范培文，劉蒲臨，張明春，繆禮鴻*，陳家暉，鄧 燦，汪彩莉，王奇盛

（1.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

濃醬兼香型白酒是在我國(guó)傳統(tǒng)醬香型白酒和濃香型白酒的基礎(chǔ)上發(fā)展而來[1-2]。它吸取了醬香型白酒的高溫制曲、高溫堆積以及濃香型白酒的泥窖發(fā)酵等工藝特點(diǎn)，形成了濃醬兼香型白酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝[3-4]。

高級(jí)醇是白酒自然發(fā)酵過程中生成的重要副產(chǎn)物，能夠襯托酒體酯類香氣[5]。除異戊醇呈微甜外，大多數(shù)高級(jí)醇（如異丁醇、正丙醇、正丁醇）都呈苦味，含量過高會(huì)導(dǎo)致酒體苦澀，使人上頭易醉，但是含量太低會(huì)導(dǎo)致酒體口味淡薄[6]。高級(jí)醇含量是白酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格控制的一項(xiàng)指標(biāo)，白酒中的總高級(jí)醇含量應(yīng)控制在0.2～1.0 g/mL[7]。在白酒發(fā)酵過程中，理化因素對(duì)微生物群落的組成有顯著影響，從而影響高級(jí)醇的產(chǎn)出。ZHANG H X等[8]研究發(fā)現(xiàn)，初始溫度越高，乳酸菌的數(shù)量增加越快，高溫使總酸含量增加，總酯含量降低，從而影響高級(jí)醇總量。JIANG J等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在白酒發(fā)酵過程中，水分和氮源含量等理化因子對(duì)微生物群落及其代謝有很大影響，通過響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵工藝優(yōu)化后，高級(jí)醇總含量由328.80 mg/L顯著降低至114.88 mg/L。

正丙醇在白酒中的含量已成為一個(gè)限制性指標(biāo)，因此對(duì)正丙醇的產(chǎn)出機(jī)理進(jìn)行研究具有重大意義[10]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)正丙醇產(chǎn)生的機(jī)理，從細(xì)菌、真菌等菌種角度展開了研究。田源等[11]通過對(duì)濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中微生物的宏轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，解析與正丙醇合成相關(guān)的微生物和代謝，發(fā)現(xiàn)了3條可能的酒醅微生物合成正丙醇的途徑。真菌主要通過2-甲基蘋果酸代謝途徑和蘇氨酸代謝途徑合成正丙醇，細(xì)菌則主要通過丙酸代謝途徑合成并參與蘇氨酸代謝途徑。正丙醇是白酒中高級(jí)醇重要的組成部分之一[12]，因此通過減少雜醇油的產(chǎn)出來達(dá)到降低正丙醇的目的。楊生智等[13]從雜醇油生產(chǎn)機(jī)理入手，通過添加氮源，可降低酒中19%雜醇油含量。孫金旭等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著大曲添加量升高，醬香型白酒雜醇油降低。王立釗等[15]的研究結(jié)果表明，白酒釀造過程中，發(fā)酵力、糖化力和蛋白分解能力對(duì)雜醇油的產(chǎn)出也有影響。柏永昊等[16]研究表明，芽孢桿菌雖然能增加白酒發(fā)酵過程中正丙醇的含量，但不是正丙醇產(chǎn)生的主要因子。JANSSEN P H等[17]研究表明，一株厭氧羧菌（Clostridiumsp.）能夠發(fā)酵蘇氨酸產(chǎn)生丙酸和正丙醇，證明正丙醇是蘇氨酸發(fā)酵的末端產(chǎn)物。

本研究以某酒廠濃醬兼香型白酒二輪次出池酒醅為樣品，篩選的正丙醇含量高、中、低酒醅樣品，對(duì)其進(jìn)行理化指標(biāo)分析，并采用高通量測(cè)序技術(shù)分析其微生物群落結(jié)構(gòu)，并基于冗余分析（redundancy analysis，RDA）探討正丙醇含量與微生物、理化因子之間的關(guān)系。以期降低酒醅中正丙醇含量，為人工調(diào)控和降低白酒的正丙醇含量提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲、高粱：湖北省某著名濃醬兼香型酒廠；24份酒醅樣品（N41610、N41609、N41911、N41912、N40623、N40624、N30211、N30212、N30621、N30630、N40217、N40218、N30930、N22130、N41328、N21329、N21627、N11304、N20230、N11904、N42122、N11203、N12327、N20530）：湖北省某著名酒廠濃醬兼香型白酒二輪出池酒醅。

1.1.2 試劑

溶菌酶（酶活2 000 U/g）：山東蕙華生物科技有限公司；裂解酶（酶活120 U/g）：康迪恩生物有限公司；叔戊醇、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DL 2 000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái)、ZXDP-A2160恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY-2102振蕩培養(yǎng)箱：上海智城科技有限公司；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、CP97723A色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司；WH-3微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀：美國(guó)BIO-RAD公司；SYDR/1305凝膠成像儀：美國(guó)Syngene公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 正丙醇的測(cè)定[18]

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精密量取恒溫至20 ℃的正丙醇4 mL、5 mL、6 mL，分別置于100 mL量瓶中，分別精密加入恒溫至20 ℃的叔戊醇（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述各溶液1 mL，分別置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

樣品預(yù)處理：將二輪原酒出池酒醅樣品于蒸餾瓶中蒸餾，收集餾出液，并用0.45 μm水系濾膜進(jìn)行過膜處理，取10mL過膜餾出液，加200μL叔戊醇（質(zhì)量濃度324.710 mg/L）作內(nèi)標(biāo)物，混合均勻。

色譜條件：檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）；CP97723A色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣量1 μL；分流比為20∶1；載氣為高純氮?dú)猓∟2）；氫氣（H2）流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min，N2流速為5 mL/min，程序升溫：初始溫度60 ℃，維持5 min，再以10 ℃/min升溫至160 ℃，維持5 min。檢測(cè)器溫度200 ℃，進(jìn)樣口溫度220 ℃，總運(yùn)行時(shí)間20 min。

定性定量方法：采用保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量[19-20]。

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量的測(cè)定[21]：準(zhǔn)確稱取樣品10.0 g，在恒溫130 ℃條件下將酒醅試樣加熱45 min，干燥前后試樣質(zhì)量差，即為水分含量；pH的測(cè)定：采用pH計(jì)[22]；總酸的測(cè)定：采用酸堿滴定法[23]；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：采用奈氏試劑比色法[24]；還原糖的測(cè)定[25]：采用3,5-二硝基水楊酸法。

1.3.3 高通量測(cè)序

DNA提?。簩?0 g酒醅樣品與100 mL提取緩沖液（40 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）充分混勻。在37 ℃的條件下用溶菌酶（1 mg/mL）和裂解酶（2 mg/mL）處理1 h，然后用LEE H W等[26]所描述的方法對(duì)DNA進(jìn)行提取。

PCR擴(kuò)增：以DNA為模板，對(duì)真菌和細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，細(xì)菌擴(kuò)增16S rRNA基因V3-V4區(qū)，采用16S rRNA的通用引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）與806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）。真菌ITS內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1區(qū)，采用引物1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）與2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：2（PowerTaqMaserMix 25 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，三蒸水22 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增完成后，委托美吉生物公司使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 高通量數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序完畢的原始序列使用QIIME 2軟件[27]進(jìn)行質(zhì)控、過濾、去嵌合體得到有效序列。將有效序列中97%相似度進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得微生物信息，確定產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)潛在的微生物種屬。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

為了建立微生物群落與正丙醇之間的關(guān)系，分別以酒醅樣品的細(xì)菌和真菌的相對(duì)豐度以及酒醅樣品的理化指標(biāo)作為數(shù)據(jù)，正丙醇作為變量進(jìn)行冗余分析（RDA），使用CANOCO 5.0軟件[28]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過SPSS Statistics 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅理化指標(biāo)的分析結(jié)果

對(duì)24份酒醅樣品的正丙醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，所有酒醅樣品的正丙醇含量范圍在1 103～2 463.04 mg/kg之間，從中選出3份酒醅樣品，分別為正丙醇含量最高的樣品N41328（2 463.04 mg/kg）、正丙醇含量中等的樣品N40217（1 697 mg/kg）、正丙醇含量最低的樣品N30930（1 103 mg/kg），其理化指標(biāo)分析結(jié)果見表1。

表1 酒醅樣品的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of fermented grains samples

由表1可知，3份酒醅樣品pH值差異不顯著（P＞0.05）；總酸含量差異顯著（P＜0.05），樣品N30930的總酸含量最高，為8.28g/kg，比總酸含量最低的酒醅樣品N40217高3.51g/kg；水分含量差異極顯著（P＜0.01），正丙醇含量高的酒醅樣品N41328水分含量最低（42.8%），比正丙醇含量最低的酒醅樣品N30930低4.8%；酒醅樣品N41328還原糖含量最高，達(dá)42.5g/kg，比酒醅樣品N30930高13.9g/kg；酒醅樣品N41328的氨基酸態(tài)氮含量比酒醅樣品N30930低0.19 g/kg，氨基酸態(tài)氮含量N41328和N40217之間差異并不顯著（P＜0.05），但N30930與其他兩份樣品酒醅差異顯著（P＜0.05）。表明不同正丙醇產(chǎn)量酒醅的水分、總酸、還原糖存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 酒醅微生物多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)是用Chao1算法估計(jì)微生物群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高[29]。Shannon指數(shù)是用來估算樣品中微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高[30]。Coverage指數(shù)表示了樣本的覆蓋率，其指數(shù)越高，代表樣本測(cè)序的結(jié)果反映微生物群落越完整[31]。酒醅樣品中細(xì)菌、真菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果見表2。

表2 酒醅樣品中細(xì)菌及真菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial and fungal flora in fermented grains samples

由表2可知，所有樣本的覆蓋率均＞0.999，說明測(cè)序結(jié)果能夠完整反映各樣品酒醅細(xì)菌群落組成的信息。三個(gè)酒醅樣品細(xì)菌的Chao1指數(shù)在46.85～107.23之間，Shannon指數(shù)在0.93～1.76之間。三個(gè)酒醅樣品的群落豐富度和多樣性存在較大差異。樣品N41328的群落豐富度以及群落多樣性是3個(gè)樣品酒醅中最高的，Chao1指數(shù)為107.23，Shannon指數(shù)為1.76。

3個(gè)樣品的覆蓋率均在0.999以上，證明此結(jié)果可以完整的體現(xiàn)出酒醅的真菌群落情況。三個(gè)酒醅樣品真菌的Chao1指數(shù)在51.00～91.50之間，Shannon指數(shù)在1.49～1.92之間。其中，樣品N41328的真菌菌群豐富度是三個(gè)酒醅樣品中最高的，Chao1指數(shù)為91.50。N40217的真菌群落多樣性最高，Shannon指數(shù)達(dá)1.92。

2.2.2 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析

將平均相對(duì)豐度＞1.00%的菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)門或?qū)伲瑢⒉荒荑b定到屬水平的序列歸并為“unclassified”，將其他＜1.00%的屬求和后歸并為“others”?；趯偎降亩喅龀鼐契瑯悠分屑?xì)菌菌群組成見圖1。

由圖1可知，3個(gè)樣品中共檢出3個(gè)細(xì)菌屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。N41328的主要細(xì)菌屬為乳桿菌屬（相對(duì)豐度93.95%）、克羅彭斯特菌屬（相對(duì)豐度2.53%）和枝芽孢桿菌屬（相對(duì)豐度1.60%）。N40217的主要細(xì)菌屬為乳桿菌屬（相對(duì)豐度98.81%）。N30930的主要細(xì)菌屬為乳桿菌屬（相對(duì)豐度99.37%）。其中，乳桿菌屬是3份樣品中的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。酒醅樣品N41328和和N30930的乳桿菌屬相對(duì)豐度差異較明顯，樣品N41328的乳桿菌屬的相對(duì)豐度比樣品N30930低5.42%，樣品N41328的克羅彭斯特菌屬比樣品N30930高2.27%，樣品N30930未檢出枝芽孢桿菌屬。酒醅樣品N41328的克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）的相對(duì)豐度比樣品N40217分別高1.71%、1.55%。由以上結(jié)果可知，3個(gè)酒醅樣品的細(xì)菌群落組成差異明顯，對(duì)后續(xù)相關(guān)性分析提供了良好的分析基礎(chǔ)。

圖1 基于屬水平的酒醅樣品的細(xì)菌菌群組成Fig.1 Composition of bacterial flora of fermented grains samples based on genus level

由圖2可知，在3個(gè)酒醅樣品中共鑒定出13個(gè)真菌屬。與細(xì)菌群落相比，真菌群落在整個(gè)發(fā)酵過程中的群落組成更為復(fù)雜。其中，酒醅樣品N41328的主要真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）（相對(duì)豐度21.63%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（相對(duì)豐度11.11%）和毛孢子菌屬（Trichosporon）（相對(duì)豐度52.55%）等。在酒醅樣品N40217中，主要真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）（相對(duì)豐度22.72%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（相對(duì)豐度41.27%）、毛孢子菌屬（Trichosporon）（相對(duì)豐度9.84%）以及畢赤酵母屬（Pichia）（相對(duì)豐度14.50%）等。在酒醅樣品N30930中，主要真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）（相對(duì)豐度49.48%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（相對(duì)豐度15.86%）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（相對(duì)豐度17.36%）等。其中，曲霉屬和伊薩酵母屬是3種樣品中的共有優(yōu)勢(shì)真菌屬。畢赤酵母屬在酒醅樣品N40217中相對(duì)豐度較高；嗜熱子囊菌屬在酒醅樣品N30930中相對(duì)豐度較高；在酒醅樣品N41328中，毛孢子菌屬（Trichosporon）相對(duì)豐度較高（52.55%），比樣品N40217高42.71%，在酒醅樣品N30930中已檢測(cè)不到毛孢子菌屬（Trichosporon）。與細(xì)菌群落相比，真菌群落的差異更為明顯。

圖2 基于屬水平的酒醅樣品的真菌菌群組成Fig.2 Composition of fungal flora of fermented grains samples based on genus level

2.3 正丙醇與微生物及理化因子的相關(guān)性分析

正丙醇與真菌、細(xì)菌、理化因子的冗余分析結(jié)果見圖3。用物種樣品數(shù)據(jù)及理化因子（還原糖、水分、總酸、pH值以及氨基酸態(tài)氮）對(duì)正丙醇含量做消除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（detrended correspondence analysis，DCA）分析，第一軸的長(zhǎng)度＜3.0，所以采用RDA進(jìn)行分析。正丙醇用紅色箭頭表示，與真菌（a）、細(xì)菌（b）及理化因子（c）用藍(lán)色箭頭表示，雙色箭頭所呈夾角表示相關(guān)性，銳角為正相關(guān)，直角為不相關(guān)，鈍角為負(fù)相關(guān)。箭頭與原點(diǎn)的連線長(zhǎng)度代表著正丙醇與細(xì)菌、真菌以及理化指標(biāo)相關(guān)程度的大小，連線越長(zhǎng)，說明相關(guān)性越大，反之越小[32]。由圖3a可知，正丙醇含量97.7%的變化由真菌群落解釋。毛孢子菌屬（Trichosporon）與正丙醇夾角為銳角，呈正相關(guān)，曲霉屬（Aspergillus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、畢赤酵母屬與正丙醇夾角為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。由圖3b可知，乳桿菌屬（Lactobacillus）與正丙醇的夾角為鈍角，呈負(fù)相關(guān)，克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）以及枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）與正丙醇的夾角為銳角，呈正相關(guān)。由圖3c可知，還原糖與正丙醇呈正相關(guān)，氨基酸態(tài)氮、總酸以及水分與正丙醇的夾角為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。

圖3 正丙醇與真菌（a）、細(xì)菌（b）及理化因子（c）的冗余分析結(jié)果Fig.3 Redundancy analysis results of n-propanol with fungi (a),bacteria (b) and physicochemical factors (c)

2.4 討論

正丙醇是白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要高級(jí)醇之一。分析中國(guó)白酒發(fā)酵過程中理化因子以及微生物因素對(duì)正丙醇產(chǎn)出的影響，將有助于有效調(diào)控正丙醇的產(chǎn)生量。張春林等[33]分析了醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵過程中堆積酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律，其報(bào)道的真菌優(yōu)勢(shì)屬分別為曲霉屬、毛孢子菌屬和畢赤酵母屬，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為乳桿菌屬、枝芽孢桿菌屬和克羅彭斯特菌屬，與本研究結(jié)果相似。盧建軍等[34]研究結(jié)果表明，乳酸桿菌是白酒釀造中產(chǎn)正丙醇的重要微生物來源之一，其中，面包乳桿菌（Lactobacillus panis）代謝生成正丙醇的能力相對(duì)較強(qiáng)。曲冠頤等[35]通過接種庫德里阿茲氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）對(duì)高級(jí)醇的產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)控，結(jié)果表明菌劑的添加可以有效調(diào)控醇類物質(zhì)的產(chǎn)出，顯著降低高級(jí)醇的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)某白酒廠正丙醇含量高、中、低三種不同酒醅樣品的理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同正丙醇產(chǎn)量的酒醅中水分、總酸、還原糖以及氨基酸態(tài)氮的含量差異顯著（P＜0.05）。正丙醇含量高的酒醅水分和氨基酸態(tài)氮的含量均較低，還原糖含量較高；酒醅中共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）等，共有優(yōu)勢(shì)真菌屬均包括曲霉屬（Aspergillus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）。RDA結(jié)果表明，酒醅的水分、氨基酸態(tài)氮、總酸、乳桿菌屬、曲霉屬、伊薩酵母屬、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、畢赤酵母屬（Pichia）與正丙醇含量呈負(fù)相關(guān)，還原糖、毛孢子菌屬（Trichosporon）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）與正丙醇的產(chǎn)量呈正相關(guān)。本研究為有效地控制正丙醇的產(chǎn)量，控制白酒發(fā)酵過程中的風(fēng)味代謝，提高白酒質(zhì)量提供了一種有效的策略。相比于實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵，傳統(tǒng)白酒釀造工廠發(fā)酵過程中的微生物種類和影響因子更為復(fù)雜，今后還需深入研究白酒發(fā)酵中高級(jí)醇的產(chǎn)生機(jī)制，為進(jìn)一步人工定向調(diào)控和降低正丙醇等高級(jí)醇含量奠定理論基礎(chǔ)。