李?lèi)?ài)花，王青青，秦迎春，謝亦璘，嚴(yán)志強(qiáng)

（1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001；2.中山市中醫(yī)院，廣東中山 528401；3.上海交通大學(xué)閔行校區(qū)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；4.安徽理工大學(xué)附屬奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海 201499）

心血管疾病在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。高血壓是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和病理性心室重構(gòu)中起重要作用［2］。作為受高血壓影響的多個(gè)器官之一，血壓長(zhǎng)期升高可引起以心肌肥厚和心肌纖維化為特征的病理性心室重塑。高血壓促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚性生長(zhǎng)，心肌細(xì)胞大小增加［3］。心肌細(xì)胞肥大被認(rèn)為是一種對(duì)超負(fù)荷刺激引起的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，持續(xù)的刺激會(huì)導(dǎo)致心臟失代償和心力衰竭［4］。高血壓可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)Ⅰ型膠原（Col1a）和Ⅲ型膠原（Col3a）過(guò)度表達(dá)，這兩種膠原積聚在間質(zhì)內(nèi)［4］。這些會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，并最終導(dǎo)致左心室功能障礙［3，4］。心室肥厚是高血壓患者發(fā)生心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚有助于降低患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）與病理性心室重構(gòu)有關(guān)［5］。血管緊張素原在肝臟中合成，經(jīng)腎素裂解為效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）［6］。作為RAS 的重要成員，Ang Ⅱ通過(guò)與血管緊張素Ⅱ型受體1（AGTR1）相互作用發(fā)揮作用［7］。RAS 成分也可以由細(xì)胞內(nèi)和局部組織產(chǎn)生，在組織重塑中發(fā)揮重要作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)AGTR1 和血管緊張素Ⅱ型受體2（AGTR2）［9］。Ang Ⅱ與AGTR1 的結(jié)合激活多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括促纖維化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β（TGF?β）通路［5］。TGF?β1 通路在刺激成纖維細(xì)胞的增殖和遷移以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積中起著關(guān)鍵作用［10］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制劑和Ang Ⅱ受體阻滯劑廣泛用于治療心血管疾?。?1］。然而，心力衰竭的發(fā)病率和死亡率仍然很高。因此，需要一種治療病理性心室重塑和心力衰竭的新策略。

卡格列凈是鈉?葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?2 抑制劑（SGLT2i）的成員之一，通過(guò)阻斷腎小球?qū)ζ咸烟堑脑傥斩档脱牵?2］?？ǜ窳袃粢驯挥糜谥委?型糖尿病患者。除了降低血糖外，越來(lái)越多的證據(jù)表明卡格列凈具有心血管保護(hù)作用。Meta 分析顯示卡格列凈治療顯著降低心衰事件［13］。有報(bào)道指出卡格列凈可改善心臟代謝和舒張功能，降低血管硬度，降低血壓［13，14］。體內(nèi)和體外的研究表明卡格列凈具有抗氧化和抗炎作用?？ǜ窳袃敉ㄟ^(guò)抑制mTOR/HIF?1α 信號(hào)通路顯著改善糖尿病小鼠心臟的心功能和炎癥反應(yīng)［15］?？ǜ窳袃敉ㄟ^(guò)刺激多種抗氧化和抗炎信號(hào)通路來(lái)減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激［16］。卡格列凈通過(guò)刺激抗氧化和抗炎信號(hào)傳導(dǎo)，減輕心臟的氧化應(yīng)激，改善心臟缺血再灌注損傷，改善心臟功能［17］。同樣，據(jù)報(bào)道，SGLT2i 的其他成員，如依格列凈，可以減輕糖尿病小鼠的心肌纖維化，并在壓力過(guò)度誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型中保持心肌功能［18，19］。雖然卡格列凈對(duì)心血管疾病的有益作用已有研究，但是，卡格列凈對(duì)高血壓引起的心臟重構(gòu)的影響仍未報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)卡格列凈可調(diào)節(jié)RAS 和TGF?β1/Smad 通路，可以預(yù)防高血壓引起的心肌纖維化和病理性心肌肥厚。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物治療

雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和正常血壓大鼠（WKY）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司［批號(hào)：SCXK（京）2016?0006］。用普通飼料和自來(lái)水喂養(yǎng)大鼠，并維持在標(biāo)準(zhǔn)溫度和光照條件下。20 周齡雄性大鼠隨機(jī)分為WKY 組、SHR 組、卡格列凈低劑量［SHR?CANA（30 mg/kg）］組和卡格列凈高劑量［SHR?CANA（60 mg/kg）］組，每組8 例?？ǜ窳袃羧苡?.8% 羧甲基纖維素鈉中，每日灌胃1 次。WKY 組和SHR 組只接受羧甲基纖維素鈉處理。采用尾袖法測(cè)量收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），使用BP?2010 系列血壓計(jì)（Softron Biotechnology，北京，中國(guó)）。給藥前及給藥第1～8 周連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠的血壓、血糖及體重，每周測(cè)量1 次，每次監(jiān)測(cè)時(shí)間為同一時(shí)間段。每周用血糖儀（魚(yú)躍，中國(guó)）測(cè)定空腹8 h血糖。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照中國(guó)衛(wèi)生部動(dòng)物管理規(guī)定（2001 年第55 號(hào)文件）進(jìn)行。

1.2 超聲心動(dòng)圖

治療8 周后，使用超聲系統(tǒng)（Vevo 2100，visual?sonic，Inc，Toronto，Canada）和15 MHz 高頻探頭對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。大鼠以異氟醚麻醉（1.5%）。評(píng)估以下指標(biāo)：舒張末期左室后壁厚度、收縮末期左室容積、舒張末期左室容積、收縮末期室間隔厚度、射血分?jǐn)?shù)。

1.3 組織切片

給藥治療8 周后處死。分別稱(chēng)量全心重量和左心室重量。部分左心室在4 ℃下用4%多聚甲醛固定過(guò)夜。然后將組織脫水并包埋在石蠟中。切片厚度為4 μm，蘇木精和伊紅（HE）染色檢測(cè)形態(tài)學(xué)。馬松（Masson）三色法染色評(píng)估心肌纖維化（Solar?bio，北京，中國(guó)）。切片圖像采用顯微鏡（BX53；奧林巴斯公司，日本東京）。使用ImageJ 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）

心肌組織樣品用TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國(guó)）提取總RNA。使用RT Master Mix 進(jìn)行PCR（MedChemExpress，New Jersey，USA）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用2×SYBR 預(yù)混Ex Taq 試劑盒與ROX（康為，中國(guó)）進(jìn)行RT?PCR。反應(yīng)在95℃下2 min，95℃5 s，60℃30 s，然后循環(huán)40 次。信號(hào)在ABI Q6 機(jī)器上檢測(cè)（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó)）。以GAPDH 作為內(nèi)參。采用2?ΔΔCt的方法計(jì)算。本研究使用的PCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequence primers

1.5 蛋白印跡法

左心室組織用含蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液裂解（MedChemExpress，New Jersey，USA）并超聲。蛋白濃度用BCA 法（碧云天，中國(guó)）測(cè)定。100 ℃煮沸10 min 后，蛋白經(jīng)10% SDS ?聚丙烯酰胺凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜（Thermofish，美國(guó)）。膜在室溫下用含5%的脫脂奶粉Tris 緩沖液封閉1 h 后，然后用Ⅰ型膠原（Col1a）（1∶1 000，Proteintech，美國(guó)）、Ⅲ型膠原（Col3a）（1∶1 000，Pro?teintech，美國(guó)）、MMP2（1∶1 000，Proteintech，美國(guó)）、TGF?β1（1∶1 000，CST，美國(guó)）、Smad4（1∶1 000，CST，美國(guó)）、GAPDH（1∶1 000，Proteintech，美國(guó)）和β?Tubulin（1∶1 000，Proteintech，美國(guó)）的抗體在4℃下孵育過(guò)夜。與二抗孵育后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（圣爾，中國(guó)）曝光蛋白條帶。用Tanon 圖像分析儀（Tanon Science，上海，中國(guó)）獲取圖像并進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 卡格列凈對(duì)各組血壓的影響

與WKY 組比較，SHR 組的收縮壓、舒張壓明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥2～8周，與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組及SHR?CANA（60 mg/kg）組收縮壓均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥2 周，與SHR 組比較，SHR?CANA（60 mg/kg）組舒張壓降低；給藥3～8周，SHR?CANA（30 mg/kg）組及SHR?CANA（60 mg/kg）組舒張壓較SHR 組均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 卡格列凈對(duì)各組血壓的影響（n=8，mmHg，±s）Tab 2 Effects of canagliflozin on blood pressure of rats in each groups（n=8，mmHg，±s）

表2 卡格列凈對(duì)各組血壓的影響（n=8，mmHg，±s）Tab 2 Effects of canagliflozin on blood pressure of rats in each groups（n=8，mmHg，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

時(shí)間（周數(shù)）收縮壓WKY 組140.70±4.40#139.50±5.43#150.70±9.44#144.00±8.17#147.60±12.09#149.30±10.07#138.00±5.60#156.80±9.70#147.20±1.97#2.661 0.001 012345678FP SHR 組201.80±21.91 209.40±8.70 230.30±14.49 212.30±7.88 217.50±16.20 226.50±13.71 208.00±7.024 235.70±5.30 234.60±15.78 SHR?CANA(30 mg/kg)組196.40±10.62 199.00±4.58 206.80±5.80#186.70±12.78#183.70±6.13#178.40±15.29#185.70±12.23#205.30±16.38#183.90±10.78#SHR?CANA(60 mg/kg)組207.80±9.43 196.30±6.21 191.80±10.59#187.20±12.81#183.70±10.85#185.80±17.57#173.30±5.73#202.60±14.73#175.80±11.5#舒張壓WKY 組113.60±2.20#111.90±4.90#112.80±3.20#114.80±3.50#112.80±5.69#119.10±3.18#114.50±3.82#108.30±1.87#104.30±4.63#7.832<0.001 SHR 組165.50±11.89 164.10±8.46 192.10±9.96 188.60±5.06 174.10±9.36 174.00±10.42 164.80±2.43 195.70±13.80 191.90±12.34 SHR?CANA(30 mg/kg)組169.30±8.30 172.80±15.03 187.00±11.26 151.40±6.73#146.70±8.84#144.30±12.90#133.80±9.95#158.80±7.41#140.00±10.65#SHR?CANA(60 mg/kg)組166.00±18.43 166.20±6.80 172.30±4.57#142.30±12.06#141.20±16.40#134.70±11.28#115.20±5.61#133.00±2.94#132.80±5.13#

2.2 卡格列凈對(duì)各組血糖和體重的影響

與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組在給藥后1～8 周血糖降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由于卡格列凈在糖尿病患者和動(dòng)物模型中有降低體重的作用［13，20］，筆者研究了卡格列凈對(duì)SHR 體重的影響。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組較SHR 組體重均有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。

表3 卡格列凈對(duì)各組不同時(shí)期血糖和體重的影響（n=8，±s）Tab 3 Effects of canagliflozin on blood glucose and body weight of rats in each groups in different periods（n=8，±s）

表3 卡格列凈對(duì)各組不同時(shí)期血糖和體重的影響（n=8，±s）Tab 3 Effects of canagliflozin on blood glucose and body weight of rats in each groups in different periods（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

時(shí)間（周數(shù)）血糖(mmol/L)體重(g)WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組6.90±0.22 6.60±0.34#5.68±0.76#4.95±0.26#4.40±0.32#5.08±0.26#4.93±0.28#4.38±0.70#4.68±0.33#SHR?CANA(60 mg/kg)組6.80±0.37 6.55±0.58#5.60±0.36#4.98±0.81#4.00±0.24#4.15±0.17#4.78±0.28#4.48±0.36#4.18±0.30#WKY 組SHR 組012345678FP 6.73±0.22 7.00±0.56 7.00±0.56 6.48±0.66 6.30±0.32 6.33±0.67 6.40±0.50 6.53±0.92 6.50±0.59 7.23±0.81 7.83±0.55 7.03±0.76 6.70±0.55 6.20±0.53 6.80±0.50 6.50±0.41 7.08±1.10 6.63±0.46 313.00±8.29 327.80±19.33 334.80±15.44 343.00±8.76 335.30±6.70 339.80±6.70 332.50±6.25 341.00±3.74 342.50±10.41 319.30±17.67 330.80±7.27 337.80±3.10 336.00±7.87 338.00±4.69 350.80±7.32 347.00±4.76 348.80±7.54 339.00±6.83 SHR?CANA(30 mg/kg)組304.50±8.89 292.00±9.42#267.80±4.19#280.50±5.75#258.50±10.34#257.00±14.67#262.80±10.50#258.00±7.70#250.00±13.76#SHR?CANA(60 mg/kg)組312.50±16.92 296.00±9.90#291.30±6.24#271.30±3.86#259.80±2.87#255.00±8.60#246.30±7.46#244.00±8.60#252.00±5.29#2.553 0.001 51.027<0.001

2.3 卡格列凈對(duì)各組左心室肥厚及功能的影響

卡格列凈治療8 周后，SHR 組的室間隔厚度、左室后壁厚度、收縮期末容積均較WKY 組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組室間隔厚度、左室后壁厚度、收縮期末容積均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。檢測(cè)心臟重量/體重（HW/BW）和左心重量/心臟重量（LHW/HW）的比值，與WKY組相比，SHR組的HW/BW和LHW/HW增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組的HW/BW 和LHW/HW 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HE 染色結(jié)果顯示，與WYK 相比，SHR 組心肌細(xì)胞橫截面積較WKY 組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組心肌細(xì)胞橫截面積顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1和表5。

表5 卡格列凈對(duì)各組心肌肥厚的影響（n=8，±s）Tab 5 Effects of canagliflozin on myocardial hypertrophy in each group（n=8，±s）

表5 卡格列凈對(duì)各組心肌肥厚的影響（n=8，±s）Tab 5 Effects of canagliflozin on myocardial hypertrophy in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

HE 染色（心肌細(xì)胞橫截面積，μm2）組別全心/體重(g/g)左心/全心(g/g)0.003 3±0.000 15#0.69±0.005 6#6 565.00±375.50#0.004 0±6.923e?0050.80±0.02314 030.00±885.40 0.003 7±1.431e?005#0.72±0.032#7 067.00±371.60#0.003 5±0.000 13#0.73±0.047#5 770.00±557.60#32.958.45169.80 0.000 10.002 70.000 1 WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組FP

圖1 各組心肌組織HE 染色（×40）Fig 1 HE staining of myocardial tissue in each group（×40）

表4 卡格列凈對(duì)各組左心室肥厚及功能的影響（n=8，±s）Tab 4 Effects of canagliflozin on left ventricle cardiac hyper?trophy and function in SHRs（n=8，±s）

表4 卡格列凈對(duì)各組左心室肥厚及功能的影響（n=8，±s）Tab 4 Effects of canagliflozin on left ventricle cardiac hyper?trophy and function in SHRs（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

組別收縮期末容積(μL)左室后壁厚度（mm）室間隔厚度(mm)WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組85.45±21.19#125.40±23.44 91.09±9.76#84.97±14.15#5.88 0.008 50.001 00.006 6 FP 1.68±0.20#2.09±0.25 1.67±0.20#1.63±0.17#5.52 2.68±0.14#3.32±0.27 2.80±0.39#2.47±0.22#8.95

2.4 卡格列凈對(duì)各組心肌纖維化的影響

組織學(xué)檢查顯示，SHR 組心肌間質(zhì)膠原體積較WKY 組增加，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組減少。見(jiàn)圖2。與WKY組相比，SHR 組Col1a 和Col3a 的表達(dá)顯著升高。與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組Col1a 和Col3a 的表達(dá)被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。與WKY 組相比，SHR 組MMP2 的相對(duì)mRNA 和蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。然而，與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組MMP2 表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2～4 和表6。

表6 卡格列凈對(duì)各組心肌纖維化的影響（n=8，±s）Tab 6 Effects of canagliflozin on myocardial fibrosis in each group（n=8，±s）

表6 卡格列凈對(duì)各組心肌纖維化的影響（n=8，±s）Tab 6 Effects of canagliflozin on myocardial fibrosis in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.05。

組別WKY 組Col1a/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#Col1a/β?tubulin(western?blotting)0.067±0.003 2#Col3a/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#MMP2/β?tubulin(western?blotting)0.34±0.22#MMP2/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組2.17±0.89 0.72±0.31#0.48±0.19#0.310±0.031 0.110±0.067#0.043±0.019#2.32±0.83 0.83±0.34#0.17±0.070#1.25±0.33 1.15±0.062#0.24±0.17#3.43±0.78 1.31±0.24#0.39±0.072#FP 7.292 27.68 12.16 16.61 31.35 0.0001 0.0112 0.0001 0.0024 0.0009

圖2 各組心肌Masson 三色法染色（×40）Fig 2 Myocardial Masson Trichrome Stain in each group（×40）

2.5 卡格列凈對(duì)各組心肌組織AGTR1、AGTR2、Renin、TGF?β1 和Smad4 表達(dá)的影響

與WKY 組相比，SHR 組的TGF?β1 及Smad4的mRNA 和蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組的TGF?β1 及Smad4 的mRNA 和蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與WKY 組相比，SHR 組AGTR1 和腎素中mRNA 水平升高，而與WKY 組相比，SHR組AGTR2 mRNA 水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組AGTR1 及Renin 的mRNA 的表達(dá)降低，而SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組中AGTR2 mRNA 的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖5、6 及表7、8。

表7 卡格列凈對(duì)各組心肌組織TGF?β1 和Smad4 表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 7 Effects of canagliflozin on the expression of TGF?β1 and Smad4 in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

表7 卡格列凈對(duì)各組心肌組織TGF?β1 和Smad4 表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 7 Effects of canagliflozin on the expression of TGF?β1 and Smad4 in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

組別TGF?β1/GAPDH（RT?PCR）Smad4/β?tubulin(western?blotting)Smad4/GAPDH（RT?PCR）TGF?β1/β?tubulin(western?blotting)WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組1.00±0.00#2.28±0.49 1.35±0.059#0.90±0.47#45.9816.0311.0313.4 0.000 10.0010.003 20.000 4 FP 0.35±0.13#1.72±0.19 0.46±0.13#0.59±0.18#0.42±0.015#1.00±0.00 0.51±0.015#0.39±0.13#0.44±0.068#1.51±0.54 0.37±0.028#0.51±0.12#

圖5 各組心肌Smad4 的蛋白表達(dá)Fig 5 Protein expression of myocardial Smad4 in each group

圖3 各組心肌Col1a 的蛋白表達(dá)Fig 3 Protein expression of myocardial Col1a in each group

圖4 各組心肌MMP2 的蛋白表達(dá)Fig 4 Protein expression of myocardial MMP2 in each group

圖6 各組心肌TGF?β1 的蛋白表達(dá)Fig 6 Protein expression of myocardial TGF?β1 in each group

表8 卡格列凈對(duì)各組心肌組織AGTR1、AGTR2、腎素表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 8 Effects of canagliflozin on the expression of AGTR1，AGTR2 and renin in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

表8 卡格列凈對(duì)各組心肌組織AGTR1、AGTR2、腎素表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 8 Effects of canagliflozin on the expression of AGTR1，AGTR2 and renin in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01,#P<0.05。

Renin/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#4.78±1.89 1.39±0.52#0.96±0.19#10.51 0.0038組別WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組FP AGTR1/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#4.61±0.99 1.24±0.46#0.54±1.60#34.34 0.0001 AGTR2/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#0.17±0.019 0.84±0.36#0.62±0.25#10.53 0.0011

3 討論

本研究旨在探討卡格列凈對(duì)高血壓引起的心臟重構(gòu)的影響?？ǜ窳袃舾深A(yù)可減輕SHR 心肌肥厚、纖維化和心功能障礙?？ǜ窳袃粝抡{(diào)了Col1a、Col3a、MMP?2、TGF?β1 和Smad4 等纖維化分子標(biāo)志物的表達(dá)。研究證明卡格列凈可抑制AGTR1 和Renin mRNA 表達(dá)，但上調(diào)了AGTR2 mRNA 的水平。這些結(jié)果表明，卡格列凈可以改善SHR 的心室重構(gòu)，這為卡格列凈對(duì)心血管疾病的治療提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

卡格列凈最初用于控制血糖，也被發(fā)現(xiàn)具有心血管保護(hù)作用。CANVAS 試驗(yàn)表明卡格列凈降低了2 型糖尿病患者心血管疾病死亡的風(fēng)險(xiǎn)［12，13］。降低心血管死亡率的機(jī)制包括降低血壓、減輕體重、改善血管硬度、改善血糖和促進(jìn)利尿。本研究表明，卡格列凈治療可以降低血壓、體重和血糖。我們的結(jié)果與其他研究報(bào)道結(jié)果一致。最近的一項(xiàng)研究表明卡格列凈治療2 型糖尿病患者24 周后顯著降低體重［21］。在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中也可以觀察到類(lèi)似的結(jié)果，這些小鼠的脂肪量和白色脂肪組織重量都減少［22］。這種減少可能與卡路里損失的誘導(dǎo)有關(guān)［19］。與其他藥物相比，卡格列凈治療可降低2 型糖尿病患者的收縮壓和舒張壓［23］。在用卡格列凈治療的非糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)血壓也降低［17］。一些研究表明卡格列凈促進(jìn)小鼠、大鼠和家兔對(duì)乙酰膽堿的血管舒張敏感性，這可能有助于解釋卡格列凈降低血壓的作用［17，24，25］。卡格列凈作為一種降糖藥，可以降低糖尿病小鼠和大鼠的循環(huán)血糖濃度，但不能降低非糖尿病動(dòng)物的血糖濃度［26，27］。本實(shí)驗(yàn)表明卡格列凈治療SHRs 的血糖水平降低，這是有爭(zhēng)議的。這一差異可能與不同動(dòng)物模型和不同劑量的卡格列凈有關(guān)。

心肌肥厚的特點(diǎn)是心肌數(shù)量增加，心室厚度增加，心肌細(xì)胞大小增加，心功能受損，是心血管死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3，4，28］。因此，減輕心肌肥厚對(duì)預(yù)防心血管疾病的進(jìn)一步死亡至關(guān)重要。研究報(bào)道了SGLT?2i 在減輕心肌肥厚方面的有效性。Shi 等［29］觀察到達(dá)格列凈治療后降低了主動(dòng)脈橫向收縮小鼠升高的HW/BW 比、左室直徑、左室后壁厚度和左室射血分?jǐn)?shù)。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，達(dá)格列凈通過(guò)調(diào)節(jié)TGF?β1/Smad 通路改善Ang Ⅱ輸注SD 大鼠的心肌肥厚和左心室功能［30］。在使用依格列凈治療的肥胖大鼠中，心臟重量和左心室體積的增加得到了改善［31］。同樣，有研究表明卡格列凈治療3個(gè)月顯著改善了2 型糖尿病患者的左心室舒張功能［14］。有報(bào)道稱(chēng)卡格列凈對(duì)非糖尿病雄性大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，并可減輕糖尿病和非糖尿病心臟心肌梗死［17，26］。與之前的研究一致，本實(shí)驗(yàn)表明，與SHR 相比，卡格列凈治療SHR 顯著降低了HW/BW 比、LVW/HW 比、心肌細(xì)胞大小、左室壁厚度、室間隔厚度和左室收縮期末容積。表明卡格列凈可以改善心室重構(gòu)。

心肌纖維化與心功能障礙密切相關(guān)［3，4，10］。眾所周知，長(zhǎng)期高血壓可誘發(fā)心肌纖維化［3，4，10］。心肌纖維化的特點(diǎn)是膠原過(guò)度積累和細(xì)胞外基質(zhì)降解，增加舒張強(qiáng)度，引起左室舒張功能損害［10］。膠原蛋白由成纖維細(xì)胞合成，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分別占心臟膠原蛋白的80%和10%。慢性壓力超負(fù)荷可促進(jìn)膠原基因表達(dá)和膠原蛋白合成。多項(xiàng)研究表明SHR 心臟中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)高于WKY［32，33］。高血壓引起的心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明，異常的基質(zhì)金屬蛋白酶活性可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)破壞和基質(zhì)降解［34］。MMP2 在鹽敏感的高血壓大鼠和SHR 大鼠心肌組織中表達(dá)增加。有研究表明，MMP2 調(diào)節(jié)膠原合成和心臟基質(zhì)重塑。MMP2 敲除可減少心肌肥厚并改善心肌纖維化，而MMP2 過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)心肌肥厚和心肌纖維化［35，36］。本研究發(fā)現(xiàn)SHR 大鼠心臟組織中膠原沉積以及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和MMP?2中mRNA 和蛋白水平增加，卡格列凈治療后可使其減弱。研究提示MMP2 可能參與卡格列凈在心臟重構(gòu)中的保護(hù)作用。

TGF?β 信號(hào)通路在心肌重塑的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［9］。作為纖維形成的主要介質(zhì)，TGF?β1 已被證實(shí)在高血壓大鼠的心臟組織中過(guò)度表達(dá)和激活［9］。許多研究表明TGF?β1 在心臟重塑中的重要性。例如，TGF?β1 在轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)表達(dá)可促進(jìn)心肌肥厚和纖維化，而TGF?β1 缺乏的雜合小鼠心肌纖維化減弱［37，38］。TGF?β1 通過(guò)典型的Smad 依賴(lài)信號(hào)通路發(fā)揮促纖維化活性。TGF?β1與特異性TGF?β Ⅱ型受體結(jié)合后，受體調(diào)節(jié)的R?SMADs（SMAD2，SMAD3）被激活。R?SMADs與常見(jiàn)Smad4 結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核并調(diào)控其下游基因表達(dá)［6，7，11］。最近的研究表明，TGF?β1 誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中Smad4的表達(dá)［39］。在慢性心肌梗死瘢痕和壓力超載的小鼠心臟中TGF?β1 和Smad4 表達(dá)升高［3，40，41］。使用NLRP3 抑制劑MCC950 抑制TGF?β1 和Smad4 的上調(diào)，同時(shí)減輕心肌肥厚和纖維化［39］。同樣，達(dá)格列凈通過(guò)降低TGF?β1 的表達(dá)抑制血管內(nèi)皮素誘導(dǎo)的肥大和纖維化［26］。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)表明卡格列凈可減少SHR 心肌組織中TGF?β1 和Smad 4 的表達(dá)，從而減輕高血壓引起的病理性心臟重構(gòu)。

有研究報(bào)道，腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）與高血壓引起的心肌重塑密切相關(guān)［3，6，7］。RAS 包括循環(huán)RAS 和組織RAS。越來(lái)越多的研究表明，組織RAS 可影響心臟，對(duì)病理性心臟重塑有更直接的影響［6，7］。較多的證據(jù)表明，Ang Ⅱ通過(guò)與AGTR1 相互作用可促進(jìn)心臟重構(gòu)，而AGTR2 被認(rèn)為具有心臟保護(hù)作用［6?8］。有報(bào)道稱(chēng)，持續(xù)輸注Ang Ⅱ誘導(dǎo)大鼠使心臟AGTR1 表達(dá)和AGTR2 表達(dá)減少，并伴有心肌肥厚、心肌纖維化和血壓升高［42］。在高鹽飼料喂養(yǎng)的大鼠中，發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ和AGTR1 在心臟中表達(dá)增加［8，43］。同樣，SHR 心肌組織中腎素、AG?TR1、Ang Ⅱ表達(dá)上調(diào)，AGTR2 表達(dá)下調(diào)［44］。通過(guò)調(diào)節(jié)RAS 的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)高血壓引起的病理性心臟重塑。例如，纈沙坦通過(guò)調(diào)節(jié)AGTR1、AGTR2、ACE1 和ACE2 表達(dá)的表達(dá)，防止SHR 的心肌肥大和纖維化［45］。擬鈣蛋白R(shí)568 通過(guò)調(diào)節(jié)腎素、AngⅡ、AGTR1 和AGTR2 的表達(dá)改善高血壓誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)［44］。在本實(shí)驗(yàn)中，心臟組織中腎素、AGTR1表達(dá)增加，而AGTR2 表達(dá)減少?？ǜ窳袃艨赡孓D(zhuǎn)其表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明卡格列凈對(duì)SHR 心肌重構(gòu)的有益影響是通過(guò)調(diào)節(jié)RAS 介導(dǎo)的。

綜上所述，本研究表明卡格列凈治療通過(guò)調(diào)節(jié)RAS 和TGF?β1/Smad 信號(hào)通路減輕高血壓所致心肌肥厚和纖維化。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

李?lèi)?ài)花：實(shí)驗(yàn)操作、指標(biāo)檢測(cè)，撰寫(xiě)論文；秦迎春、謝亦璘：協(xié)助實(shí)驗(yàn)造模；王青青：數(shù)據(jù)分析；嚴(yán)志強(qiáng)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、論文修改、審閱。

本文無(wú)任何利益沖突。