dǎo)類黃酮合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄啟動并影響類黃酮的合成積累。Lin等[38]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)UVB被濾除后，參與調(diào)控茶樹類黃酮合成的CsHY5、CsMYB12、CsMYB75轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量下調(diào)，酵母雙雜交技術(shù)證明了茶樹CsHY5 與CsMYB12蛋白之間存在互作。在擬南芥中已證實(shí)HY5與MYB12之間發(fā)生互作從而調(diào)節(jié)類黃酮的生物合成[54]。此外，在被子植物中向光素受體家族被分為PHOT1和PHOT2兩大分支，是植物感知藍(lán)光信號的光受體。在茶樹中，已鑒定到Cs-PHOT1a、CsPHOT1b和CsPHOT2[55]等光受體。隱花色素也是植物中重要的藍(lán)光受體，其對應(yīng)的CsCRY1和CsCRY2基因亦在茶樹中被鑒定和克隆。藍(lán)光能夠誘導(dǎo)CsCRY1和CsCRY2基因表達(dá)水平的顯著上調(diào)[56]。此外，CsCRYs的表達(dá)具有組織特異性：根＞葉＞花＞莖[56]。Tai 等[28]采用遮陰處理茶樹葉片，發(fā)現(xiàn)CsCRY1和CsCRY2的轉(zhuǎn)錄水平與CsCHSs和CsFLS呈負(fù)相關(guān)。關(guān)于光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對茶樹類黃酮合成，特別是花色苷和黃酮醇苷生物合成的分子作用機(jī)制，仍有待深入研究。

6 結(jié)語

光是調(diào)節(jié)茶樹生長發(fā)育和次生代謝的重要環(huán)境因子。類黃酮是茶樹重要的次生代謝產(chǎn)物，與茶葉的滋味品質(zhì)和生理活性密切相關(guān)，同時(shí)還參與茶樹對外界環(huán)境的響應(yīng)?；诠庑盘枌Σ铇漕慄S酮生物合成的作用機(jī)制，科研工作者們開展了大量通過覆蓋遮陰和LED 燈補(bǔ)光等技術(shù)改善茶葉品質(zhì)的研究工作。覆蓋遮陰已廣泛應(yīng)用于抹茶生產(chǎn)，能有效降低茶葉的苦澀味物質(zhì)，改善茶葉的口感。近年來，光信號介導(dǎo)的類黃酮生物合成調(diào)控相關(guān)研究在眾多園藝植物中已有報(bào)道。而關(guān)于光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對茶樹類黃酮生物合成的分子調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待深入研究。明確光照強(qiáng)度、光質(zhì)和光周期等因素對茶樹類黃酮生物合成的影響和作用機(jī)制有助于開發(fā)新的栽培措施，為改變茶樹重要滋味成分組成，提升茶葉品質(zhì)提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù)。