張振宇 公維麗 馬耀宏 朱思榮 王丙蓮 韓慶曄 陳彥儒

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，濟南 250103）

碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy，http://www.cazy.org/）概括了能夠合成或者分解復(fù)雜碳水化合物和糖復(fù)合物的酶類，即糖苷水解酶（GH）、多糖裂解酶（PL）、碳水化合物酯酶（CE）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）及非催化活性碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）［1］?；诎被嵝蛄邢嗨菩裕珻AZy酶類被歸入不同蛋白質(zhì)家族。近年來，隨著研究的深入，研究者認為植物細胞壁多糖（如甲殼素、纖維素或淀粉）的高效降解不僅需要經(jīng)典糖苷水解酶的水解作用，而且離不開部分氧化裂解酶的協(xié)同催化。

目前，在CAZy數(shù)據(jù)庫中氧化裂解酶被獨立劃分為“輔助活性”（auxiliary activities，AA）酶家族，其中AA3 家族的酶具有大量不同類型的輔助活性，在醫(yī)療、環(huán)境、食品等多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用?；谇叭搜芯?，本文對AA3 家族酶的來源、分子結(jié)構(gòu)及改造，及其部分酶在電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用等進行了系統(tǒng)的歸納、總結(jié)，以期為AA3家族酶的后續(xù)研究和應(yīng)用提供參考。

1 CAZy-AA3家族酶特征及分類

AA3 家族酶屬于葡萄糖-甲醇-膽堿（glucosemethanol-choline，GMC）氧化還原酶大家族，基于對114個已被表征的AA3家族酶序列系統(tǒng)發(fā)育分析，AA3家族被進一步細分為4個亞家族：AA3_1（包括纖維二糖脫氫酶）、AA3_2（芳醇氧化還原酶和葡萄糖1-氧化還原酶）、AA3_3（醇氧化酶）和AA3_4（吡喃糖氧化酶）（圖1）。

這類酶的典型特征是具有一個黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域［2］。部分家族成員可能包含結(jié)構(gòu)上不同的環(huán)甚至額外的域（圖2）。FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域高度保守，顯示典型的Rossmann折疊或β折疊或sm單核苷酸結(jié)合基序，與FAD 的ADP 部分相互作用。但是底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列和結(jié)構(gòu)保守性較低，這反映了該家族作用底物的多樣性。盡管這類酶的作用底物多樣，但它們整體反應(yīng)機制相似。底物氧化涉及從底物直接轉(zhuǎn)移氫負離子到FAD 異丙嗪部分的N5原子，形成FADH2（還原半反應(yīng)）。FADH2隨后被O2或其他電子受體重新氧化（氧化半反應(yīng)），產(chǎn)生H2O2或還原態(tài)金屬離子（圖2）。下面對每一亞家族進行了詳細綜述。

Fig.1 CAZy-AA3 family enzyme phylogenetic tree圖1 CAZy-AA3家族酶系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2 The structure and reaction mechanism diagram of the four subfamily enzymes of AA3圖2 AA3 4個亞家族酶的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)機理圖

1.1 AA3_1-纖維二糖脫氫酶

1.1.1 CDH來源及分類

纖維二糖脫氫酶（CDH，EC 1.1.99.18），是由一些降解木質(zhì)纖維素的絲狀真菌分泌的胞外酶，也是迄今為止唯一已知的胞外血黃素蛋白［3］。CDH最早是在1974 年由Westermark 和Eriksson 從軟腐菌（Sporitrichum thermophile） 殘體中提取得到的［4］。目前，隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，CDH基因出現(xiàn)在許多真菌中?？僧a(chǎn)生CDH 的擔子菌及子囊菌列于表1。

目前已知的CDH 基因，根據(jù)酶分子結(jié)構(gòu)特征和催化特性系統(tǒng)發(fā)育分析可分為4大類（表1），第Ⅰ類CDH 序列只在擔子菌亞門中發(fā)現(xiàn)，而第ⅠⅠ類、第Ⅲ類和第Ⅳ類CDH序列只在子囊菌亞門中發(fā)現(xiàn)。第Ⅰ類CDHs對纖維素有很強的親和力，可通過脫氫酶結(jié)構(gòu)域表面的纖維素結(jié)合位點結(jié)合。這種纖維素結(jié)合位點在其他CDH 類中不存在。在第Ⅱ類CDHs 中，與纖維素的結(jié)合取決于序列C 端是否具有CBM，根據(jù)CBM 的有無，Ⅱ類CDHs 又被分為A、B 亞類。第Ⅰ類和第Ⅱ類CDHs 的主要差異在于它們的底物特異性和直接電子轉(zhuǎn)移的最適pH，而第Ⅲ類和第Ⅳ類CDHs，目前尚未得到表達和性質(zhì)測定。

Table 1 CDH classification，source and characteristics表1 CDH分類、來源及特征

1.1.2 CDH分子結(jié)構(gòu)及功能

CDH 是一種單體糖蛋白，其分子質(zhì)量大約為100 ku，糖基化程度可達20%。CDH有兩個輔基基團：細胞色素b型血紅素基團和FAD基團，兩個輔基基團分別存在于N 端細胞色素結(jié)構(gòu)域（CYTCDH）和C 端脫氫酶（DHCDH）結(jié)構(gòu)域中，其中DHCDH結(jié)構(gòu)域的糖基化程度遠高于CYTCDH結(jié)構(gòu)域，兩個基團由大約20～35 個氨基酸構(gòu)成的柔性連接肽相連，因此CDH結(jié)構(gòu)域具有顯著的流動性，并導(dǎo)致CDH的結(jié)構(gòu)具有開放和封閉兩種構(gòu)象［5］。

CDHs 氧化纖維二糖、纖維糊精或乳糖的C-1位還原端，生成相應(yīng)的內(nèi)酯［6］。Zamocky 等［3］發(fā)現(xiàn)其他半纖維素和淀粉衍生的低聚糖，如木聚糖、甘露糖或麥芽寡糖等也可被一些CDHs氧化，但催化效率較低。CDHs氧化糖的動力學(xué)常數(shù)表明，其優(yōu)先選擇二糖或者是稍大的低聚糖。CDH 氧化葡萄糖的Kcat值是其氧化纖維二糖的1/10，氧化葡萄糖的KM值是氧化纖維二糖的10 000 倍。對糖鏈長的選擇特異性也是CDH 的一種功能特點，比如纖維三糖和纖維四糖比纖維二糖多了葡糖殘基，CDH 對它們氧化的Kcat值與纖維二糖相比變化不大，但是KM值明顯比纖維二糖的大，這種特異性可能是由糖苷鍵的立體結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。

CDHs 結(jié)合纖維二糖等底物的位點位于DHCDH結(jié)構(gòu)域中，靠近FAD 的異丙嗪部分，可通過12 ?長的分子隧道到達［7］。Tan 等［5］在2005 年發(fā)現(xiàn)，在CDH 呈現(xiàn)封閉式構(gòu)象時這一結(jié)合位點仍可結(jié)合底物。作為還原性半反應(yīng)的結(jié)果，DHCDH結(jié)構(gòu)域中的兩個電子隨后可以轉(zhuǎn)移到可同時接受兩個電子的受體（例如，通常用于活性測定的2,6-二氯吲哚酚（DCⅠP））或一次僅接受一個電子的受體（例如，CYTCDH中的血紅素b 基團）［8］。在上述電子傳遞鏈下游，還原態(tài)血紅素b 可以依次還原終端電子受體，例如銅依賴性裂解多糖單加氧酶LPMOs［9-10］，與LPMOs 協(xié)同催化結(jié)晶纖維素、半纖維素和淀粉中的糖苷鍵斷裂［11-13］。CDH-LPMO 系統(tǒng)通過先前未知的機理提高纖維素結(jié)晶區(qū)的降解效率［14-15］。

1.2 AA3_2-亞家族酶

1.2.1 AA3_2-芳醇氧化酶/脫氫酶

1988 年Bourbonnais 和Paice［16］首次從不同側(cè)耳屬植物中分離到了芳香醇氧化酶（AAO；EC 1.1.3.7），AAO 是由許多木材降解真菌分泌的一種單體雙結(jié)構(gòu)域酶，含有非共價連接的FAD。通常催化一系列芳香族和脂肪族的不飽和醇，將伯醇基團氧化為相應(yīng)的醛。

Pleurotus eryngii來 源 的PeAAO （2.55 ?，PDB 3FⅠM）是迄今為止研究最全面的AAO 酶，PeAAO 具有高催化效率，與茴香醇的反應(yīng)速度可達5.23×106mol-1·L·s-1［17］。最近對朱砂綠膿桿菌（Pycnoporus cinnabarinus）組學(xué)研究顯示，在降解生物質(zhì)過程中它可分泌4種AA3_2酶，其中一種是葡萄糖脫氫酶，另外3 種與PeAAO 序列同源性高達44.5%～48.7%［18-19］。它們在氧化一系列芳香醇的還原半反應(yīng)中表現(xiàn)出與其他AAO 類似的活性，例如， 催 化p-茴 香 醇 的 效 率 為 0.631×103～16.9×103mol-1·L·s-1，p-茴香醇也是這3種酶的最適底物。然而，它們對一些電子受體的反應(yīng)性方面存在顯著差異。其中一種酶對氧氣沒有任何活性，另外兩種酶的氧反應(yīng)活性與其他電子受體，如p-對苯醌或DCⅠP，相比也較低，脫氫酶與氧化酶活性約為50∶1［20］。因此，這些酶不是真正的氧化酶，而是脫氫酶，它們被稱為芳基醇醌氧化還原酶（AAQO）。AAO和AAQO不僅參與木質(zhì)素的降解，還減少了漆酶在木質(zhì)素降解過程中形成的苯氧基自由基。

1.2.2 AA3_2-葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶

在AA3_2 中發(fā)現(xiàn)兩種不同的FAD 依賴性酶，葡萄糖1-氧化酶（GOD） 和葡萄糖1-脫氫酶（GDH），兩者在系統(tǒng)發(fā)育上親緣關(guān)系較為接近。但在催化底物的方式上有所不同，GOD 以O(shè)2作為最終電子受體氧化β-D-葡萄糖為D-葡糖內(nèi)酯（D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯），并將O2還原為H2O2，而FAD-GDH對O2的活性很低，但可利用一系列電子媒介體作為電子受體。

a.GOD來源及結(jié)構(gòu)特征

GOD最早是由Muller［21］從黑曲霉和灰綠青霉的無細胞提取液中分離出來的，并將其命名為葡萄糖氧化酶（β-D-葡萄糖：氧1-氧化還原酶，EC 1.1.3.4）。GOD 是同二聚體糖蛋白，相對分子質(zhì)量在147～180 ku 之間，這取決于其糖基化程度。每個單體在距酶表面～15 ?處深埋FAD或FADH2輔因子。FAD 與GOD 以非共價鍵進行牢固緊密結(jié)合。兩個亞基之間由疏水作用力、鹽橋和氫鍵進行連接。底物進入活性中心的口袋孔徑約為10 ?×10 ?，足夠容納葡萄糖。GOD 整個酶分子大小約為60 ?×52 ?×77 ?，等電點在4.3左右［22］。

真菌表達的GOD，在催化葡萄糖的過程中，葡萄糖與周圍氨基酸形成12 個氫鍵，與鄰近FAD的芳香族殘基形成3個疏水鍵，從而穩(wěn)定結(jié)合葡萄糖。在FAD 結(jié)構(gòu)末端將氧化葡萄糖產(chǎn)生的電子傳遞給氧，最終生成H2O2。由于H2O2能氧化GOD關(guān)鍵的蛋氨酸殘基而使酶失活，因此GOD 主要的抑制劑也是H2O2［23］。同時，伴隨著D-葡萄糖內(nèi)酯分解成葡萄糖酸導(dǎo)致外界pH 的降低，也抑制了酶的活性［24］。GOD的最大優(yōu)勢和特征是它對β-葡萄糖的高特異性。雖然GOD也可以氧化其他種類的糖，如半乳糖、甘露糖等，但反應(yīng)速度較慢［25］。

GOD的來源廣泛，目前已知的主要包括紅藻、柑橘類水果、細菌、昆蟲、植物、動物和真菌等（表2）。其中細菌和真菌具有產(chǎn)酶量高和使用各種碳源的能力，通常被認為是工業(yè)化生產(chǎn)GOD 的首選。但在細菌，如大腸桿菌中進行表達生產(chǎn)，常常形成無活性GOD 的包涵體，并且在體外以較低的產(chǎn)率溶解，即使經(jīng)復(fù)性后與天然酶性質(zhì)相似，但有活性的非糖基化酶依舊無法滿足高效表達的目的。由真菌自然產(chǎn)生的GOD 會產(chǎn)生一種糖基化程度超過10%的胞外酶。在釀酒酵母（Saccharomyces cereνisiae）和多形性漢遜酵母（Hansenula polya）中重組表達GOD 往往會導(dǎo)致高糖基化，并伴隨酶活性的降低［26］。目前常用甲醇營養(yǎng)酵母Pichia basoris進行目的蛋白的高效誘導(dǎo)表達，并被證明是表達GOD 的有效宿主，雖然它產(chǎn)生了大量中等程度的高糖基化酶，其性質(zhì)與天然酶略有不同，但仍然可以通過后期去糖基化等操作進一步提高GOD的活性。

b.FAD-GDH來源及結(jié)構(gòu)特征

FAD-GDH在系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)上與GOD有著密切的關(guān)系，因此顯示出與GOD 相同或相似的結(jié)構(gòu)域和保守的催化殘基。由于FAD-GDH 與GOD 共享大部分活性位點，因此對葡萄糖具有較高的底物特異性。

根據(jù)已報道的FAD-GDH 來源可分為3 大類：細菌中的bFAD-GDHs、真菌中的fFAD-GDHs和來自昆蟲的FAD-GDHs。FAD-GDHs最早的來源報告中稱：在曲霉亞種中存在一種能夠利用某些電子受體但不能利用氧氣氧化葡萄糖的酶［27-39］。通過對米曲霉來源的GDH進行表征，鑒定了它是FAD依賴型的GDH［30］。利用GOD 活性位點序列基序?qū)φ婢蚪M數(shù)據(jù)庫進行篩選，發(fā)現(xiàn)它們位于不同的系統(tǒng)發(fā)育分支。通過對GOD 活性位點與fFADGDH 活性位點結(jié)構(gòu)模型的比較表明，兩者與葡萄糖的5個羥基中每一個相互作用的相關(guān)殘基基本一致，從而阻止葡萄糖的同分異構(gòu)體在活性位點結(jié)合［31］。與GOD 對葡萄糖高底物專一性不同的是，fFAD-GDH 對D-木糖（XYL）也顯示出顯著的活性。通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，fFAD-GDH對葡萄糖識別位點高度保守，fFAD-GDH識別葡萄糖的殘基與GOD 識別葡萄糖的殘基之間沒有顯著差異。通過對甲殼類的fFAD-GDHs研究報道發(fā)現(xiàn)［32］，其催化結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了一個獨特的空腔，該空腔可能是fFAD-GDH與GOD底物特異性差異的關(guān)鍵。然而，fFAD-GDH 缺乏D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯（D-glucono-1,5-lactone，LGC）/葡萄糖第六羥基附近的殘基。由于沒有識別葡萄糖第六羥基的殘基，并且在活性部位存在一個顯著的空腔，這可能是其對木糖具有活性的原因。

bFAD-GDH 通過電子轉(zhuǎn)移亞基促進了催化亞基輔因子和人工電子介體之間的電子轉(zhuǎn)移，使該酶具有與PQQ-GDH 相似甚至更高的催化活性。其FAD 的主要電子受體為3Fe-4S 簇，這一部分參與電子從FAD 到電子轉(zhuǎn)移亞基的分子內(nèi)和分子間轉(zhuǎn)移過程。與fFAD-GDH 結(jié)構(gòu)類似，bFAD-GDH 活性位點有一個很大的空腔支持其識別麥芽糖作為底物［35］。因此，bFAD-GDH 具有相對廣泛的底物特異性，可以催化麥芽糖等雙糖，生成相應(yīng)的內(nèi)酯。對催化亞基活性位點的蛋白質(zhì)工程研究已經(jīng)成功地特異性消除了酶對雙糖的活性，從而使其本質(zhì)上成為對葡萄糖專一的酶。

Table 2 Main sources and characteristics of GOD and GDH表2 GOD及GDH主要來源及特征

1.3 AA3_3-醇氧化酶

醇氧化酶（AOX）最早是由Jassen 等［36］于1965年在擔子菌Spongipellis unicolor子實體培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)。它是第一種被發(fā)現(xiàn)的與甲醇酵母甲醇氧化途徑相關(guān)的酶類，它們以氧分子作為電子受體，把小分子、低質(zhì)量的醇類，如甲醇、乙醇、丙醇等短鏈醇，氧化成相應(yīng)醛類。

AOX 是甲醇營養(yǎng)型酵母（畢赤酵母、假絲酵母、漢遜酵母）的關(guān)鍵酶，它位于這些酵母的過氧化物酶體中，可占這些生物體細胞總蛋白質(zhì)的30%［37］。2016 年，來 自Pichia pastoris的AOX（PpAOX）的結(jié)構(gòu)已通過晶體學(xué)和X射線衍射以及冷凍電子顯微鏡解析出［38-39］。PpAOX 是一種同八聚體蛋白，每個亞基攜帶一個非共價連接的FAD，該FAD 的異咯嗪部分可以通過自催化反應(yīng)修飾阿拉伯?；?，這與通常的核糖醇基修飾是完全不同的。研究者認為，這種FAD 修飾主要通過降低與甲醇的KM值來提高對醇類底物的催化活性，并且FAD的修飾程度與菌體生長環(huán)境中甲醇濃度（5%～95%）呈負相關(guān)。

與酵母中的AOX 相比，來自擔子菌或植物病原真菌中的AOX 研究較少。 從褐腐真菌Gleophyllum trabeum（GtAOx）的培養(yǎng)物中分離出的胞外AOX與其他酵母和真菌來源的AOX（包括PpAOX）顯示出50%～53%的序列同源性［40］。其C端與酵母AOX 明顯不同，也不含典型的N 端真菌信號序列，但免疫熒光和TEM免疫標記研究表明，GtAOX 是胞外定位的。甲醇是GtAOX 的首選底物，其 催 化 效 率 約 為6.78×103mol-1·L·s-1，與PpAOX相似。由于不同來源AOX結(jié)構(gòu)的差距，導(dǎo)致其在功能上表現(xiàn)出不同的作用。來自酵母菌的AOX 主要在甲醇代謝和同化中起作用，而來自于其他真菌中的AOX，則被認為是為真菌攻擊木質(zhì)纖維素提供H2O2。

1.4 AA3_4-吡喃糖氧化酶

吡喃糖氧化酶（POX，EC 1.1.3.10）是與AA3家族成員親緣關(guān)系最遠的一類，不具有AA3 家族典型的高度保守基序，因此被歸入GMC 家族最晚［41］。POX 在白腐真菌中廣泛存在，特別是多孔菌目［42］。該酶最初從擔子菌中分離和表征，后來又在許多其他木腐真菌、 部分放線菌（Arthrobacter siccitolerans）中分離出來。晶體結(jié)構(gòu)表明，POX 是AA3 家族中結(jié)構(gòu)特征最多樣化的一類，與AA3 家族其他成員不同，大部分POX 是同四聚體蛋白，有些POX 是被糖基化的（圖1）［43］。每個雙結(jié)構(gòu)域亞基都包含一個與亞基的His殘基共價連接的FAD 輔酶活性位點。底物進入FAD 活性位點受到高流動性無規(guī)則卷曲形成的環(huán)形區(qū)的限制，從而限制了酶僅對單糖的催化。此外，底物只有通過由4個亞基形成的內(nèi)部空腔隧道才能進入催化活性位點，每個亞基都帶有一個功能未知的延伸“頭部結(jié)構(gòu)域”。其功能可能參與亞基聚合或與細胞壁多糖或其他蛋白質(zhì)的相互作用［44］。

POX 首選底物為D-葡萄糖，但與GOD 相比（GOD 的活性僅限于α-D-葡萄糖），POX 既可以利用α-D-葡萄糖，又可利用β-D-葡萄糖。除了其最適底物D-葡萄糖以外，D-半乳糖、D-木糖、L-山梨糖、D-葡糖酸-1,5-內(nèi)酯等單糖的C-2位也能被其氧化，生成相應(yīng)的2-酮糖，同時將O2還原成對POX 的研究表明，它是以乒乓機制催化反應(yīng)，整個反應(yīng)分為還原性半反應(yīng)和氧化性半反應(yīng)兩部分。在還原性半反應(yīng)中，β-D-葡萄糖C-2位被氧化，生成2-酮-D-葡萄糖，F(xiàn)AD 輔基被還原為FADH2，底物酮糖被釋放。在氧化性半反應(yīng)中，O2被還原為H2O2，同時黃素輔基回到氧化態(tài)。與GOD 相比，在木質(zhì)素降解過程中，POX 才是H2O2的主要來源，目前認為，POX 主要是作為白腐真菌木質(zhì)素降解體系的一個組分，為過氧化物酶提供H2O2。

A組:靜脈注射5000U肝素,瑞替普酶100 mg在90 min內(nèi)靜脈給予:先靜脈注入15 mg,繼而30 min內(nèi)靜脈滴注50 mg,其后60 min內(nèi)再滴注35 mg。之后靜脈持續(xù)每小時滴注700~1000U肝素,滴注時間48h;之后改為每12h皮下注射7500U肝素;連用2~5 d。B組:將150萬U尿激酶溶解于5%,100ml葡萄糖中靜脈滴注,滴注時間為30min;對患者ACT進行檢查,恢復(fù)至正常對照的1.5~2倍后,靜脈持續(xù)滴注肝素48h,之后改為每12h皮下注射7500U肝素;連用2~5 d。

2 CAZy-AA3家族酶在傳感器中應(yīng)用

氧化還原酶在催化底物的反應(yīng)中涉及電子轉(zhuǎn)移，因此可以將其固定到傳感器電極表面把化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電信號，實現(xiàn)對底物的快速檢測。隨著新鑒定以及分子改造的氧化還原酶作為底物識別元件，結(jié)合新的高效酶固定化納米導(dǎo)電材料的發(fā)展，氧化還原酶與電極之間電子傳遞效率不斷提高，傳感器的檢測限逐漸降低至fmol/L 濃度，靈敏度、特異性和穩(wěn)定性也大大提高。根據(jù)氧化還原酶與電極之間電子傳遞方式的不同，酶生物傳感器的發(fā)展主要劃分為3個階段。

第一代酶傳感器稱為無介質(zhì)安培型生物傳感器，它以自然物質(zhì)如氧氣作為酶與電極之間的電子通道，通過氧電極或過氧化氫電極測量氧的消耗或過氧化氫的產(chǎn)生來測定底物。這種傳感器的優(yōu)點是制作簡單、無人工介體。但由于是間接測定，檢測時受溶解氧波動的影響較大，響應(yīng)時間較長，易受試樣中共存的氧化還原性電活性物質(zhì)干擾，導(dǎo)致傳感器的靈敏度和抗干擾能力相對較差。為克服以上問題，自20世紀70年代起，人們開始用小分子電子媒介體代替氧，通過檢測媒介體電流來測定底物濃度。因此，第二代酶傳感器又被稱為介體安培型生物傳感器。與第一代相比其檢測靈敏度、實用性明顯提高。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，研究者將納米技術(shù)與生物傳感器結(jié)合，設(shè)計出了靈敏度更強、化學(xué)穩(wěn)定性更高、生物相容性更好的第三代酶生物傳感器-納米生物傳感器。由于第三代酶傳感器縮短了酶與電極之間的傳遞距離，使酶和電極之間實現(xiàn)直接電子傳遞（DET），因此，這類傳感器的電子轉(zhuǎn)移效率更高，受到的干擾更少，準確性更高，應(yīng)用前景更可觀。

而AA3 家族酶作為一類重要的氧化還原酶，由于其高效的表達量，高度穩(wěn)定的催化能力，多樣的作用底物，被廣泛的應(yīng)用于酶傳感器中，特別是對葡萄糖、乳糖、乙醇的檢測成為應(yīng)用熱點。

2.1 葡萄糖生物傳感器

葡萄糖的定量測定在食品工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)、生化分析等領(lǐng)域都具有重要意義。葡萄糖傳感器是生物傳感器領(lǐng)域中研究最多、商品化最早的生物傳感器。葡萄糖傳感器的發(fā)展歷史與葡萄糖傳感所用酶的發(fā)現(xiàn)和工程的歷史是密切相關(guān)的，因此，在數(shù)十年的發(fā)展中隨著葡萄糖傳感器檢測用酶的設(shè)計改造及固定化材料的改進，葡萄糖傳感器的檢測性能得到巨大提升。

GOD 是最早應(yīng)用于葡萄糖生物傳感器中的一類酶，自第一支葡萄糖氧化酶傳感器問世以來就被應(yīng)用于葡萄糖的檢測。然而，利用氧作為電子受體的第一代傳感器主要面臨著如下幾個問題：a.需氧的反應(yīng)條件造成酶電極電信號與溶解氧的關(guān)系很大，極易引起信號的波動，難以對高含量的葡萄糖進行測定；b.過高的檢測電位（氧電位）使其他電活性物質(zhì)容易產(chǎn)生信號干擾；c. 氧化還原產(chǎn)物H2O2濃度過高會使GOD 失去活性等。這些問題大多歸因于GOD 自身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)或者是反應(yīng)機理。通過對GOD蛋白結(jié)構(gòu)的解析，基于基因工程改造，改變活性中心的電子傳遞方向來改善GOD 對氧的依賴性及其反應(yīng)過程中電子轉(zhuǎn)移效率，實現(xiàn)對GOD 在電化學(xué)上的應(yīng)用進行重新設(shè)計，成為發(fā)展第二代、第三代葡萄糖氧化酶傳感器的主要研究內(nèi)容（圖3）。Klinman 等［46］利用突變技術(shù)用氯化物取代天然黃素中7和8位甲基，對黑曲霉（A.niger）來源的GOD 進行了改造并對其在氧化過程中的O2效應(yīng)反應(yīng)進行了監(jiān)測（圖3 中a1），發(fā)現(xiàn)改造后GOD 的KM比天然的高25 倍。為了進一步降低GOD 對O2的競爭效應(yīng)，Tremey 等［47］使用了這種黃素類似物制作了GOD 生物電極，并通過將新的類似物嵌入到鋨導(dǎo)電聚合物中制備修飾電極，結(jié)果表明，改造后的GOD 對O2的靈敏度降低了90%，當葡萄糖濃度＜10 mmol/L時，在幾乎不受O2濃度影響的情況下，F(xiàn)ADCL2-GOD 電極的電流密度比天然酶高，電子轉(zhuǎn)移率提高了1.3 倍，有效避免了GOD對氧氣的過度依賴。Sode等［48］在確定了參與氧化半反應(yīng)中與O2相互作用的關(guān)鍵氨基酸后，將參與氧化半反應(yīng)的Ser96 殘基進行突變，降低了GOD 對O2的敏感性。但這項工作中也指出，這種突變也將影響還原半反應(yīng)，并在一定程度上降低了GOD 的活性。Tremey 等［49］在分析了尼崎青霉菌的X 射線結(jié)構(gòu)后，從黃素中發(fā)現(xiàn)了類似的纈氨酸，它們?yōu)镺2激活提供了正電荷。在含鐵乙醇的均相溶液中進行篩選，得到了以極性絲氨酸S取代非極性氨基酸Ⅴ時降低O2敏感性的最佳突變體；動力學(xué)分析表明，與天然GOD 相比，該突變體只影響氧化半反應(yīng)，而未影響還原半反應(yīng)（圖3 中a2）。他們用新的突變體和鋨氧化還原水凝膠制備了修飾電極。在2 mmol/L葡萄糖和1 atm O2條件下，突變電極的電流密度比用天然酶制成的電極高27%。由于產(chǎn)生的H2O2數(shù)量有限，改性電極比天然GOD 電極穩(wěn)定4.7 倍。然而，25%的電子仍然丟失給了氧化還原介質(zhì)。為了進一步完善系統(tǒng)，他們將該突變與活性位點入口袋（藍色）附近的K424E 突變結(jié)合（圖3 中a2）。雙突變體K424E-Ⅴ464S 在整個葡萄糖濃度范圍內(nèi)不依賴于氧氣。該突變體結(jié)合增強了電子轉(zhuǎn)移，因為在活性位點口袋的入口處有帶負電荷的谷氨酸，而在FAD附近有一個極性絲氨酸，使O2的影響最小化［49］。由于天然GOD的活性中心深埋在蛋白質(zhì)外殼內(nèi)，通過對蛋白質(zhì)活性中心的表面入口處進行定點突變不僅能降低酶活性降低的風(fēng)險，還能改善對氧的極性作用，電子直接轉(zhuǎn)移到電極表面，降低對氧的結(jié)合。

制約第三代GOD 傳感器發(fā)展及應(yīng)用的另一個因素是如何縮減活性中心處產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移到電極界面的距離，提高GOD 和電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移率。研究表明，酶與電極之間的距離每減少0.8 ?，電子轉(zhuǎn)移速率將提高2.71 倍［50］。雖然在電極制作過程中對固定的蛋白質(zhì)進行去糖基化處理，也能有效縮減活性中心到電極界面的距離，增強電子轉(zhuǎn)移速率。但從酶分子表達的源頭縮短酶的氧化還原中心與電極表面的距離是提高電子轉(zhuǎn)移速率最直接、最簡單的辦法。據(jù)GOD蛋白結(jié)構(gòu)推測，從GOD的氧化還原位點到酶表面最短的電子轉(zhuǎn)移路徑存在于靠近C端的577位的天冬酰胺（Asn577）處，因此，Demin等［51］在GOD 的C 端添加了一個His6序列，并將表達的蛋白質(zhì)有效且定向固定在含次氮基三乙酸修飾的玻碳電極表面，使酶最大限度的保持最佳催化效率（圖3中b1）。在無氧條件下測量發(fā)現(xiàn)，電子轉(zhuǎn)移率高達350 s-1，比無酶的FAD快兩個數(shù)量級；在含O2干擾的條件下，電子轉(zhuǎn)移率降低至160 s-1，這可能仍與氧與活性中心的His相互作用有關(guān)。為了獲得更高的電子傳遞速率，進而引入了氧化還原介質(zhì)（金納米顆粒、鋨導(dǎo)電聚合物）。Xiao等［52］報道了重組FAD 功能化的黑曲霉GOD 在1.4 nm AuNP中的電極表面催化反應(yīng)，這是首次使每個GOD特異性固定一個AuNP的例子（圖3中b2）。該生物傳感器的電子轉(zhuǎn)移速率為5 000 s-1，是原生酶與O2反應(yīng)的7倍，也是迄今為止文獻報道的最高比率。Holland等［53］在此基礎(chǔ)上，使用了早期開發(fā)的催化性能優(yōu)于天然酶的雙突變體GOD（T56Ⅴ/T132S），將其活性位點附近一個游離的半胱氨酸（C521）突變?yōu)槔i氨酸，防止不必要的AuNPs 附著，并在活性中心約13.8 ? ～28.5 ? 處的5 個位置分別引入突變的Cys殘基。結(jié)果顯示，其中FAD與Cys 之間距離最短的突變體（H447C）具有最大DET 潛力（圖3 中b2）。Suraniti 等［54］使用鋨導(dǎo)電聚合物作為GOD 氧化還原介質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，在鋨基氧化還原聚合物中固定化的GOD比GOD在均相溶液中的動力學(xué)要差，其氧化電流降低了35%。他們將這種差異歸因于GOD 入口周圍缺乏帶負電荷的氨基酸。通過對入口處的K424、Q75、Q184 和G423 突變?yōu)镋 或D，發(fā)現(xiàn)所有突變體在均相溶液中都表現(xiàn)出相同的活性。但在氬氣（Ar）條件下，K424E 突變體電極的氧化電流比天然酶增加了2.4倍，在O2條件下增加了1.4倍。通過在活性位點入口附近引入負電荷，能增加正電荷鋨和酶之間的相互作用（圖3 中b3）。這些結(jié)果表明，通過重新設(shè)計酶的入口，可以使GOD 與氧化還原介體更好的進行相互作用，從而提高電子轉(zhuǎn)移的速度。

fFAD-GDH 由于對O2和麥芽糖不敏感，因此被認為是用于葡萄糖生物傳感器的最佳候選酶類。它作為第二代酶傳感器的主要傳感元件，電子介體的選擇尤為重要，氯化六氨合釕（Ⅲ）具有較低的氧化還原電位和較高的貯存穩(wěn)定性，是一種非常理想的酶介質(zhì)。然而，與GOD 相比，fFAD-GDH 不能利用六銨合釕（Ⅲ）作為電子受體［55］。Okurita等［56］在比較FAD-GDH和GOD結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個能夠利用六銨合釕（Ⅲ）作為電子受體的黃曲霉來源的突變體——AfGDH-H403D，在通向FAD 輔助因子的通路入口處引入一個帶負電荷的谷氨酸殘基，吸引帶正電的六氨合釕（Ⅲ），并引導(dǎo)電子受體進入通路（圖3中c1）。而野生型GOD中相應(yīng)的氨基酸是帶負電荷的，這解釋了GOD 可以利用六氨合釕（Ⅲ）作為電子受體的原因。電化學(xué)測量結(jié)果顯示，AfGDH-H403D和六氨合釕（Ⅲ）對10 mmol/L 葡萄糖的響應(yīng)電流為46.0 μA，與野生型AfGDH 和鐵氰化物（47.8 μA）的響應(yīng)電流類似。因此，AfGDH-H403D適合于以六氨合釕（Ⅲ）為介質(zhì)構(gòu)建的酶電極。利用這種改造的fFAD-GDH可加快血糖監(jiān)測傳感器的發(fā)展，提高監(jiān)測準確性。

發(fā)展第二代、第三代葡萄糖傳感器的另外研究內(nèi)容是通過對葡萄糖脫氫酶、纖維二糖脫氫酶等可以氧化葡萄糖的酶進行分子改造，實現(xiàn)葡萄糖的高效檢測［57-59］。構(gòu)建DET 型fFAD-GDHs 最先進和最具挑戰(zhàn)性的方法是構(gòu)建一種融合fFAD-GDH 和CYTCDH結(jié)構(gòu)域的融合蛋白（圖3 中c2）。Ⅰto 等［60］報道了利用PcCDH 和AfGDH 構(gòu)建細胞色素b 融合蛋白。PcCDH 是一種已知的具有DET 功能的單分子酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測，PcCDH 的血紅素b 結(jié)構(gòu)域在AfGDH 的N 端融合。由于PcCDH 的血紅素b 結(jié)構(gòu)域可能存在于AfGDH 的FAD 附近，因此，F(xiàn)AD和血紅素之間可以實現(xiàn)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，從而實現(xiàn)DET。實驗結(jié)果表明，細胞色素b融合的AfGDH表現(xiàn)出分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移和DET 能力，且保持原始底物特異性。pH 值的降低和二價陽離子的存在改善了分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，但遠不如CDH 自身的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移。此外，CDH可將細胞色素b作為“內(nèi)置”氧化還原介質(zhì)，在FAD 和外部電子受體之間傳遞電子，因此產(chǎn)生了利用CDH 來直接檢測葡萄糖的新想法（圖3 中d）。嗜熱型纖維二糖脫氫酶（CtCDH）在底物結(jié)合域通過半胱氨酸與酪氨酸交換，提高了對葡萄糖的催化能力，使葡萄糖檢測靈敏度提高了10倍［61］。

Fig.3 Glucose biosensor development map圖3 葡萄糖生物傳感器發(fā)展歷程圖

基于第一代酶傳感器原理，本實驗室自主研發(fā)的SBA 系列生物傳感分析儀于1989 年開始應(yīng)用，是目前中國唯一的商品化工業(yè)酶電極分析系統(tǒng)，在食品發(fā)酵、生物醫(yī)藥和科研教學(xué)等領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用［62］。為克服傳統(tǒng)酶分子傳感元件隨機固定導(dǎo)致酶傳感器穩(wěn)定性不高、均質(zhì)性差異大的問題，促進原有葡萄糖生物傳感器升級換代和新型傳感器研制，最近，本實驗室采用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等生物技術(shù)，定向設(shè)計和高效表達帶有CBM 親和肽的融合酶（GOD-NL-CBM2，GDH-NL-CBM2）分子，實現(xiàn)酶分子傳感元件在電極表面有利空間取向可控固定，使葡萄糖傳感器的傳感性能（靈敏度、檢測限、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性）顯著提高。在此基礎(chǔ)上，建立融合酶傳感元件標準化操作工藝和質(zhì)量控制體系，使傳感器件具有良好均質(zhì)性、高效和穩(wěn)定的酶化學(xué)和電化學(xué)（換能器）催化活性，可有望實現(xiàn)新型融合酶生物傳感器的商品化應(yīng)用［63-64］。

2.2 乳糖生物傳感器

乳糖是牛奶中的主要碳水化合物，濃度為4%～5%（w/ν），母乳中約為8%，在人類飲食中占有重要作用。然而許多人對乳糖具有不耐受癥，因此食品中乳糖含量的精準控制至關(guān)重要。在過去幾十年中，幾種用于乳糖測定的酶生物傳感器已經(jīng)得到了開發(fā)。其中，CDH 可以特異催化乳糖，并且可以將催化乳糖產(chǎn)生的電子直接轉(zhuǎn)移到電極上。因此，CDH成為開發(fā)第三代乳糖生物傳感器的重要酶類。

為了增強CDH 與電極間直接電子傳遞效率，促進第三代乳糖傳感器的發(fā)展，人們利用新的電極材料、納米材料（單/多壁碳納米管、金納米粒子、石墨烯）和化學(xué)修飾電極表面，以增加CDH 結(jié)合的有效表面積，或者通過控制CDH 在表面上的適當取向來增加電流密度、提高DET 速率。CDH 的糖基化程度約為9%～16%，與GOD 類似?；谇捌谘芯浚芯空邔碓从邳S孢原毛平革菌（Pc）和白腐菌（Cs）中的CDH，經(jīng)甘露糖苷酶和糖苷內(nèi)切酶處理后，獲得去糖基化酶［65］。在底物存在時，用去糖基化PcCDH和CsCDH修飾的石墨電極的最大電流比用相應(yīng)糖基化CDH 修飾的電極高40%～65%，并提高了酶對乳糖的專一性，這可能歸因于去糖基化促使電極表面電活性CDH 分子數(shù)量的增加，并使酶的尺寸縮小，從而促進直接電子傳遞（圖4 中a1，a2）。此外，電極和蛋白質(zhì)表面（負責DET的部分表面）之間的靜電兼容性對建立高效DET 通道起著關(guān)鍵作用，氧化還原酶/電極界面的極性極大地影響酶分子在電極上的吸附和取向，有時不促進DET 過程，甚至阻礙酶的吸附。針對這一問題，研究者已經(jīng)深入研究了酶-酶和酶-界面的相互作用，發(fā)現(xiàn)小的多價陽離子，例如，Mg2+或Ca2+，可以促進帶負電荷的蛋白質(zhì)和電極之間DET的能力［66-68］。這可以歸因于Ca2+在DHCDH和CYTCDH的界面上被天冬氨酸和谷氨酸的羧基絡(luò)合，從而導(dǎo)致兩個結(jié)構(gòu)域更緊密的相互作用和更高的DET速率（圖4中b1，b2）。

隨著基因工程的發(fā)展，優(yōu)化DET 速率或解決DET 問題最常用的方法之一是通過定點突變來定向固定氧化還原酶。例如，Ma 等［69-70］將單個Cys殘基引入到嗜熱肉豆蔻球菌纖維二糖脫氫酶（MtCDH）的DHCDH表面，不同變體的Cys 殘基能夠以不同的取向與多壁碳納米管電極表面的修飾馬來酰亞胺基團共價偶聯(lián)（圖4中c1～4）。DHCDH直接面對電極的取向是很困難的，因為CYT 也在底物通道上以閉合構(gòu)象與DH相互作用，接受催化FAD輔因子的電子。因此，研究者選擇了靠近蛋白質(zhì)界面但不干擾結(jié)構(gòu)域相互作用的殘基E501（圖4 中c1）；另外，底物通道右側(cè)引入一個突變E653C（圖4中c2）。逆定向是通過突變T680C DHCDH底部實現(xiàn)的，以獲得CYT 血紅素輔助因子與電極之間的最遠距離（圖4中c3）。CDH碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）上的突變D792C是CDH在纖維素上的自然取向，在電極上以頂部定向共價固定（圖4中c4）。研究表明，與非定向固定相比，這種固定方法使固定在電極上的電接觸（活性）酶量增加了4～5 倍。在30 mmol/L Ca2+存在下，DET 速率均有所增加，其中，E501C 和D792C 的電流分別增加了14.4倍和4.8倍；由于D792C中CYT距離電極表面最遠，因此電子傳遞速率最低。但血紅素b輔因子的氧化還原電位不受酶取向的影響。

2.3 乙醇生物傳感器

在醫(yī)療、化工、交通等多個領(lǐng)域都需要對乙醇進行高靈敏度、高選擇性和高準確度的定量檢測。目前，常用的檢測乙醇濃度的方法有氣相色譜法、分光光度法和呼氣法［71-72］等。雖然其中一些方法精確可靠，但它們復(fù)雜且耗時，利用酶傳感器法可以克服這些缺點。迄今為止，幾乎所有基于AOX的乙醇傳感器都是基于對O2消耗或H2O2生成進行監(jiān)測（表3）。

Clark 電極是最常見的O2監(jiān)測電極，它由一個鉑電極和一個參比電極（通常是Ag/AgCl）組成，該參比電極浸入電解液中，并被一個半透膜覆蓋，O2通過該半透膜擴散。當鉑電極上施加相對于Ag/AgCl 的-600 mⅤ電位時，O2減少，并產(chǎn)生與O2濃度成正比的電流。基于氧氣檢測的乙醇傳感器具有不受其他樣品化學(xué)成分干擾的優(yōu)點，但存在背景信號高、精密度低和重復(fù)性差等問題?；谝陨弦恍┤秉c，H2O2的檢測是克服這些缺點最常用的替代方法。

1974 年，Giubault 和Lubrano［73］描述了AOX基于H2O2檢測的第一個乙醇安培傳感器。該傳感器是由來自于擔子菌的可溶性AOX 構(gòu)成，基于在鉑電極上的酶促反應(yīng)過程，并且發(fā)生在相對于Ag/AgCl的+600 mⅤ的高電位上。在這項開創(chuàng)性工作之后，許多乙醇傳感器都是基于H2O2檢測，與其他類型的傳感器相比，H2O2傳感器具有較低的檢測線和較寬的線性范圍，制作方便等優(yōu)點。目前市場上乙醇傳感器多基于H2O2的檢測。

Table 3 Electrode performance based on O2 and H2O2 detection表3 基于O2和H2O2檢測的電極性能

2.4 AA3家族其他酶應(yīng)用前景

AAO 氧化催化系列芳香族和一些脂肪族的含共軛伯羥基的多不飽和醇。由于AAO 催化底物范圍廣和它的立體選擇性機制，使這類酶作為工業(yè)生物催化劑具有良好的性能，目前在染料脫色、紙漿漂白、香料合成、仲醇除乙?；涂啡┭趸⑸锞酆衔锴绑w合成等多個方面都有應(yīng)用，而作為生物傳感器敏感元件的研究尚未見報道［86］。目前AAO的使用能力主要受限于異源表達水平不高，為此多項研究集中于探索建立AAO 的異源表達體系（宿主菌、表達載體、信號肽類型、啟動子類型）或通過定點突變技術(shù)提高AAO 催化活性、穩(wěn)定性等性能［87-89］。隨著研究的深入，不同來源AAO 的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)正在逐步被揭示，這對理解AAO 的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系并促進其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

基于對吡喃糖的催化特異性，POX 已被應(yīng)用于葡萄糖、半乳糖、木糖等碳水化合物的傳感檢測。Lidén 等［90］首次將來自黃孢原毛平革菌的PcPOX 與HRP 共固定在碳糊電極（CPE）上，該雙酶傳感器可同時檢測H2O2和葡萄糖，對葡萄糖（840 nA，30.2 μA·cm-2·mmol-1·L）、木糖（80 nA）、半乳糖（36 nA）均有良好反應(yīng)。此后，基于POX的生物傳感器主要用于食品和飲料的分析和各種食品發(fā)酵過程的監(jiān)測。2008 年，Odaci 等［91］將來自于革蓋菌屬的CsPOX 固定在CPE 上，用于紅酒樣品中葡萄糖含量的檢測。然而，與標準DNS 法相比，由于酶的特異性低，它能夠有效地氧化除葡萄糖以外的幾種糖類，因此這可能會損害其在選擇性葡萄糖監(jiān)測中的使用，測得的葡萄糖含量值有些低（差別最大可達7%）。此外，研究人員還將CsPOX固定于金電極上制備生物傳感器并用于釀酒酵母在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)過程監(jiān)測，分析結(jié)果與以高效液相色譜法為參考的葡萄糖含量測定結(jié)果具有良好的相關(guān)性。但該生物傳感器的穩(wěn)定性不高，當存儲在緩沖溶液一個月后，活性損失至初始活性的72%［92］。隨后進一步的研究報告了構(gòu)建基于CsPOX 的生物傳感器，這些傳感器利用CsPOX 自身的優(yōu)勢，既可氧化α 型葡萄糖，又可氧化β型葡萄糖，通過在電極表面電沉積金屬納米粒子，用于分析幾種飲料中的葡萄糖，如軟飲料、冰茶、能量飲料、牛奶和果汁，所有這些傳感器與參考方法相比都取得了良好的結(jié)果［93］。

由于POX 廣泛的底物特異性，其應(yīng)用范圍正在逐步擴大，研究也逐漸向新型POX 的發(fā)現(xiàn)、理想型酶突變體的改造以及在電極上的有效固定化等方面深入。隨著人們對利用基于POX 的設(shè)備檢測各種生物分子的興趣不斷增長，以POX 作為生物敏感元件的傳感器有望為食品和飲料行業(yè)、疾病診斷、生物過程監(jiān)測和環(huán)境污染物篩選等領(lǐng)域創(chuàng)造巨大的應(yīng)用價值。

3 展 望

近幾十年來，CAZy-AA3家族酶作為生物電化學(xué)傳感器的識別元件一直發(fā)揮著重要作用。生物傳感器是化學(xué)、生物化學(xué)和物理學(xué)的交叉領(lǐng)域，酶作為傳感器的核心元件，其自身性能決定了生物傳感器的性能和應(yīng)用范圍。目前，具有高靈敏度和高選擇性的電化學(xué)生物傳感器在臨床、制藥、環(huán)境和工業(yè)等多個領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。但是天然酶本身具有不穩(wěn)定性和易變性等缺點，并且測定其性質(zhì)通常在均勻溶液中，底物、氧化還原介質(zhì)和酶都是游離的，沒有濃度分布差異且氧化還原介質(zhì)、底物將通過最佳接觸點接近酶。而當酶被固定在電極表面應(yīng)用時，酶的部分構(gòu)象會改變，并且可能會出現(xiàn)濃度梯度，從而改變其對底物和/或氧化還原介質(zhì)的反應(yīng)性、穩(wěn)定性、對其他化學(xué)物質(zhì)的耐受性等許多性質(zhì)。因此到目前為止，很難找到一種天然酶能滿足構(gòu)建理想生物傳感器所需的全部特性（高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性），也沒有建立一種通用的工程方法來有效固定氧化還原酶以改進其電化學(xué)應(yīng)用。

當前，蛋白質(zhì)工程已經(jīng)在設(shè)計具有特定功能特性的氧化還原酶方面發(fā)揮了重要作用。國內(nèi)外已有很多優(yōu)秀的專家學(xué)者針對傳感器用酶，進行特定的基因工程改造，利用蛋白質(zhì)工程學(xué)幫助研究人員按其需要量身定制特定的生物酶應(yīng)用到生物傳感器中，通過模仿自然進化過程，結(jié)合不同的誘變方法來產(chǎn)生酶變體，或利用突變特定的位點賦予酶特定屬性，以產(chǎn)生具有所需催化性能的酶變體［60，94-96］。部分研究結(jié)果顯示，通過系統(tǒng)篩選氨基酸的突變位置和類型會產(chǎn)生具有增強或特殊性質(zhì)的酶，例如，提高對特定分析物的親和力，增強穩(wěn)定性，提高電子轉(zhuǎn)移速率，以及提供定向或更穩(wěn)定的固定。但是有些情況為特定目的而專門設(shè)計的突變可能會在電化學(xué)生物傳感器應(yīng)用中產(chǎn)生另一種不利影響。解決這些問題的關(guān)鍵是結(jié)合蛋白質(zhì)工程和生物傳感器領(lǐng)域的科學(xué)知識指導(dǎo)酶分子傳感元件理性設(shè)計。隨著大數(shù)據(jù)時代對酶分子序列、結(jié)構(gòu)、功能的深入認識，可以借助計算模擬/分子對接等方式根據(jù)功能需求全面預(yù)測氨基酸大小、極性、電荷和氧化還原電位等性質(zhì)并結(jié)合蛋白質(zhì)工程技術(shù)、氧化還原介質(zhì)/聚合物合成和電化學(xué)方面的專業(yè)知識實現(xiàn)理性改造。目前，蛋白質(zhì)工程改造酶的生物傳感器研究仍處于起步階段，尤其是國內(nèi)大部分優(yōu)良商品化酶的來源依賴于國外進口，雖然有些研究采用了自制酶，但離實用性要求相差甚遠，因此更應(yīng)加大酶分子傳感器用酶的研究和開發(fā)力度，實現(xiàn)可適用的生物傳感設(shè)備產(chǎn)業(yè)化制造，促進中國從生物傳感器研究大國向生物傳感器制造強國的轉(zhuǎn)變。