趙 沙 顏?zhàn)泳?張 舒 余俊紅 吳秀蕓1，** 王祿山

（1）山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266237；2）青島啤酒股份有限公司啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266000）

幾丁質(zhì)是自然界廣泛存在的生物多糖之一，由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接聚合而成。幾丁質(zhì)作為結(jié)構(gòu)多糖，存在于許多生物細(xì)胞外基質(zhì)中，包括真菌細(xì)胞壁、昆蟲外骨骼、甲殼類外殼和線蟲卵殼等［1］。幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)與纖維素類似，由單一單體聚合形成線型鏈狀結(jié)構(gòu)，相鄰兩個(gè)單體反向呈180°排列（圖1a）。幾丁質(zhì)鏈通過(guò)分子內(nèi)和分子間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)形成高度結(jié)晶的幾丁質(zhì)，構(gòu)成抗降解屏障。根據(jù)幾丁質(zhì)鏈的方向差異可以分為α 型、β 型及γ 型幾丁質(zhì)［2］。不同于纖維素，幾丁質(zhì)的抗降解屏障不僅表現(xiàn)在高度結(jié)晶的整體結(jié)構(gòu)［3］，還表現(xiàn)在N-氨基乙?；潭龋╠egree of acetylation， DA） 和 糖 單 元 的 聚 合 程 度（degree of polymerization，DP）兩個(gè)方面［2］。幾丁質(zhì)是重要的生物質(zhì)資源，其降解產(chǎn)物GlcNAc和幾丁質(zhì)寡糖（chitin-oligosaccharide，CHOS）具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種特異性生物活性，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域［4-6］。

利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物主要有化學(xué)法和生物酶法兩種方法?；瘜W(xué)法需要使用高濃度的HCl或H2SO4，易造成危險(xiǎn)和環(huán)境污染，生物酶法具有綠色、快速的特點(diǎn)，可以形成環(huán)境友好和生物相容的產(chǎn)物［7］。幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）特異性水解幾丁質(zhì)糖苷鍵產(chǎn)生低聚寡糖。自然界中，幾丁質(zhì)酶廣泛分布在古菌、細(xì)菌、真菌、高等植物及動(dòng)物中［1］，其中，細(xì)菌幾丁質(zhì)酶由于產(chǎn)生的豐度和商業(yè)潛能一直是研究的熱點(diǎn)。細(xì)菌中幾丁質(zhì)降解酶基因存在明顯的基因擴(kuò)增及多結(jié)構(gòu)域組合現(xiàn)象，并且不同家族、不同作用模式的幾丁質(zhì)酶系可以協(xié)同參與幾丁質(zhì)的高效降解［8］，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)碳氮比的平衡起著至關(guān)重要的作用［9］。因此，充分認(rèn)識(shí)細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)功能、降解模式及分子設(shè)計(jì)策略，對(duì)于高效生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，推動(dòng)低品質(zhì)生物質(zhì)原料的綠色轉(zhuǎn)化技術(shù)的快速發(fā)展具有重要意義。

Fig.1 Structure of chitin and chitinase圖1 幾丁質(zhì)與幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)示意圖

1 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的分類與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)CAZy （http://www.cazy.org/）中，幾丁質(zhì)酶基于序列相似性主要被歸類為GH18和GH19家族。其中，GH18家族幾丁質(zhì)酶廣泛分布在古菌、細(xì)菌、真菌、高等植物及動(dòng)物中，而GH19 家族幾丁質(zhì)酶主要分布于植物中，細(xì)菌中分布較少，且細(xì)菌中的GH19家族幾丁質(zhì)酶由植物幾丁質(zhì)酶進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生［10］。截至2021年7月，GH18家族中被表征的細(xì)菌幾丁質(zhì)酶序列有192條，結(jié)晶結(jié)構(gòu)有22個(gè)，而GH19家族被表征的細(xì)菌幾丁質(zhì)酶有15條序列，其中2個(gè)獲得晶體并解析結(jié)構(gòu)，分別為來(lái)源于天藍(lán)鏈霉菌A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2））的Chi19G（PDB ⅠD 2CJL） 和 灰 色 鏈 霉 菌HUT 6037（Streptomyces griseus HUT 6037） 的ChiC （PDBⅠD 1WⅤU）。

幾丁質(zhì)酶一般由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括催化結(jié)構(gòu)域（CD）、碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）和/或Ⅲ型纖維連接蛋白（FnⅢ）等底物輔助結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1b）。GH18 家族幾丁質(zhì)酶催化結(jié)構(gòu)域較為保守，為經(jīng)典的（β/α）8TⅠM 桶結(jié)構(gòu)，由8 個(gè)α 螺旋和8個(gè)β折疊經(jīng)無(wú)規(guī)則卷曲（Loop）組成，催化裂隙位于桶結(jié)構(gòu)的上方。GH18家族幾丁質(zhì)酶根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)特征又可被分為A、B、C 3 個(gè)亞家族。其中，Sub A 幾丁質(zhì)酶在Loop7 上具有（α+β）插入結(jié)構(gòu)域（CⅠD），而Sub B和Sub C幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)則不存在插入結(jié)構(gòu)域，Sub B 在Loop6 上存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)［11］。GH19家族幾丁質(zhì)酶的催化結(jié)構(gòu)域高度螺旋化，其底物結(jié)合裂隙相對(duì)較淺。有研究表明，GH18家族幾丁質(zhì)酶在催化裂隙中存在保守的催化序列DxDxE，其中，SubA 亞家族結(jié)構(gòu)域CⅠD 中存在兩個(gè)相對(duì)保守的序列YxR 與［E/D］xx［Ⅴ/Ⅰ］，能夠參與底物的結(jié)合和催化［12］。而GH19 家族幾丁質(zhì)酶催化中心具有一個(gè)相對(duì)保守的序列［FHY］-G-R-G-［AP］-x-Q-［ⅠL］-［ST］-［FHYW］-［HN］-［FY］-NY，并以兩個(gè)Glu作為催化殘基（質(zhì)子酸與質(zhì)子堿），二者結(jié)合可以作為GH19 家族幾丁質(zhì)酶識(shí)別的標(biāo)志［10］。GH18 家族與GH19 家族保守結(jié)構(gòu)的不同可能直接導(dǎo)致其作用機(jī)制的差異［13］。

2 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的作用機(jī)制

GH18 家族幾丁質(zhì)酶為底物輔助保留型催化斷鍵 機(jī) 制 （substrate-assisted retaining catalytic mechanism），而GH19家族幾丁質(zhì)酶為單一置換反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制（single displacement inversion mechanism）。另外幾丁質(zhì)酶按照其作用模式分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶。前者可以隨意切割聚合物的鏈內(nèi)糖苷鍵生產(chǎn)寡糖，而后者只能從幾丁質(zhì)聚合物末端逐漸降解生成單體或二聚體［14］。GH18家族幾丁質(zhì)酶又可分為持續(xù)性幾丁質(zhì)酶和非持續(xù)性幾丁質(zhì)酶。持續(xù)性幾丁質(zhì)酶能夠沿著底物糖鏈滑動(dòng)，并在每次催化發(fā)生后不脫離幾丁質(zhì)鏈而進(jìn)行持續(xù)水解［15］，有效降解結(jié)晶幾丁質(zhì)。持續(xù)性幾丁質(zhì)酶多為外切幾丁質(zhì)酶，但也有例外，如人殼丙糖苷酶（human chitotriosidase，HCHT）是以持續(xù)性為降解模式的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶［16］。

2.1 酶與底物結(jié)合

不同幾丁質(zhì)酶底物結(jié)合裂隙的形狀和組成不同（圖2a）。GH18家族幾丁質(zhì)酶存在長(zhǎng)且深的底物結(jié)合裂隙，至少包含5 個(gè)底物結(jié)合亞位點(diǎn)（Sub C 亞家族），Sub B 亞家族Loop 的差異使得活性亞位點(diǎn)增為7 個(gè)，Sub A 亞家族CⅠD 結(jié)構(gòu)域的插入更加拓寬了酶分子與底物的結(jié)合裂隙，使亞位點(diǎn)擴(kuò)展為8個(gè)。并且不同亞家族活性架構(gòu)氨基酸的保守度明顯不同，其中Sub A（PDB ⅠD 1EHN）亞家族的保守度最高，絕對(duì)保守氨基酸在-6 到+2 亞位點(diǎn)都有分布，Sub B（PDB ⅠD 4AXN）與Sub C（PDB ⅠD 3A4W）亞家族的保守度相對(duì)較高，在-3 至+2 亞位點(diǎn)均存在保守氨基酸。GH18 家族3 個(gè)亞家族都具有相同的催化斷鍵位點(diǎn)（酸性的Asp和Glu）。而GH19家族幾丁質(zhì)酶（PDB ⅠD 3WH1）的底物結(jié)合裂隙較淺，一般可以容納4個(gè)底物糖環(huán)，相對(duì)保守的氨基酸在-2 至+2 亞位點(diǎn)均有分布，但其保守性相對(duì)GH18家族幾丁質(zhì)酶較弱（圖2a）。有趣的是，GH19 家族幾丁質(zhì)酶的正負(fù)亞位點(diǎn)結(jié)構(gòu)對(duì)稱，而GH18 家族幾丁質(zhì)酶正負(fù)亞位點(diǎn)結(jié)構(gòu)具有不對(duì)稱性，尤其是GH18 Sub A 亞家族。這表明在幾丁質(zhì)酶的進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)增加結(jié)合底物的亞位點(diǎn)，并形成類似隧道的活性架構(gòu)來(lái)獲得持續(xù)催化的能力［17］。

GH18家族幾丁質(zhì)酶與底物C2官能團(tuán)和突出的O6原子相互作用較多，在C2官能團(tuán)方面，幾丁質(zhì)酶同時(shí)結(jié)合底物亞氨基氮原子和乙?；踉樱Ｊ氐腉H18家族幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)殘基主要與底物的O7 原子相互作用；GH19 家族幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)殘基則不表現(xiàn)出對(duì)底物氮原子和氧原子的偏好。GH18 家族幾丁質(zhì)酶平均每個(gè)亞位點(diǎn)僅形成2 個(gè)氫鍵相互作用，GH19家族幾丁質(zhì)酶每個(gè)亞位點(diǎn)平均可形成4 個(gè)氫鍵相互作用，GH18 家族幾丁質(zhì)酶相對(duì)較少的氫鍵相互作用可加速持續(xù)性。GH18 和GH19家族幾丁質(zhì)酶活性中心表面都包含多個(gè)保守的芳香族氨基酸殘基，這些殘基通過(guò)疏水相互作用力結(jié)合幾丁質(zhì)底物［18-19］，但GH18家族幾丁質(zhì)酶的CH-π 相互作用平均分布于8 個(gè)亞位點(diǎn)，并且具有相對(duì)較高的保守性，為持續(xù)性作用提供滑行的軌道［7］，而GH19 家族幾丁質(zhì)酶的CH-π 相互作用主要存在于-2 及+2 亞位點(diǎn)，且保守性相對(duì)較低，可穩(wěn)定底物結(jié)構(gòu)（圖2b）。綜上所述，GH18 家族持續(xù)性幾丁質(zhì)酶活性架構(gòu)亞位點(diǎn)的不對(duì)稱性以及活性中心芳香族氨基酸的高度保守性可能是該家族幾丁質(zhì)酶具有持續(xù)性催化機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［20］。

Fig.2 Conserved analysis of chitinase active center圖2 幾丁質(zhì)酶活性中心保守性分析

2.2 催化機(jī)制

目前，隨著對(duì)GH18家族幾丁質(zhì)酶催化機(jī)制的研究，越來(lái)越多的證據(jù)表明底物輔助保留模型能夠更好地解釋反應(yīng)機(jī)理。以來(lái)自黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）的幾丁質(zhì)酶SmChiB（PDBⅠD 1E6N）為例闡述［21］，當(dāng)GlcNAc進(jìn)入-1亞位點(diǎn)時(shí)，在氨基酸殘基的作用下發(fā)生構(gòu)象變化，由椅式構(gòu)象變?yōu)榇綐?gòu)象，使得N-乙?；聂然踉涌拷愵^碳（C1）并發(fā)起親核攻擊，Tyr214 與羧基氧原子形成氫鍵穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)。Asp142 進(jìn)行翻轉(zhuǎn)與N-乙酰基形成氫鍵，穩(wěn)定中間體結(jié)構(gòu)，另外Asp142 翻轉(zhuǎn)后靠近Glu144 并與其形成氫鍵激活質(zhì)子供體，糖苷鍵斷裂，產(chǎn)物解離，惡唑啉離子中間體形成。后催化水分子對(duì)C1 發(fā)動(dòng)親核攻擊，惡唑啉離子中間體解體，Glu144 恢復(fù)初始狀態(tài)，Asp142 在Asp140 的輔助下翻轉(zhuǎn)回初始位置，產(chǎn)物釋放，水解完成（圖3a）。但也有個(gè)例存在，如來(lái)自同一株菌的SmChiA（PDB ⅠD 1EHN）［22］的催化過(guò)程中并未形成惡唑啉離子中間體。在底物糖苷鍵質(zhì)子化后，與Asp311相互作用的Asp313翻轉(zhuǎn)到其替代位，并與催化殘基Glu315 相互作用使得-1 亞位點(diǎn)GlcNAc的N-乙酰氨基團(tuán)繞C2-N2旋轉(zhuǎn)，N-乙酰氨基團(tuán)的N-H翻轉(zhuǎn)至另一位置完成水解過(guò)程。

GH19 家族幾丁質(zhì)酶采用單一置換反轉(zhuǎn)機(jī)制，以來(lái)自蕊形真蘚（Bryum coronatum）的GH19家族幾丁質(zhì)酶BcChi-A（PDB ⅠD 3WH1）［23］為例進(jìn)行闡述。催化過(guò)程如下（圖3b）：催化反應(yīng)發(fā)生前，Glu61作為催化酸，Glu89作為催化堿。GlcNAc到達(dá)-1亞位點(diǎn)時(shí)保持椅式構(gòu)象不變。Glu61提供H離子使糖苷鍵中的異頭氧原子質(zhì)子化，糖苷鍵斷裂，形成羰基碳鎓離子中間體，同時(shí)Gln164 與-1 亞位點(diǎn)的GlcNAc的N-乙酰氨基團(tuán)形成氫鍵，從而阻止惡唑啉離子中間體的形成。Glu70作為一般堿起著穩(wěn)定水分子的作用，當(dāng)中間體形成后，被Ser102的羥基氧原子形成氫鍵固定的催化水分子可以被Glu70激活并發(fā)生親核攻擊。水解產(chǎn)物發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)，產(chǎn)生α異頭物，產(chǎn)物釋放，水解完成。

Fig.3 The schematic diagram of chitinase catalysis mechanism圖3 幾丁質(zhì)酶催化機(jī)制示意圖

3 持續(xù)性作用機(jī)制

由于結(jié)晶幾丁質(zhì)具有抗降解性，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶要從結(jié)晶表面剝離出單條幾丁質(zhì)鏈，進(jìn)而可以持續(xù)性降解，不斷產(chǎn)生二糖單元。目前，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在模式細(xì)菌S.marcescens中得到一定研究。S.marcescens包含兩個(gè)持續(xù)性幾丁質(zhì)酶，SmChiA 和SmChiB，屬于GH18 家族并具有保守的CⅠD結(jié)構(gòu)域［12］。其中SmChiA從非還原端向還原端移動(dòng)，在非還原端在釋放（GlcNAc）2，而SmChiB則從還原端向非還原端移動(dòng)，在還原端釋放（GlcNAc）2（圖4a），SmChiA的半衰期和速度都比SmChiB 大，表明不對(duì)稱的亞位點(diǎn)結(jié)構(gòu)決定了結(jié)晶多糖的降解方向和程度［24］。結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明兩者的活性架構(gòu)中芳香氨基酸呈線性排列［18］。這些芳香族殘基（特別是Trp）可以與糖環(huán)的一側(cè)或兩側(cè)形成堆積或疏水相互作用，并形成一個(gè)靈活的鞘，推動(dòng)幾丁質(zhì)鏈沿著鞘滑動(dòng)［25］?；钚约軜?gòu)芳香族氨基酸的缺失通常會(huì)導(dǎo)致酶對(duì)結(jié)晶幾丁質(zhì)底物的親和力、持續(xù)性和活性降低［7］。此外，活性架構(gòu)中極性殘基與芳香殘基均呈線性排列（圖4b），也可能參與持續(xù)性。Hamre 等［25］證明活性架構(gòu)極性氨基酸Thr276 在持續(xù)性作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用，突變體ChiA-T276A產(chǎn)物的［（GlcNAc）2］/［GlcNAc］比例降低近50%，幾丁質(zhì)降解效率降低26.7%。Jana等［26］通過(guò)定點(diǎn)誘變確定了S.marcescens幾丁質(zhì)酶SmChiB 活性架構(gòu)中極性氨基酸的作用。但是，目前對(duì)極性殘基在底物結(jié)合、糖苷酶作用模式和持續(xù)性中的作用的了解仍然相對(duì)有限。

Fig.4 The schematic diagram of the processive catalysis mechanism of chitinases圖4 幾丁質(zhì)酶持續(xù)性催化機(jī)制示意圖

盡管結(jié)晶幾丁質(zhì)和纖維素的物理和化學(xué)穩(wěn)定性是相似的，但是幾丁質(zhì)酶移動(dòng)產(chǎn)生雙糖的速度是纖維素酶的10 倍［27-28］。幾丁質(zhì)酶快速單向運(yùn)動(dòng)的機(jī)制越來(lái)越受到人們的關(guān)注。Nakamura等［29］利用高精度單分子成像、X射線晶體學(xué)和全原子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)研究了SmChiA單向持續(xù)性運(yùn)動(dòng)機(jī)理，分為化學(xué)步驟（底物輔助催化和產(chǎn)物釋放）和機(jī)械步驟（脫晶和鏈滑動(dòng)）。在另一項(xiàng)研究中，Nakamura等［30］通過(guò)單分子熒光成像成功測(cè)定了SmChiA 的基本速率常數(shù)，結(jié)果表明持續(xù)性幾丁質(zhì)酶SmChiA需要與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶以及輔助催化酶類AA10家族裂解多糖單加氧酶CBP21（LPMO）協(xié)同作用，才能有效地結(jié)合到鏈端并增加水解活性。為了研究幾丁質(zhì)酶的持續(xù)性，人們開發(fā)了各種各樣的研究方法。經(jīng)典的方法包括使用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法定量產(chǎn)物，計(jì)算G2/（G1+G3）的比例［31-32］以及可溶性還原糖的比例［33］，使用水溶性殼聚糖（部分去乙?；瘞锥≠|(zhì)）作為底物測(cè)定產(chǎn)物中偶數(shù)糖與奇數(shù)糖的比例。此外，使用熒光標(biāo)記底物［34-35］或安培生物傳感器［36］已成功地確定有效結(jié)合酶的分?jǐn)?shù)，以估計(jì)酶的持續(xù)性能力。近年來(lái)，高速原子力顯微鏡［37］或全內(nèi)反射熒光顯微鏡［30，38］等單分子成像技術(shù)的應(yīng)用，使人們能夠直接觀察有效結(jié)合的持續(xù)性酶。

4 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶系協(xié)同降解模式

自然界中，幾丁質(zhì)經(jīng)過(guò)脫乙?；刃揎椬饔?，其結(jié)構(gòu)具有一定的復(fù)雜性，需要多種幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解［2，39］。一些細(xì)菌可以分泌多種幾丁質(zhì)酶，利用特異的協(xié)同降解模式實(shí)現(xiàn)高效降解幾丁質(zhì)。代表菌株是模式菌S.marcescens，分泌GH18 家族幾丁質(zhì)酶SmChiA、SmChiB 和SmChiC、GH20 家族殼二糖酶（chitobiase）和LPMO［27，40-41］；嗜熱鏈霉菌Streptomycessp. F-3，胞外分泌6 種幾丁質(zhì)降解相關(guān)蛋白，除了GH18 家族幾丁質(zhì)酶SsChi18A、SsChi18B 和SsChi18C、GH20 家 族SsGH20A 和AA10 家族裂解多糖單加氧酶SsLPMO10A 外，還包含一種GH19 家族幾丁質(zhì)酶SsChi19A［11］；紅茶纖維弧菌（Cellνibrio japonicas）可分泌GH18家族的幾丁質(zhì)酶CjChi18B、CjChi18C、CjChi18D 及GH18 家族糖苷酶CjChi18A，及AA10 家族的CjLPMO［41］。幾丁質(zhì)降解酶系包含至少4 類酶：a. LPMO，如CBP21、SsLPMO10A 和CjLPMO，通過(guò)氧化裂解作用隨機(jī)切割幾丁質(zhì)聚合物釋放自由鏈末端；b. 內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，如GH18 家族的SmChiC、SsChi18B、SsChi18C、CjChi18C 和CjChi18D，GH19家族的SsChi19A，通過(guò)水解作用使糖苷鍵斷裂，從而釋放自由鏈末端或產(chǎn)生寡聚糖；c. 持續(xù)性外切幾丁質(zhì)酶，如SmChiA、SmChiB、SsChi18A 及CjChi18B，它們均屬于GH18-Sub A 家族，可從幾丁質(zhì)鏈的還原端或非還原端持續(xù)性降解并產(chǎn)生二糖單元；d.殼二糖酶或N-乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 苷 酶 （endo-β-Nacetylglucosaminidase，NAG），如GH20 家族的殼二糖酶、SsGH20A 和GH18 家族的CjChi18A，將（GlcNAc）2水解為GlcNAc。幾丁質(zhì)酶系協(xié)同降解過(guò)程如下［42］：LPMO 和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在結(jié)晶幾丁質(zhì)表面作用釋放自由鏈末端，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶由鏈末端切入、剝離幾丁質(zhì)單鏈并進(jìn)行持續(xù)性降解產(chǎn)生二糖單元，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在作用過(guò)程中產(chǎn)生的寡聚糖，由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶或持續(xù)性幾丁質(zhì)酶進(jìn)一步降解產(chǎn)生寡糖，最后殼二糖酶或β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶將寡糖降解為單糖，運(yùn)送至胞內(nèi)進(jìn)一步降解（圖5a-c）。研究表明，一些不具備幾丁質(zhì)水解活性的結(jié)合蛋白（chitin binding protein，CBP）可增加底物可及性與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用［43］。

在細(xì)菌中，磷酸烯醇丙酮酸依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）和ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體分別負(fù)責(zé)GlcNAc單體和低聚物的攝?。?4］，這些產(chǎn)物在胞內(nèi)進(jìn)行代謝，經(jīng)EMP途徑進(jìn)入TCA循環(huán)，實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)的徹底降解（圖5d）。此外，弧菌幾丁質(zhì)水解酶的誘導(dǎo)受到組氨酸激酶和雙組分系統(tǒng)的復(fù)雜調(diào)節(jié)（圖5e）。在靜息狀態(tài)下，CBP 與膜蛋白ChiS 的周質(zhì)域結(jié)合。當(dāng)分泌的幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)降解為胞外空間的低聚糖時(shí)，低聚糖被孔蛋白運(yùn)輸并與CBP結(jié)合。在結(jié)合狀態(tài)下，CBP/ChiS 復(fù)合物解離并轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)表達(dá)幾丁質(zhì)降解基因。ChiS 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域由3 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成：依賴ATP 的組氨酸激酶/磷酸酶（HK）結(jié)構(gòu)域、Asp 響應(yīng)調(diào)節(jié)器（RR）域和組氨酸磷酸化轉(zhuǎn)移（HP）結(jié)構(gòu)域［45］。

Fig.5 The shematic diagram of synergistic degradation of chitinases圖5 幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解示意圖

5 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶系的理性設(shè)計(jì)策略

為滿足工業(yè)應(yīng)用需求，提高幾丁質(zhì)酶的催化活性和熱穩(wěn)定性是目前幾丁質(zhì)酶設(shè)計(jì)的研究熱點(diǎn)，表1總結(jié)了近年來(lái)對(duì)幾丁質(zhì)酶設(shè)計(jì)改造的實(shí)例。傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)策略定向進(jìn)化技術(shù)通過(guò)隨機(jī)誘變或重組技術(shù)獲得突變體，不需對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能有深入的了解，但是構(gòu)建的突變文庫(kù)容量非常大，所以該方法對(duì)高通量篩選的方法要求非常高［46］。Songsiriritthigul 等［47］利用定向進(jìn)化技術(shù)，對(duì)地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）來(lái)源的GH18 家族ChiA進(jìn)行易錯(cuò)突變，從10個(gè)突變體中最終篩選到酶活性提高2.7 倍的幾丁質(zhì)酶突變體。Menghiu等［48］通過(guò)易錯(cuò)PCR 技術(shù)建立Bacillus licheniformisDSM8785 chiA 的突變體庫(kù)，使用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)篩選出酶活提高100%的突變體DH08，發(fā)現(xiàn)在DH08 中3 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變分別是K128E、H130N和D220Y。

目前對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行設(shè)計(jì)使用最多的是半理性設(shè)計(jì)策略，該策略在對(duì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上對(duì)特定結(jié)構(gòu)域的殘基進(jìn)行突變，建立簡(jiǎn)潔的突變體庫(kù)，通過(guò)組合篩選出最優(yōu)突變體。例如，采用基于共識(shí)的半理性設(shè)計(jì)引入二硫鍵和Pro 提高了幾丁質(zhì)酶PpChi1 的熱穩(wěn)定性，50℃時(shí)半衰期值為野生型的26.3 倍，最適反應(yīng)溫度由45℃提高到52.5℃［49］。用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌WL-12 （Bacillus circulansWL-12）BcChiA1 的CBM12 代 替 白 長(zhǎng) 鏈 霉 菌ATCC 27414 （Streptomyces albolongusATCC 27414）SaChiA4 的CBM5，使SaChiA4 對(duì)幾丁質(zhì)粉的活性提高了近54%（28×103U/g），對(duì)膠質(zhì)幾丁質(zhì)活性提高了49%［50］。深綠木霉PTCC5220（Trichoderma atroνiridePTCC5220）的Chit42 缺乏1 個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將S. marcescens SmChiB的CBM 與Chit42 融合，得到了一種具有更強(qiáng)幾丁質(zhì)結(jié)合能力的嵌合幾丁質(zhì)酶，并且嵌合幾丁質(zhì)酶對(duì)植物病原真菌具有較高的抗真菌活性［51］。

理性設(shè)計(jì)B.circulans的ChiA1 突變體突變T682A 導(dǎo)致了對(duì)幾丁質(zhì)底物更高的特異性［52］。突變S.marcescensChiB 的表面殘基構(gòu)成G188A/A234P 雙突變體，其在57℃時(shí)，半衰期增加了10倍，表觀Tm增加了4.2℃［53］。S.marcescensB4A 的幾丁質(zhì)酶突變體S390Ⅰ可耐受90℃高溫［54］。蘇云金芽孢桿菌WB7（Bacillus thuringiensisWB7）活性位點(diǎn)突變體E209Q拓寬pH［55］。

隨著幾丁質(zhì)酶被表征的序列和結(jié)構(gòu)不斷增多，計(jì)算分析方法不斷更新?？梢曰诘鞍踪|(zhì)（亞）家族豐富的序列數(shù)據(jù)的祖先序列重構(gòu)技術(shù)來(lái)對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行設(shè)計(jì)。研究表明，寒武紀(jì)前的酶分子比現(xiàn)存的酶更耐高溫，所以將現(xiàn)存酶恢復(fù)成祖先酶的序列可以設(shè)計(jì)出耐熱蛋白，該方法現(xiàn)已成功獲得了更耐熱的細(xì)胞色素P450 酶和更耐高溫的酮醇酸還原異構(gòu)酶［56］。另一方面，可以基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，利用已有結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子模建，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及酶活性中心序列譜。AlphaFold 利用多序列比對(duì)，將有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理和生物學(xué)知識(shí)結(jié)合在深度學(xué)習(xí)算法的設(shè)計(jì)中，高度精確地預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為理性設(shè)計(jì)提供精確的模板［57-59］。通過(guò)對(duì)GH18 3 個(gè)亞家族和GH19 家族的活性中心序列譜分析發(fā)現(xiàn)，其活性架構(gòu)亞位點(diǎn)數(shù)是從大到小變化的，并且保守性也是越來(lái)越低的。這種基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析可以定位關(guān)鍵功能區(qū)和功能殘基，建立小而精的突變文庫(kù)，從而有效改變酶的穩(wěn)定性、活性及底物特異性等［60］。

Table 1 Recent progress in engineering activity and stability of chitinases表1 幾丁質(zhì)酶改造實(shí)例

續(xù)表1

6 總結(jié)與展望

幾丁質(zhì)酶解產(chǎn)物CHOS 及GlcNAc 在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、工業(yè)等方面發(fā)揮重要作用。CHOS被認(rèn)為是潛在的益生元，容易被人體腸道吸收并可抑制一些食物致病菌的生長(zhǎng)［62］。研究發(fā)現(xiàn)，CHOS 不僅能夠影響各種復(fù)雜途徑抑制結(jié)腸黏膜內(nèi)的炎癥［63］，而且在新的抗癌治療策略中得到了廣泛的關(guān)注［64］。GlcNAc 能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞釋放酸性黏多糖，恢復(fù)胃腸道保護(hù)結(jié)構(gòu)的形成，是一種潛在的治療炎癥性腸病的候選藥物［60］。在未來(lái)的研究中，可以運(yùn)用代謝工程策略將代謝通量轉(zhuǎn)向目標(biāo)產(chǎn)物，也可以有效強(qiáng)化整個(gè)幾丁質(zhì)降解途徑，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成。

雖然許多細(xì)菌幾丁質(zhì)酶被純化和表征，但不同幾丁質(zhì)酶確切的相互作用和催化機(jī)制仍然是不清楚的，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶前進(jìn)的動(dòng)力之源仍未得到解答，LPMO 氧化還原作用所需還原能的來(lái)源仍未知，進(jìn)一步的機(jī)制研究是必須且迫切的。另外，GH19 家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能有待進(jìn)一步研究。幾丁質(zhì)協(xié)同降解酶系的精細(xì)分工與合作仍需進(jìn)一步探究。目前，蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)改造現(xiàn)存的幾丁質(zhì)酶分子，以提高幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性和催化活性，構(gòu)建高效的協(xié)同降解酶系是工業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。雖然人們已經(jīng)嘗試運(yùn)用定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)等方法來(lái)設(shè)計(jì)酶分子，但是仍需要建立一個(gè)普適的策略能夠大幅度地提高酶分子的性質(zhì)。前面已經(jīng)提到了祖先序列重構(gòu)和基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的理性設(shè)計(jì)策略需要被分析和發(fā)展，依賴于結(jié)構(gòu)和大量的時(shí)間、資源來(lái)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的分子動(dòng)力學(xué)模擬和深度學(xué)習(xí)技術(shù)在用來(lái)改造酶分子的道路上仍任重道遠(yuǎn)。