時 健，彭 俊，姚小磊，孫嘉檜，李銀鑫，彭清華

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410208；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 530022；4.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南長沙 410208）

青光眼作為目前不可逆眼部疾病的第一位，2040 年全球原發(fā)性青光眼患病人數(shù)超過1.118 億［1］。中國青光眼患者是目前全球青光眼患者人數(shù)最多的國家，我國40 歲及以上的總患病率為2.3%～3.6%，其中54.9%～82.0% 的青光眼患者未被診斷，6.3%～14.1%的青光眼患者雙眼致盲［2］，研究表明，72%的青光眼患者在就醫(yī)時已是晚期［3］。而控制眼壓是臨床上保存視力的較為重要的方式，但眼壓穩(wěn)定后，視力依舊出現(xiàn)下降的情況，這就是青光眼導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷。前期研究已經(jīng)表明青光安Ⅱ號方可能抑制Rho/ROCK 信號通路從而保護(hù)視網(wǎng)膜的作用［4］，但其僅蛋白水平進(jìn)行驗證，所以本次研究通過q?PCR 技術(shù)，從基因?qū)用孢M(jìn)一步驗證其是否通過抑制Rho/ROCK 信號通路，進(jìn)而保護(hù)DBA/2J 小鼠視網(wǎng)膜的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 取48 只健康DBA/2J 小鼠，質(zhì)量18～22 g，SPF 級，雌性，10 周齡，許可證號：SCXK（京）2016?0006，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；8 只C57BL/6J 小鼠，質(zhì)量18～22 g，SPF級，雌性，10 周齡，許可證號：SCXK（湘）2016?0002，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供。倫理批準(zhǔn)編號：LL20191008021。

1.1.2 實驗藥物 青光安Ⅱ號方湯劑：由枸杞（生產(chǎn)批號：SL19112203）、牛膝（ 生產(chǎn)批號：CK19101401）等用滅菌蒸餾水按規(guī)定比例煎煮；益脈康分散片（湖南湘雅制藥有限公司，批號：1903119）；青光安Ⅱ號方有效組分：是基于中藥高通量篩選體系［5］對青光安Ⅱ號方中藥組分進(jìn)行篩選，提取出青光安Ⅱ號方有效組分。

1.1.3 主要試劑與儀器 RNA 提取液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G3013）；三氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10006818）；異丙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：8010921）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10009218）；HyPureTMMolecular Biology Grade Wa?ter（HyClone，貨號：SH30538.02）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo，貨 號 ：#K1622）；Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：4913850001）。

勻漿儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：KZ?Ⅱ）；臺式高速冷凍型微量離心機(jī)［大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司，型號：D3024R］；熒光定量PCR 儀（賽默飛，型號：Stepone plus）；超凈工作臺（蘇凈安泰，型號：SW?CJ?1FD）；超微量分光光度（賽默飛，型號：NanoDrop2000）；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司，型號：FBZ2001?up?p）。

1.1.4 引物 引物合成公司：武漢賽維爾生物科技有限公司。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab 1 Primer sequence

1.2 實驗方法

1.2.1 動物及分組 將48 只DBA/2J 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6 組，每組8 只，設(shè)為模型組、益脈康分散片組、青光安Ⅱ號湯劑組、青光安Ⅱ號方有效組分低、中、高濃度組，同時使用8 只C57BL/6J 小鼠作為空白組。

1.2.2 模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)［6］，DBA/2J 小鼠喂養(yǎng)至38 周齡自動形成青光眼模型。觀察DBA/2J 小鼠眼壓及眼前節(jié)變化，確定是否形成青光眼模型。

1.2.3 給藥方式 待模型成立且穩(wěn)定后，開始灌胃，每日1 次，連續(xù)4 周。通過人/動物體表面積等效劑量比值表計算成人等效劑量。空白組和模型組予以等效劑量蒸餾水；益脈康分散片組予以等效劑量（0.31 g·kg?1·d?1）益脈康分散片懸混液；青光安Ⅱ號湯劑組予以等效劑量（9.67 g·kg?1·d?1）青光安Ⅱ號方湯劑；青光安Ⅱ號方有效組分低、中、高濃度組組分別予以成人等效劑量的1/2 倍、1 倍、2 倍（0.85、1.70、3.40 g·kg?1·d?1）青光安Ⅱ號方有效組分懸混液。

1.3 取材與檢測

將各組小鼠行處死，取出眼球，除去眼前節(jié)及玻璃體，迅速剝離出視網(wǎng)膜組織，低溫保存，供q?PCR 檢測。

1.3.1 眼壓檢測 使用Tono?pen AVIA 接觸式眼壓筆，取連續(xù)10 次測量的平均值（且LCD 上顯示置信指標(biāo)≥95）作為當(dāng)周該眼眼壓值，每4 周測1 次，從第10 周開始，待到DBA/2J 小鼠眼壓升高以及趨于穩(wěn)定后停測。

1.3.2 眼前節(jié)檢測 所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后接受眼前段裂隙燈檢查，每4 周檢查1 次。由3 位固定的實驗人員在檢查室內(nèi)進(jìn)行操作完成，一位負(fù)責(zé)將小鼠托舉在裂隙燈頜架裝置適當(dāng)高度位置，一位負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)焦距，通過目鏡觀察小鼠眼前段情況，觀察部位包括角膜、虹膜、前房、瞳孔、晶狀體等，一位負(fù)責(zé)電腦拍照。

1.3.3 q?PCR 檢測RhoA mRNA、ROCK mRNA、Caspase?3 mRNA 及Bcl?2 mRNA 轉(zhuǎn)錄的表達(dá) （1）RNA 抽提：在勻漿管中，加入1 mL 的Trizol Re?agent，置于冰上預(yù)冷，加入100 mg 組織，使用勻漿儀充分研磨，12 000 r/ min 離心10 min，取上清，加入250 μL 三氯甲烷，混勻后靜置3 min，1 2000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.8 倍體積的異丙醇，顛倒混勻，?20 ℃放置15 min，12 000 r/min 離心10 min。吸除液體，加入75% 乙醇1.5 mL 洗滌沉淀，12 000 r/min 離心5 min，吸出液體，將離心管置于超凈臺上吹3 min，加入15 μL 無RNA 酶的水溶解RNA，55℃孵育5 min，使用Nanodrop 2000 檢測RNA 濃度及純度。將濃度過高的RNA 進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為100～500 ng/μL。（2）反轉(zhuǎn)錄：取一PCR 管，加入含10 μL RNA 和1 μL oligo（dT）18，用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μL，于PCR 儀上65 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻，依次加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL10 mmol/L dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase 抑制劑（20 U/μL）和1 μL RevertAi M?MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL），混勻，于PCR 儀上42 ℃保溫60 min，結(jié)束后70 ℃保溫5 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。（3）定量PCR：取0.2 mL PCR 管，加入2×qP?CR Mix（12.5 μL），7.5 μmol/L 基因引物（2.0 μL），反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（2.5 μL），ddH2O（8.0 μL），3 管。PCR擴(kuò)增：預(yù)變性（95 ℃10 min），循環(huán)（40 次95 ℃15 s→60 ℃60 s），熔解曲線（60℃→95 ℃每15 s 升溫0.3 ℃），（4）結(jié)果處理：2?△△Ct法：△Ct 試驗=Ct 目的?Ct 內(nèi)參，△Ct 對照=Ct 目的?Ct 內(nèi)參；△△Ct=△Ct 實驗?△Ct 對照；相對表達(dá)量=2?△△Ct。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，行雙側(cè)檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計性意義。計量資料用（±s）表示。進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，進(jìn)行單因素方差分析或校正單因素方差分析。采用Tukey法進(jìn)行多組比較。若不滿足正態(tài)性要求，則采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 眼壓結(jié)果

C57BL/6J 小鼠眼壓持續(xù)穩(wěn)定，持續(xù)波動在11～14 mmHg，DBA/2J 小鼠眼壓從第10 周齡開始持續(xù)升高，38 周齡時達(dá)到（23.41±2.26）mmHg［4］，已形成高眼壓型小鼠模型，從第14 周開始，空白組眼壓與其他組眼壓比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），18 周以后眼壓差異較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

圖1 C57BL/6J 小鼠與DBA/2J 小鼠不同時間點眼壓比較Fig 1 IOP comparison at different time points between C57BL/6J mice and DBA /2J mice

2.2 眼前節(jié)檢測

C57BL/6J 小鼠眼前節(jié)無明顯變化（圖2A、B），DBA/2J 小鼠10 周齡時即出現(xiàn)角膜鈣化（圖2C）；且角膜鈣化加重，出現(xiàn)虹膜色素脫失播散，局部出現(xiàn)虹膜透照，虹膜基質(zhì)萎縮，瞳孔后粘連，到38 周齡時虹膜色素脫失加重，瞳孔移位，部分并發(fā)白內(nèi)障（圖2D）。

圖2 C57BL/6J 小鼠與DBA/2J 小鼠不同周齡眼前節(jié)情況Fig 2 Anterior segment of C57BL/6J mice and DBA/2J mice at different ages

2.3 q?PCR 檢測結(jié)果

在RhoA mRNA 的轉(zhuǎn)錄中，與空白組相比，其它6組的相對表達(dá)量均升高，但模型組、益脈康分散片組及青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組相比較，其它6 組的相對表達(dá)量均低于模型組，僅青光安Ⅱ號方湯劑組和青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組與青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其它無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。在ROCK mRNA 的轉(zhuǎn)錄中，與空白組比較，除高濃度組以外，其它5 組相對表達(dá)量明顯升高，但僅模型組、益脈康分散片組及青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；模型組的ROCK mRNA 轉(zhuǎn)錄高于其它6 組，與青光安Ⅱ號方有效組分中、高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組與益脈康分散片組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其它無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

表1 不同組RhoA mRNA 和ROCK mRNA 相對表達(dá)量比較（n=3，±s）Tab 1 Comparison of RhoA mRNA and ROCK mRNA rela?tive expression in different groups（n=3，±s）

表1 不同組RhoA mRNA 和ROCK mRNA 相對表達(dá)量比較（n=3，±s）Tab 1 Comparison of RhoA mRNA and ROCK mRNA rela?tive expression in different groups（n=3，±s）

注：與空白組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05；與青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組比較,△P<0.05；與青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組比較,▲P<0.05。

ROCK mRNA 1 125.20±13.13*62.79±1.30*▲47.54±1.88 52.10±2.85*25.35±6.12#9.03±0.76#19.549 0.003組別空白組模型組益脈康分散片組青光安Ⅱ號方湯劑組青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組青光安Ⅱ號方有效組分中濃度組青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組HP RhoA mRNA 1 7.30±0.83*4.21±0.25*3.71±0.30#4.83±0.12*4.06±0.70 1.97±0.12#△18.333 0.005

在Caspase?3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄中，與空白組比較，其它6 組相對表達(dá)量均上升，僅模型組、益脈康分散片組和青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，其它6 組均下降，青光安Ⅱ號方有效組分中、高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；益脈康分散片組和青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組與青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其它無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。在Bcl?2 mRNA 轉(zhuǎn)錄中，與空白組比較，其它6 組相對表達(dá)量均下降，模型組、青光安Ⅱ號方湯劑組和青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；青光安Ⅱ號方有效組分中、高濃度組的Bcl?2 mRNA 的相對表達(dá)量均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組與青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其它無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

表2 不同組Caspase?3 mRNA 和Bcl?2 mRNA 相對表達(dá)量比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of relative Caspase?3 mRNA and Bcl?2 mRNA expression of different groups（n=3，±s）

表2 不同組Caspase?3 mRNA 和Bcl?2 mRNA 相對表達(dá)量比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of relative Caspase?3 mRNA and Bcl?2 mRNA expression of different groups（n=3，±s）

注：與空白組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05；與青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組比較,△P<0.05；與青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組比較,▲P<0.05。

組別空白組模型組益脈康分散片組青光安Ⅱ號方湯劑組青光安Ⅱ號方有效組分低濃度組Caspase?3 mRNA 1 6.90±1.26*4.49±0.34*▲3.59±0.37 4.45±0.13*▲Bcl?2 mRNA 1 0.12±0.01*0.44±0.01 0.43±0.05*0.40±0.00*青光安Ⅱ號方有效組分中濃度組3.25±0.70#0.47±0.06#0.62±0.01#△18.068 0.006青光安Ⅱ號方有效組分高濃度組HP 1.86±0.09#19.132 0.004

3 討論

青光眼中晚期出現(xiàn)不可逆的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）及其軸突緩慢而漸進(jìn)地喪失是無法避免的，且在眼壓控制后的情況下，仍然不能緩解，所以如何保護(hù)視神經(jīng)和減少視神經(jīng)凋亡是目前研究的重點。前期研究發(fā)現(xiàn)青光安Ⅱ號方在視神經(jīng)保護(hù)中具有優(yōu)勢。我們之前發(fā)現(xiàn)青光安Ⅱ號方作用機(jī)制之一是通過抑制GSK?3β mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)β?catenin mRNA 表達(dá)，激活Wnt/β?catenin 信號通路［7］，而后上調(diào)PAX6、Ngn1、Ngn2 mRNA 的表達(dá)量［8］，從而發(fā)揮保護(hù)視神經(jīng)的作用。另一種機(jī)制為青光安Ⅱ號方對NF?кB/HIF?1α 通路的改變，抑制了BNIP?3 和SOD，前者減弱了RGCs 的線粒體自噬，而后者使MDA 的減少［9］。當(dāng)然也有可能是通過促進(jìn)HSP 的表達(dá)［10］，進(jìn)而保護(hù)了線粒體的功能，從而減弱視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的線粒體自噬。

而目前所研究的青光安Ⅱ號方有效成分是基于Wnt/β?Catenin/Pax6 的中藥高通量篩選體系進(jìn)行篩選的，同時也驗證了其通過Wnt/β?Catenin 信號通路對青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到保護(hù)作用［8］，所以筆者認(rèn)為Wnt/β?Catenin 信號通路與Rho/ROCK信號通路在保護(hù)青光眼視神經(jīng)作用上具有一定協(xié)同作用。研究表明玻璃體內(nèi)注射Rho?GTPase 抑制劑C3 轉(zhuǎn)移酶（BA?210）可提高RGC 的存活率和軸突再生［11］，同時短暫的視網(wǎng)膜缺血再灌注，主要是將白細(xì)胞通過血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤到神經(jīng)組織中，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元細(xì)胞的丟失［12］，而Rho/ROCK 信號通路主要使白細(xì)和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，使其減少浸潤［13］。ROCK 抑制劑Y?27632 可促進(jìn)原代RGCs?5 細(xì)胞系的活性，局部施用Rock/Net 抑制劑可促進(jìn)視神經(jīng)損傷后RGC 的存活和再生［14］。ROCK 抑制劑E212 治療可抑制氧化應(yīng)激和抗炎作用，減少RGCs 的損失［15］。Rho/ROCK 通路的失活可以促進(jìn)神經(jīng)突的再生［16，17］。

我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為青光眼是氣虛血瘀，脈絡(luò)阻滯，致目竅失養(yǎng)，而玄府閉塞，使神水瘀積［18］，所以在治療上采用益氣活血利水的治法［19］。青光安Ⅱ號方側(cè)重補(bǔ)肝腎之陰，同時在補(bǔ)益基礎(chǔ)上，活血利水行氣，氣行則血行、氣行亦水行，全方補(bǔ)通兼施，使目竅通暢、氣血調(diào)和。

實驗結(jié)果表明與之前的WB 結(jié)果相似［4］，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中RhoA mRNA、ROCK mRNA、Caspase?3 mRNA 轉(zhuǎn)錄時相對表達(dá)量升高，模型組明顯升高，其中青光安Ⅱ號方湯劑組和青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明青光安Ⅱ號方湯劑組和青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組具有較明顯的作用，而青光安Ⅱ號方有效組分的3 個組中，高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與青光安Ⅱ號方湯劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明高劑量組對RhoA mRNA、Caspase?3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄具有明顯的抑制作用。而Bcl?2 mRNA 的相對表達(dá)量均降低，其中模型組最低，而青光安Ⅱ號方有效組分中、高劑量組與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與空白組沒有差異，說明兩組有較為明顯的作用，同時而青光安Ⅱ號方有效組分的3 個組中，高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與青光安Ⅱ號方湯劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明青光安Ⅱ號方可以提高Bcl?2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，從而提高Bcl?2 的表達(dá)，來抑制Caspase?3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制Caspase?3。

但是筆者發(fā)現(xiàn)青光安Ⅱ號方有效組分中劑量組的ROCK mRNA 的表達(dá)量（25.35±6.12）與青光安Ⅱ號方湯劑組（47.54±1.88）有一定的差別，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.51），可能是因為有效成分對于ROCK mRNA 具有特定的抑制作用，而湯劑可能是因為含有的不明的成分對于有效成分有一定的抑制作用。所以根據(jù)其對于相關(guān)因子的表達(dá)量可以發(fā)現(xiàn)，青光安Ⅱ號方有效成分效果更好，可以為以后臨床用藥提供指導(dǎo)，通過改良劑型，以達(dá)到較好的療效。

所以本次實驗與之前的實驗結(jié)果相同，表明了高濃度青光安Ⅱ號方可能是通過抑制Rho/ROCK信號通路從而減弱了視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。

作者貢獻(xiàn)度說明：

時健：實驗，撰寫論文；彭俊：數(shù)據(jù)分析；姚小磊：指導(dǎo)實驗；孫嘉檜：實驗；李銀鑫：實驗；彭清華：指導(dǎo)與監(jiān)督。

本文無任何利益沖突。