邵 睿，張 倩，宋煒鈺，吳曉秋，劉龍祥，2，3*

（1.山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 254300；2.山東省黃河三角洲脆弱生態(tài)帶工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 254300；3.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 254300）

葡萄酒富含有維生素、氨基酸、肌醇、花青素等營養(yǎng)成分[1-2]，深受大眾的喜愛。隨著經(jīng)濟(jì)全球化發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對葡萄酒品質(zhì)的要求也越來越高。蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是釀造高品質(zhì)葡萄酒的重要環(huán)節(jié)，可以降低葡萄酒的酸度，使之不再酸澀和粗糙，口感變得圓潤柔和，而且可提高葡萄酒的感官質(zhì)量和增加微生物穩(wěn)定性，更重要的是它能夠修飾葡萄酒的風(fēng)味，顯著增強(qiáng)葡萄酒的香氣品質(zhì)[3-5]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵一般在酒精發(fā)酵結(jié)束后啟動，但在酒精發(fā)酵結(jié)束之后，葡萄酒會成為低pH值、高乙醇濃度、高二氧化硫濃度等惡劣環(huán)境組成的非生物脅迫環(huán)境[6-7]。作為蘋果酸乳酸發(fā)酵的主要啟動者和承擔(dān)者—酒酒球菌（Oenococcus oeni）在這些惡劣環(huán)境下的生長和代謝均會受到抑制，MLF進(jìn)程也會受到抑制，從而影響葡萄酒的降酸能力，其中乙醇是重要的抑制因子，而酒酒球菌可以耐受這種高乙醇環(huán)境，并且較為專一地啟動MLF，還能提高葡萄酒的感官品質(zhì)，因此，它是葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程常用的菌種[6-7]。

葡萄酒的香氣是高品質(zhì)葡萄酒的標(biāo)志之一，這也與酒酒球菌有著密切聯(lián)系[8]。具有濃郁香味的萜烯類化合物是葡萄酒香氣的主要來源，在葡萄酒中其主要以無味的糖苷結(jié)合態(tài)存在，β-葡萄糖苷酶可以酶解香氣前體物質(zhì)以增加葡萄酒香氣的多樣性，而酒酒球菌具有較高的β-葡萄糖苷酶活性，會加速香氣前體物的快速分解，對增加葡萄酒香氣的多樣性意義重大[9]。葡萄酒的惡劣生境，尤其是高濃度的乙醇會對酒酒球菌的糖苷酶活性產(chǎn)生影響[10]。因此，酒酒球菌在葡萄酒惡劣環(huán)境下的抗脅迫能力和糖苷酶活性將直接影響蘋果酸-乳酸發(fā)酵的啟動、進(jìn)行、完成，以及葡萄酒的色澤、口感、香氣等感官品質(zhì)[11]。所以，培育出耐受高濃度乙醇的酒酒球菌對于釀造香氣獨(dú)特的高品質(zhì)葡萄酒至關(guān)重要。

酒酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a是西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院自行選育的1株優(yōu)良酒酒球菌，具有較強(qiáng)的耐乙醇能力，能耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)10%[12]。目前，研究較多的是低pH、高濃度乙醇、高濃度二氧化硫?qū)凭魄蚓硖匦缘挠绊懠澳褪軝C(jī)制，但對如何培育和篩選出耐高濃度乙醇的酒酒球菌卻鮮有報道[13]。紫外線（ultraviolet，UV）是有效的誘變劑，其可以提高菌體突變率且操作簡單可行，工業(yè)上用這種方法選育了許多優(yōu)良生產(chǎn)菌株。因此，本研究以酒酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a為出發(fā)菌株，通過紫外誘變處理，經(jīng)過多代的乙醇脅迫適應(yīng)性培養(yǎng)，篩選獲得正向突變菌株，并評價其不同脅迫條件下的生長情況、β-葡萄糖苷酶活性、模擬酒條件下蘋果酸、乳酸含量及活菌數(shù)的變化，以期為國產(chǎn)葡萄酒產(chǎn)業(yè)積累優(yōu)良菌種資源，促進(jìn)國產(chǎn)葡萄酒工業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

酒酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a：由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院從山東煙臺自然發(fā)酵葡萄酒中分離出的一株具有良好的蘋果酸-乳酸發(fā)酵性能的菌株；對照菌株L-450（LACTOENOS450 PreAc）：法國LAFFORT公司。

1.1.2 試劑

蘋果酸、乳酸（均為色譜純）、對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；鹽酸半胱氨酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

ATB液體培養(yǎng)基[14-15]：蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，酵母浸出粉5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，鹽酸半胱氨酸0.5 g，番茄汁250 mL，蒸餾水750 mL，pH 4.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。ATP固體培養(yǎng)基：將ATB液體培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5.0，添加1.5%的瓊脂。

模擬酒培養(yǎng)基[14]：葡萄汁10 mL，L-蘋果酸3 g，D-葡萄糖2 g，D-果糖2 g，CaCl20.13 g，KCl 0.45 g，（NH4）2SO41 g，CH3COONa 2 g，KH2PO40.6 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO40.05 g，酵母浸出粉4 g，蒸餾水990 mL，pH 3.8。110 ℃高壓蒸汽滅菌10 min，待模擬酒培養(yǎng)基溫度降至室溫水平再添加100 mL無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

Icount全自動菌落計數(shù)儀：杭州迅數(shù)科技有限公司；ST16R型離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GI80DWS高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；1220高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒酒球菌SD-2a的活化

吸取甘油保藏的酒酒球菌SD-2a 100 μL接種到ATB液體培養(yǎng)基中，26 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)接一次，監(jiān)測OD600nm值，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm值約為1）即得到活化好的菌液。

1.3.2 酒酒球菌SD-2a的紫外誘變處理

取活化好的菌液，在紫外燈下分別照射45 s、50 s、55 s、60 s、65 s、70 s、75 s、80 s、85 s、90 s，平板與紫外燈距離為20 cm，紫外照射完畢，按10倍梯度稀釋至10-5，取稀釋液在無菌避光操作條件下涂布于ATB固體培養(yǎng)基上，于26 ℃避光培養(yǎng)4 d[16]，對平板上生長的單菌落進(jìn)行菌落計數(shù)[17]，根據(jù)誘變菌株在平板上的單菌落數(shù)與出發(fā)菌株在平板上的單菌落數(shù)之比，得出致死率。

選擇致死率在80%～90%對應(yīng)的照射時間進(jìn)行紫外誘變，誘變完成后，吸取誘變后的菌液1 mL于含有體積分?jǐn)?shù)14%乙醇的ATB液體培養(yǎng)基中，26 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d作為種子液。將種子液按2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到含有體積分?jǐn)?shù)14%乙醇的ATB液體培養(yǎng)基中，26 ℃靜置培養(yǎng)7 d，此為第二代，以此類推，共轉(zhuǎn)接五代，對突變菌群進(jìn)行乙醇脅迫適應(yīng)性定向篩選，以提高獲得乙醇脅迫耐受菌株的概率。

1.3.3 突變菌株的分離及純化

取轉(zhuǎn)接五代的菌液，按10倍梯度稀釋至10-5，取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液涂布于ATB固體平板上，26 ℃靜置培養(yǎng)7 d。長出單菌落后，挑選三個長勢較好的單菌落，進(jìn)一步的劃線純化，獲得突變菌株。

1.3.4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下酒酒球菌生長曲線的繪制

測定出發(fā)菌株和突變菌株種子液的OD600nm值，通過稀釋或濃縮調(diào)整OD600nm值，獲得相同的初始接種量，以2%（V/V）的接種量分別接種到含體積分?jǐn)?shù)為10%、12%、14%乙醇的ATB液體培養(yǎng)基中，每個處理做3個平行，26 ℃靜置培養(yǎng)216 h，每隔12 h測一次OD600nm值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，以此反應(yīng)突變菌株與出發(fā)菌株對乙醇脅迫的耐受性。

1.3.5β-葡萄糖苷酶活性的測定

配制濃度為10～60 μmol/L的對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）溶液，測定OD400nm值，以pNP濃度（x）為橫坐標(biāo)，OD400nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以出發(fā)菌株SD-2a和商業(yè)菌株L-450為對照，吸取活化好的菌液各1 mL，4 ℃條件下8 000 r/min離心2 min，棄上清，采用0.85%的生理鹽水洗滌菌體沉淀兩次，留菌體沉淀，加入0.5 mL 0.85%的生理鹽水，再加入0.5 mL檸檬酸磷酸緩沖溶液（pH 5.0）配制的5 mmol/L對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），混合，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h，立即加入2 mL的1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一試管中，利用紫外分光光度計測定OD400nm值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算酶活[9-10，18]。對照樣品用0.85%的生理鹽水代替菌懸液制備空白樣品，其他處理與樣品相同。

β-葡萄糖苷酶酶活定義：以pNPG為底物，每克菌體（干質(zhì)量）每分鐘水解該底物生成pNP的量為一個酶活力單位，單位為U/g。

1.3.6 模擬酒發(fā)酵

測定出發(fā)菌株和突變菌株種子液的OD600nm值，通過稀釋或濃縮調(diào)整OD600nm值，獲得相同的初始接種量，以2%（V/V）的接種量分別接種到模擬酒培養(yǎng)基中，18 ℃靜置培養(yǎng)8 d。

1.3.7 蘋果酸消耗量和乳酸生成量的測定

分別在發(fā)酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d時取模擬酒液500 μL，4 ℃條件下12 000 r/min離心2 min，取上清液，采用高效液相色譜法檢測蘋果酸及乳酸的含量。

高效液相色譜條件：安捷倫ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為1%甲醇，99%磷酸鹽緩沖液（pH 2.8），流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm[19-20]。

定性定量方法：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法定量。

1.3.8 存活率的測定

分別在發(fā)酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d時取模擬酒樣500 μL，用0.9%生理鹽水按10倍梯度稀釋到10-6，取稀釋液5 μL點(diǎn)接于ATB固體培養(yǎng)基上，26 ℃靜置培養(yǎng)4～5 d，長出單菌落后，利用菌落計數(shù)器拍照，參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行菌落計數(shù)并計算存活率。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistic 20對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Illustrator CC 2018與OriginPro 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳紫外誘變時間的確定

紫外照射后，酒酒球菌SD-2a的致死曲線見圖1。由圖1可知，當(dāng)紫外誘變時間為65 s、70 s時，致死率分別為85%、87%，致死率在80%～90%之間，因此，選定65 s為最佳誘變時間。

圖1 紫外照射后酒酒球菌SD-2a的致死曲線Fig.1 Death curve of Oenococcus oeni SD-2a after UV irradiation

2.2 突變菌株的分離純化

選擇65 s作為誘變時間，對活化好的SD-2a進(jìn)行紫外誘變，誘變后進(jìn)行乙醇脅迫適應(yīng)性定向篩選，共轉(zhuǎn)接五代，取第五代菌液進(jìn)行稀釋涂布，在平板上挑取3個單菌落，分別命名為UVe1、UVe2、UVe3，劃線純化后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫條件下酒酒球菌的生長曲線

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫條件下酒酒球菌SD-2a及其3株突變菌株的生長曲線見圖2。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫條件下酒酒球菌SD-2a及其3株突變菌株的生長曲線Fig.2 Growth curves of Oenococcus oeni SD-2a and 3 mutant strains under different volume fraction ethanol stress

由圖2A可知，在體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇條件下，突變菌株UVe2和UVe3的生長狀況均顯著優(yōu)于出發(fā)菌株（P＜0.05），突變菌株UVe1的生長情況與出發(fā)菌株無顯著差異（P＞0.05）。在到達(dá)穩(wěn)定期（9 d）時，突變菌株UVe2和UVe3的OD600nm值（0.810和0.803）是出發(fā)菌株（0.578）的1.40倍和1.39倍，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的乙醇脅迫耐受性。

由圖2B和2C可知，在體積分?jǐn)?shù)12%和14%乙醇的脅迫條件下，突變菌株UVe1、UVe2、UVe3的生長速度均顯著優(yōu)于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05）。在乙醇體積分?jǐn)?shù)12%的脅迫條件下，到達(dá)穩(wěn)定生長期（9 d）時，突變菌株UVe1、UVe2和UVe3的OD600nm值（0.561、0.699和0.764）分別是出發(fā)菌株（0.258）的2.18倍、2.71倍和2.97倍；在乙醇體積分?jǐn)?shù)14%的脅迫條件下，到達(dá)穩(wěn)定生長期（9 d）時，突變菌株UVe1、UVe2和UVe3的OD600nm值（0.284、0.707和0.472）分別是出發(fā)菌株（0.149）的1.89倍、4.72倍和3.16倍。因此，在高乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，突變菌株擁有更強(qiáng)的乙醇脅迫耐受性，且突變菌株UVe2和UVe3的乙醇脅迫耐受性更好。

2.4 β-葡萄糖苷酶活性的測定

β-葡萄糖苷酶是結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，其可以裂解葡萄酒中鏈烷醇和烯醇、莽草酸衍生物等風(fēng)味活性苷元物質(zhì)的糖苷鍵，糖苷中的糖苷配基將被釋放來增強(qiáng)葡萄酒香氣[8]。以出發(fā)菌株SD-2a和商業(yè)菌株L-450為對照菌株，突變菌株的β-葡萄糖苷酶活力見圖3。由圖3可知，3株突變菌株的β-葡萄糖苷酶活性顯著高于對照菌株L-450（P＜0.05），其中突變菌株UVe2的β-葡萄糖苷酶活性最高（1.07 U/g），顯著高于出發(fā)菌株SD-2a（0.92 U/g）（P＜0.05），是出發(fā)菌株SD-2a的1.16倍，對照菌株L-450的1.55倍；突變菌株UVe3的β-葡萄糖苷酶活性（0.99 U/g）與出發(fā)菌株SD-2a無顯著差異（P＞0.05）；突變菌株UVe1的β-葡萄糖苷酶活性（0.87 U/g）顯著低于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05）。

圖3 酒酒球菌SD-2a及其3株突變菌株的β-葡萄糖苷酶活性Fig.3 β-glucosidase activities of Oenococcus oeni SD-2a and 3 mutant strains

2.5 模擬酒條件下酒酒球菌的發(fā)酵性能

2.5.1 蘋果酸和乳酸含量的變化

蘋果酸-乳酸發(fā)酵是釀造葡萄酒過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是指在乳酸菌作用下將L-蘋果酸脫羧基形成L-乳酸的過程，整個過程蘋果酸含量會下降，乳酸含量會上升，葡萄酒的口感會由尖銳變得柔和[22-23]。酒酒球菌在模擬酒培養(yǎng)基中蘋果酸和乳酸含量的變化見圖4。

圖4 酒酒球菌SD-2a及其3株突變菌株在模擬酒培養(yǎng)基中蘋果酸和乳酸含量的變化Fig.4 Changes of malic acid and lactic acid contents in simulated wine medium of Oenococcus oeni SD-2a and 3 mutant strains

由圖4A可知，在模擬酒環(huán)境下，突變菌株UVe1、UVe2和UVe3的蘋果酸降解速度顯著高于出發(fā)菌株SD-2a，在發(fā)酵第8天時，蘋果酸含量分別是出發(fā)菌株的0.55倍、0.46倍和0.84倍。由圖4B可知，突變菌株UVe1、UVe2和UVe3的乳酸生成速度顯著高于出發(fā)菌株SD-2a，這與突變菌株的蘋果酸降解速度對應(yīng)，在第8天時，乳酸含量分別是出發(fā)菌株的1.34倍、1.46倍和1.18倍。蘋果酸乳酸酶是蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酶[11]，其活性將會影響菌株L-蘋果酸降解速率，突變菌株可能增強(qiáng)了蘋果酸乳酸酶活性，使之蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力更強(qiáng)。

2.5.2 存活率

葡萄酒發(fā)酵是一個相對漫長的過程，此過程中菌株的存活情況對蘋果酸-乳酸發(fā)酵的啟動與順利進(jìn)行十分重要[24]，較強(qiáng)的存活能力也是培育優(yōu)良商業(yè)菌株所必需的特性[25-27]。發(fā)酵過程中，酒酒球菌在模擬酒培養(yǎng)基中存活率的變化見圖5。由圖5可知，在初始接種量一致的情況下，三種突變菌株及出發(fā)菌株在0～8 d的存活率普遍較高，在發(fā)酵第2天時，突變菌株UVe1與出發(fā)菌株SD-2a的存活率無顯著差異（P＞0.05），突變菌株UVe2的存活率顯著低于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05），突變菌株UVe3的存活率是出發(fā)菌株的3.9倍；在第4天和第6天時，所有突變菌株的存活率均顯著高于出發(fā)菌株（P＜0.05），其中存活率從高到低分別為菌株UVe1、UVe2、UVe3；在第8天時，突變菌株UVe1和UVe2的存活率顯著高于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05），分別是出發(fā)菌株的5.0倍和3.3倍，突變菌株UVe3與出發(fā)菌株SD-2a無顯著差異（P＞0.05）。綜上，突變菌株UVe1和UVe2的脅迫適應(yīng)性更強(qiáng)，在葡萄酒發(fā)酵的環(huán)境中更易存活，可以更好地進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，突變菌株UVe1和UVe2具有成為優(yōu)良商業(yè)酒酒球菌的潛力。

圖5 酒酒球菌SD-2a及其3株突變菌株在模擬酒培養(yǎng)基中存活率的變化Fig.5 Changes of survival rates of Oenococcus oeni SD-2a and 3 mutant strains in simulated wine

3 結(jié)論

酒酒球菌SD-2a經(jīng)過紫外誘變處理和乙醇脅迫適應(yīng)性培養(yǎng)后，篩選獲得了3株乙醇脅迫耐受突變菌株，分別為UVe1、UVe2、UVe3，在高體積分?jǐn)?shù)乙醇（12%和14%）脅迫環(huán)境下，3株突變菌株的生長速度均顯著高于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05）；突變菌株UVe2的β-葡萄糖苷酶活性顯著高于出發(fā)菌株SD-2a和對照菌株L-450（P＜0.05）；在模擬酒培養(yǎng)基中，3株突變菌株的蘋果酸降解與乳酸生成速度均顯著高于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05），且突變菌株UVe1和UVe2的存活率顯著高于出發(fā)菌株SD-2a（P＜0.05）；綜上，突變菌株UVe2具有優(yōu)良商業(yè)酒酒球菌的潛力。