肖 雨 翁秋燕 邵 磊 薛 陽 吳 璨 郭 蕾1，牛艷芳 鮑曉明 徐淑君*

（1）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心，寧波 315020；2）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江省病理生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211；3）中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院，寧波 315010；4）中國科學(xué)院大學(xué)寧波生命與健康產(chǎn)業(yè)研究院，寧波 315010）

周圍神經(jīng)損傷（peripheral nerve injury，PNⅠ）主要是由于牽拉傷、切割傷、火器傷、壓迫性損傷、缺血等原因?qū)е碌亩虝夯蚪K生的神經(jīng)功能障礙，它的病理變化包括軸漿運(yùn)輸受損、軸突變性、施萬細(xì)胞損傷、節(jié)段性脫髓鞘和完全瓦勒氏變性［1-2］。美國2009～2018 年間，單上肢PNⅠ發(fā)生率顯著上升，年平均發(fā)病率為36.9%，2018年發(fā)病率為51.9%［3］。損傷程度較重時，自發(fā)周圍神經(jīng)再生、感覺和運(yùn)動功能的恢復(fù)并不完全［4］。對于近距離周圍神經(jīng)斷裂，臨床上常采用顯微手術(shù)縫合斷端神經(jīng)，治療后患者可部分恢復(fù)神經(jīng)功能。對于較大的周圍神經(jīng)缺損（大鼠＞1 cm，人＞3 cm），自體神經(jīng)移植（autogenous nerve transplantation，ANT）是治療的金標(biāo)準(zhǔn)，對側(cè)第7 頸神經(jīng)（contralateral seventh cervical nerve，CC7）交叉移植手術(shù)為單側(cè)臂痙攣性麻痹超過5年的患者提供有效、安全和穩(wěn)定的功能改善。與未移植患者相比，CC7交叉移植后無論是1年還是2年的隨訪，患者癱瘓手臂痙攣程度都顯著降低，功能顯著改善［5-6］。除了自體移植以外，尋找組織工程神經(jīng)移植物修復(fù)周圍神經(jīng)損傷成為了現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，最近研究表明干細(xì)胞移植、神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophin，NT）、新型生物材料、電針刺激等對于神經(jīng)損傷的修復(fù)具有很好的改善作用［7-13］。因此，本文將從干細(xì)胞移植、NT、新型材料、電針刺激以及它們聯(lián)合應(yīng)用在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述（圖1）。

1 干細(xì)胞移植在周圍神經(jīng)損傷中的作用

干細(xì)胞移植對周圍神經(jīng)再生提供了一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的替代療法，它可以分泌細(xì)胞因子促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，提高髓鞘形成和神經(jīng)的存活［7-8］。將牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）分化的神經(jīng)譜系細(xì)胞（neural lineage cells，NLCs）移植到具有10 mm 坐骨神經(jīng)缺損的免疫缺陷大鼠模型中，移植2 周后，NLCs 分化成類施萬細(xì)胞。移植12 周后類施萬細(xì)胞存活，軸突生長、髓鞘重新形成、神經(jīng)電生理活性增強(qiáng)、腓腸肌萎縮改善。體外研究表明，NLCs 以旁分泌依賴的方式增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞、施萬細(xì)胞和神經(jīng)元的活性［7］。骨骼肌源性干細(xì) 胞 （skeletal muscle-derived stem cells， Sk-MSCs）分泌的細(xì)胞因子混合劑同樣對周圍神經(jīng)再生有促進(jìn)作用。切除小鼠坐骨神經(jīng)6 mm，并連接膠原管，術(shù)后6周，Sk-MSCs分泌的細(xì)胞因子增加神經(jīng)軸突和有髓纖維密度，顯著提高足底屈肌的張力，改善肌肉的功能［8］。干細(xì)胞移植過程中可能存在免疫排斥問題，局部遞送免疫抑制劑他克莫司顯著改善神經(jīng)同種異體移植物中運(yùn)動和感覺神經(jīng)元的再生［14］。

2 NT在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制

NT 在促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)中起了積極的作用，NT 聯(lián)合干細(xì)胞比單獨(dú)干細(xì)胞更有利于周圍神經(jīng)再生和功能恢復(fù)［9］。NT 聯(lián)合干細(xì)胞治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷（sciatic nerve injury，SNⅠ）比單獨(dú)干細(xì)胞治療相比，聯(lián)合治療的大鼠在SNⅠ后2、4、8周的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)顯著提高，肌肉重量恢復(fù)率提高［9］。

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）能刺激神經(jīng)再生，它是神經(jīng)元分化、促進(jìn)突起生長和突觸連接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［9-10］。研究表明，肌肉移植后應(yīng)用NGF 和層黏連蛋白對神經(jīng)修復(fù)有一定的治療作用［10］。通過步態(tài)分析、逆行Dil標(biāo)記神經(jīng)元和組織學(xué)研究的比較，發(fā)現(xiàn)肌肉移植+NGF+層黏連蛋白組術(shù)后第29 天步行能力明顯改善，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)均值明顯高于對照組，并且肌肉移植+NGF+層黏連蛋白移植組遠(yuǎn)端有髓軸突的平均數(shù)量明顯高于單獨(dú)肌肉移植組［10］。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）對于神經(jīng)的修復(fù)也起了重要作用。有研究用離靶肌相對較近的頸前根撕脫模型探討GDNF治療對頸前根撕脫后軸突再生的影響。在這個模型中，遠(yuǎn)側(cè)手部肌肉位于離再植入點(diǎn)6.5 cm處。此時神經(jīng)中的施萬細(xì)胞保留一定支持軸突再生的能力。結(jié)果表明，在脊髓神經(jīng)撕脫損傷后，增加GDNF含量顯著促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元存活、刺激遠(yuǎn)端軸突生長、促進(jìn)靶肌肉神經(jīng)的再支配和自主前爪功能恢復(fù)［15］。因此，GDNF 對神經(jīng)損傷修復(fù)有一定的促進(jìn)作用。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育所需的營養(yǎng)因子，在自然發(fā)生的細(xì)胞死亡期間，缺乏BDNF 營養(yǎng)支持的神經(jīng)元就會丟失［16］。據(jù)報道，BDNF增強(qiáng)了神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)了神經(jīng)元向損傷區(qū)的遷移，并具有抗凋亡作用［17］。研究表明，含BDNF負(fù)載型復(fù)合導(dǎo)管，其最少能保持BDNF生物活性3個月，且該類型導(dǎo)管的使用能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)的10 mm缺損再生［18］。

3 新型材料在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制

ANT 存在一定的局限性，其可能導(dǎo)致供體神經(jīng)功能損傷。新型生物材料為促進(jìn)神經(jīng)再生提供了新方法［11-12］。根據(jù)損傷程度不同，結(jié)合各種材料的特性，可以選用不同類型的新型生物材料。對于較小的缺損，新型納米材料可以促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的恢復(fù)。研究表明，納米氧化鈰對擠壓導(dǎo)致的大鼠坐骨神經(jīng)損傷恢復(fù)起促進(jìn)作用，大劑量氧化鈰納米顆?？娠@著提高損傷后坐骨神經(jīng)的再生速度，并且提高擠壓損傷坐骨神經(jīng)的有髓纖維數(shù)和髓鞘厚度。因此，該納米粒子可作為神經(jīng)系統(tǒng)再生的一種新的治療方法［19］。

當(dāng)神經(jīng)損傷較長，采用新型的生物材料構(gòu)建組織工程神經(jīng)移植物（tissue engineered nerve graft，TENG），可顯著促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生。新型殼聚糖支架（chitosan scaffold，CS）負(fù)載堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）聯(lián)合處理顯著的修復(fù)Wistar 大鼠2 cm 坐骨神經(jīng)缺損。利用拉伸試驗(yàn)機(jī)和納米壓痕儀對其力學(xué)性能進(jìn)行評價，采用霍亂毒素B 亞單位（cholera toxin B subunit，CTB）示蹤、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、肌電圖、再生神經(jīng)免疫熒光染色及運(yùn)動終板觀察大鼠坐骨神經(jīng)再生情況。結(jié)果表明，bFGF-CS的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能有利于坐骨神經(jīng)的再生。術(shù)后12周，bFGFCS促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)再生［20］。采用靜電紡絲和機(jī)械拉伸相結(jié)合的方法制備殼聚糖納米纖維，負(fù)載分別模擬BDNF 和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，ⅤEGF）的生物活性肽RGⅠ和KLT，構(gòu)建殼聚糖RGⅠ/KLT 神經(jīng)移植物，用于修復(fù)15 mm大鼠坐骨神經(jīng)缺損。移植12周后，殼聚糖RGⅠ/KLT 神經(jīng)移植物顯著促進(jìn)了大鼠的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)［12］。

3-羥基辛酸-co-3-羥基癸酸/聚己內(nèi)酯P(3HO-3HD)/PCL75/25也是一種很有前途的天然和合成生物材料混合物，用其制造的NGCs的力學(xué)性能與大鼠坐骨神經(jīng)的力學(xué)性能相當(dāng)，500 μm P(3HO-3HD)/PCL75/25 導(dǎo)管具有足夠的剛度、力學(xué)性能、孔滲關(guān)系，在保持足夠的剛度和較低的生物降解率的同時有良好的神經(jīng)再生能力，能夠支持大鼠坐骨神經(jīng)間隙（相當(dāng)于人的3 cm 神經(jīng)間隙）中的周圍神經(jīng)再生［21］。

蠶絲絲素纖維（silk fibroin，SF）是一種具有高度生物相容性的組織工程材料。采用SF 靜電紡纖維連接30 mm 長的狗坐骨神經(jīng)間隙，術(shù)后12 個月，SF 靜電紡纖維移植組承重、最大張力、站立時間比未移植對照組比顯著增加。SF 靜電紡纖維移植組復(fù)合肌肉動作電位、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、感覺神經(jīng)元和運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目均與自體神經(jīng)移植組類似，提示SF 靜電紡纖維是自體神經(jīng)移植潛在的替代物［22］。將狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）培養(yǎng)在殼聚糖/SF支架表面后脫細(xì)胞形成含脫細(xì)胞基質(zhì)（acellular matrix，ACM）涂層的TENG，用于連接狗坐骨神經(jīng)中60 mm長的神經(jīng)間隙。研究表明，含ACM的TENG顯著增強(qiáng)軸突再生和施萬細(xì)胞增殖。移植后12 個月，通過行為、功能和組織學(xué)的評估發(fā)現(xiàn)，采用這種神經(jīng)支架的治療效果與自體神經(jīng)移植的效果非常接近［23］。含ACM的TENG用于修復(fù)大鼠臂叢神經(jīng)同樣具有較好的效果。將皮膚源性施萬細(xì)胞前體細(xì)胞（skin-derived precursor Schwann cells，SKP-SCs）與SF一起培養(yǎng)后脫細(xì)胞形成含ACM的SF，把10 束SF 放入導(dǎo)管中制備成TENG，用于連接大鼠臂叢神經(jīng)8 mm 的間隙。術(shù)后2 周進(jìn)行的組織學(xué)分析顯示，TENG 的治療促進(jìn)了軸突的生長。術(shù)后4周進(jìn)行行為測試顯示，TENG治療的大鼠與自體移植治療的大鼠表現(xiàn)相似。這些結(jié)果為含SF的TENG在臨床上應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)［24］。

甲氧基聚乙二醇-b- 聚γ - 乙基谷氨酸酯（Methoxy-poly(ethylene glycol)-b-poly(γ-ethyl-Lglutamate)，mPEG-PELG）溫敏水凝膠可以在體溫下進(jìn)行溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，用該凝膠包裹神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF，在手術(shù)中注射后可在管腔中形成凝膠，起到緩慢釋放NT 的作用。NGF 負(fù)載的mPEGPELG能在28 d內(nèi)穩(wěn)定釋放有生物活性的NGF。含NGF 組織工程神經(jīng)移植物（支架+NGF/mPEGPELG）對促進(jìn)大鼠1 cm坐骨神經(jīng)缺損的再生效果優(yōu)于普通支架和全身注射NGF（每日肌肉注射）的支架，其效果與自體移植相當(dāng)［25］?？v向定向膠原 導(dǎo) 管（longitudinally oriented collagen conduit，LOCC）聯(lián)合NGF同樣可為坐骨神經(jīng)再生提供良好的環(huán)境。LOCC/NGF 導(dǎo)管用于成年犬坐骨神經(jīng)長距離缺損（35 mm）修復(fù)，能顯著促進(jìn)受損坐骨神經(jīng)橫斷部位神經(jīng)再生，其支配的腓腸肌質(zhì)量明顯大于單獨(dú)LOCC 組［26］。除了負(fù)載NGF 外，還可以負(fù)載腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制劑。離體釋放曲線證實(shí)TNF-α 抑制劑可以在CS 神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)持續(xù)釋放14 d。其釋放液對原代培養(yǎng)的施萬細(xì)胞具有抗凋亡作用。術(shù)后4 周，負(fù)載TNF-α 抑制劑的CS 神經(jīng)導(dǎo)管明顯促進(jìn)髓鞘形成，軸突生長。術(shù)后12周，負(fù)載TNF-α抑制劑的CS神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)了受損大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)及運(yùn)動功能的恢復(fù)。其恢復(fù)效果接近自體移植組，優(yōu)于單獨(dú)CS-基質(zhì)支架組的療效［27］。

由可生物降解的幾丁質(zhì)支架和自體小神經(jīng)（small autogenous nerves，SAN）組成新的神經(jīng)移植物促進(jìn)了大鼠坐骨神經(jīng)和髓鞘的再生，減少了靶向肌肉的萎縮，有效地恢復(fù)了神經(jīng)功能［28］。將幾丁質(zhì)生物導(dǎo)管負(fù)載SAN 和富含血小板的血漿（platelet-rich plasma，PRP）制成神經(jīng)移植物用于修復(fù)大鼠10 mm 坐骨神經(jīng)缺損。移植12 周后，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、復(fù)合動作電位強(qiáng)度、有髓神經(jīng)纖維密度、髓鞘厚度都顯著增加。幾丁質(zhì)生物導(dǎo)管負(fù)載SAN 和PRP 組運(yùn)動終板分布的感覺和運(yùn)動神經(jīng)元密度比幾丁質(zhì)導(dǎo)管負(fù)載其中一種（PRP 或SAN）的密度要高，提示幾丁質(zhì)導(dǎo)管同時負(fù)載SAN 和PRP 有更好的修復(fù)效果［29］。采用幾丁質(zhì)導(dǎo)管和脫細(xì)胞馬尾組成脫細(xì)胞同種異體馬尾（acellular cauda equina allograft，ACEA）也有很好的修復(fù)作用。與坐骨神經(jīng)相比，馬尾能更有效地脫細(xì)胞，含有更多的神經(jīng)基膜。ACEA比脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)異體移 植 物（acellular sciatic nerve allograft，ASNA）能更好地引導(dǎo)培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)中施萬細(xì)胞軸突再生和遷移。在體內(nèi)用ACEA 連接大鼠坐骨神經(jīng)15 mm 長的缺損，移植3 周后，ACEA 組再生的神經(jīng)纖維絲與自體移植組沒有顯著差異，移植12 周后，通過步態(tài)分析、神經(jīng)電生理和組織學(xué)分析結(jié)果表明，ACEA組坐骨神經(jīng)修復(fù)效果與自體移植組沒有顯著差異，優(yōu)于幾丁質(zhì)導(dǎo)管組和ASNA組，表明ACEA有潛力成為一種新的生物材料替代自體移植用于治療長距離神經(jīng)缺損［30］。利用分化的CTX0E03 人類干細(xì)胞制造的工程神經(jīng)組織（engineered neural tissue，EngNT）也可以成為同種異體移植物。含膠原膜的EngNT-CTX 用于連接無胸腺裸鼠坐骨神經(jīng)間隙損傷。無論移植后8周還是16 周，EngNT-CTX 組神經(jīng)傳導(dǎo)速度、對下游肌肉的支配與自體移植組無顯著差異。移植后8 周，EngNT-CTX 組感覺神經(jīng)元多于自體移植組，移植后16周，兩組的總神經(jīng)元沒有顯著差異［31］。

4 生物電刺激促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)

電針刺激（electrical stimulation，ES）是促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)的輔助治療方法［13］。用電針連續(xù)4 周每天刺激環(huán)跳穴（GB 30）和足三里穴（ST 36）20 min顯著促進(jìn)損傷坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)。電針處理通過下調(diào)PNⅠ后的miR-1b 表達(dá)，增加損傷的大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比（nerve conduction velocity，NCⅤ）、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic nerve function index，SFⅠ）、施萬細(xì)胞增殖及BDNF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)［32］。

電針刺激與新型材料聯(lián)用可以促進(jìn)PNⅠ恢復(fù)，將羥乙基纖維素（hydroxyethyl cellulose，HEC）/大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPⅠ）/聚苯胺海綿（polyaniline sponge，HSPs）制成神經(jīng)傳導(dǎo)導(dǎo)管，結(jié)果表明，ES 與導(dǎo)管聯(lián)用可有效促進(jìn)受損神經(jīng)運(yùn)動功能、電生理及形態(tài)學(xué)的恢復(fù)。由此可見，將ES 和導(dǎo)管結(jié)合起來是一種有效的周圍神經(jīng)修復(fù)策略［13］。

Fig.1 The underlying methods used for regeneration and repair of damaged peripheral nerves圖1 周圍神經(jīng)損傷后再生與修復(fù)的潛在方法

除了電針以外，還可以構(gòu)建導(dǎo)電神經(jīng)導(dǎo)管用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷，采用海藻酸鈉/Ca2+、聚丙烯酰胺和聚吡咯制備剛度和彈性可調(diào)導(dǎo)電水凝膠神經(jīng)導(dǎo)管，負(fù)載并可控釋放NGF-7S，可促進(jìn)神經(jīng)元的分化。與脈沖磁場聯(lián)合作用可更快促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)再生，促進(jìn)缺損的神經(jīng)功能恢復(fù)。這個研究揭示了電磁感應(yīng)在神經(jīng)修復(fù)中的作用，生物電與NT聯(lián)合有利于治療周圍神經(jīng)損傷［33］。通過還原氧化石墨烯納米片和甲基丙烯酸凝膠包裹BDNF構(gòu)建了一種用于神經(jīng)修復(fù)的導(dǎo)電拓?fù)渲Ъ?。該?dǎo)電支架比較容易通過卷曲獲得神經(jīng)導(dǎo)管。在大鼠10 mm 坐骨神經(jīng)缺損模型中，同樣能有效促進(jìn)神經(jīng)和肌肉的再生以及運(yùn)動功能的恢復(fù)［34］。

5 展 望

干細(xì)胞移植對周圍神經(jīng)再生提供了一種替代療法。NT、新型生物材料、電針刺激為損傷神經(jīng)的再生創(chuàng)造了良好的修復(fù)環(huán)境。NT 有利于神經(jīng)元分化、促進(jìn)其突起生長和突觸連接。新型生物材料可以起到很好的支撐、引導(dǎo)作用。電針刺激可發(fā)揮其抗調(diào)亡、促增殖的作用。當(dāng)神經(jīng)缺損較嚴(yán)重時，幾種方法的聯(lián)合應(yīng)用，有利于神經(jīng)損傷的修復(fù)，負(fù)載NT、TNF-α抑制劑等的TENG對PNⅠ的修復(fù)作用優(yōu)于單獨(dú)基質(zhì)支架的效果［25-27］。3D 打印神經(jīng)支架提供了從天然、生物和合成生物相容性材料中快速制造復(fù)雜周圍神經(jīng)導(dǎo)管的技術(shù)，可以設(shè)計(jì)和制造具有高度空間控制的個性化神經(jīng)導(dǎo)管［35］。運(yùn)用3D打印技術(shù)制備的納米顆粒增強(qiáng)型神經(jīng)導(dǎo)管可以促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，其功效與自體移植相當(dāng)，提示了潛在的臨床應(yīng)用［36］。這項(xiàng)技術(shù)也可以很好地解決因PNⅠ而導(dǎo)致的運(yùn)動喪失和肌肉不平衡問題。其可以為患者打印三維矯形器，來達(dá)到功能增益或防止功能下降的作用，得到了患者的肯定［37］。說明了這一技術(shù)在臨床中具有重大的應(yīng)用價值。

神經(jīng)導(dǎo)管技術(shù)在周圍神經(jīng)再生領(lǐng)域具有巨大的潛力，在臨床上能促進(jìn)功能恢復(fù)是理想的神經(jīng)導(dǎo)管裝置目標(biāo)。盡管生物材料和3D 打印技術(shù)能有效地支持神經(jīng)再生并經(jīng)常被成功地使用，但是如何使治療效果最優(yōu)，例如神經(jīng)管道的滲透性、孔隙率、降解率和最適管壁厚度等，都是有待進(jìn)一步研究的問題。在文獻(xiàn)中，大部分的臨床前研究更多關(guān)注的是導(dǎo)管內(nèi)的神經(jīng)再生和植入部位的生物材料局部效應(yīng)，而缺乏對可能系統(tǒng)性后果的研究。因此，需要更好的臨床前模型和優(yōu)化設(shè)計(jì)來支撐臨床中的治療。理想的神經(jīng)組織工程目標(biāo)是將個性化的神經(jīng)支架用于臨床：首先獲取患者神經(jīng)缺損部位的掃描圖像，然后構(gòu)建個性化的神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)，進(jìn)而負(fù)載理想的種子細(xì)胞和生物材料構(gòu)建神經(jīng)支架，最終移植到病人體內(nèi)修復(fù)神經(jīng)缺損。