楊煥林,王 琪,楊 明,鐘凌云,劉 博,吳云山,陸兔林,劉明貴,曾翠金,柯 瑞,徐蔥蘢,付建武*
(1.江西景德中藥股份有限公司,江西 樂(lè)平 333302;2.景德鎮(zhèn)市市場(chǎng)監(jiān)督管理綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心,江西 景德鎮(zhèn) 333000;3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江西 南昌 330004;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院,廣東 廣州 510006;5.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)
薏苡仁,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,是禾本科植物薏米(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.) Stapf)的干燥成熟種仁,性涼,味甘、淡,具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)的功能[1-2]?,F(xiàn)2020年版《中國(guó)藥典》薏苡仁項(xiàng)下僅收載了薏苡仁和麩炒薏苡仁2個(gè)炮制品種[2]。法薏苡仁為薏苡仁采用樟幫特色炮制方法制備而成,目前僅收錄在江西、廣東、貴州等幾個(gè)省份的中藥飲片炮制規(guī)范[4-8]。法薏苡仁由薏苡仁生品經(jīng)浸制、蒸制、炒制等多種方法炮制而得,其性由涼轉(zhuǎn)微溫,更適合兒童、老人以及某些特殊病癥人群,且炮制后,法薏苡仁的利水祛濕、健脾止瀉的功效顯著優(yōu)于目前其他的薏苡仁炮制品種[3]。但法薏苡仁炮制前后質(zhì)量差異對(duì)比目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,本研究通過(guò)比較薏苡仁、麩炒薏苡仁和法薏苡仁中甘油三油酸酯含量與特征圖譜中7個(gè)共有峰成分相對(duì)含量的差異,為體現(xiàn)薏苡仁古法炮制作用優(yōu)勢(shì)及中醫(yī)臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
液相色譜 Agilent 1260 Infinity II液相色譜儀(Agilent Technologies,Inc,CA,USA),Agilent 1260 蒸發(fā)光散射(ELSD)檢測(cè)器(Agilent Technologies,Inc,CA,USA),電子天平(MT104E,Sartorius,Germany),超聲清洗儀(8510E-MT,Bransonic,BRANSON ULTRASONICS CORPORATION,USA)。
甘油三油酸酯對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(批號(hào):S16M10I88463,純度>99%);甲醇為HPLC級(jí)(默克股份兩合公司,4L);水為超純水(默克密理博有限公司,ELIX超純水系統(tǒng))。
編號(hào)“10~13”樣品購(gòu)于不同廠(chǎng)家(原藥材源于不同產(chǎn)地),其他薏苡仁炮制品由江西景德中藥股份有限公司提供,見(jiàn)表1。
表1 不同薏苡仁炮制品
色譜柱:Agilent Poroshell 120 SB-C8柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);流動(dòng)相:甲醇;洗脫方式:等度洗脫;流速:0.3 mL/min;柱溫:30 ℃。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù):漂移管溫度40 ℃,氣體壓力3.4 bar,Gain 11,F(xiàn)ilter 10 s。
取甘油三油酸酯對(duì)照品39.682 5 mg,精密稱(chēng)定,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(90 W,45 kHz)30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻,制得每1 mL含甘油三油酸酯1.587 3 mg的對(duì)照品溶液,備用。
取樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.2 g,精密稱(chēng)定,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入二氯甲烷10 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(90 W,45 kHz)30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用二氯甲烷補(bǔ)足減失重量,搖勻,離心,取上清液。重復(fù)超聲處理提取3次,合并濾液,搖勻,離心,取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),濾液作為供試品溶液,備用。
分別精密吸取對(duì)照品溶液1 μL、4 μL,供試品溶液2~3 μL,注入高效液相色譜儀,測(cè)定,記錄色譜峰峰面積,用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算甘油三油酸酯含量,即得。
按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 μL,分別連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜峰峰面積,計(jì)算得甘油三油酸酯峰面積RSD分別為0.93%、1.29%,均小于2%。結(jié)果表明該儀器的精密度良好。
將“2.3”項(xiàng)下供試品溶液,在室溫條件下放置0、1、2、4、8、12 h后測(cè)定,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別精密吸取供試品溶液2 μL進(jìn)樣1次,記錄色譜峰峰面積,計(jì)算得甘油三油酸酯峰面積RSD為1.71%,小于2%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
精密移取上述“2.2”項(xiàng)下甘油三油酸酯對(duì)照品溶液適量,稀釋成6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別精密吸取供試品溶液2 μL,每個(gè)濃度的線(xiàn)性溶液各進(jìn)樣2次,記錄色譜峰峰面積。以甘油三油酸酯濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)平均峰面積對(duì)數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算線(xiàn)性回歸方程,得Y=1.693 4X+4.602 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 5。結(jié)果表明,甘油三油酸酯在0.050 1~0.401 0 mg/mL范圍內(nèi)濃度對(duì)數(shù)與峰面積對(duì)數(shù)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。
取法薏苡仁樣品粉末6份,每份0.2 g,精密稱(chēng)定,按“2.3”項(xiàng)下操作制備成供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別精密吸取供試品溶液2 μL,各進(jìn)樣2次,記錄色譜峰峰面積,計(jì)算得法薏苡仁中甘油三油酸酯含量的RSD值為2.55%,小于3%。結(jié)果表明,本含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。
取甘油三油酸酯對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加入適量甲醇,超聲處理(90 W,45 kHz)使溶解,加甲醇定容,制成每mL含甘油三油酸酯0.5 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液,精密加入色譜級(jí)甲醇,渦旋3 min,混勻,制成每1 mL含甘油三油酸酯0.132 mg的對(duì)照品溶液。
精密稱(chēng)取已知含量的法薏仁樣品粉末9份,每份100 mg,精密稱(chēng)定,每3份為一組,每組分別按已知樣品甘油三油酸酯含量的80%、100%、120%的比例加入一定量的甘油三油酸酯對(duì)照品溶液,搖勻,余按“2.3”項(xiàng)下操作制備成供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,各進(jìn)樣2次,記錄色譜峰峰面積并計(jì)算其回收率,見(jiàn)表2。測(cè)得回收率均在92%~105%限度范圍內(nèi),平均回收率為99.66%,且其RSD值為1.96%,小于2 %。結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確度良好。
表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
取不同薏苡仁炮制品樣品,粉碎,過(guò)三號(hào)篩,按“2.3”項(xiàng)下操作制備成供試液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,各進(jìn)樣2次,記錄色譜峰峰面積并計(jì)算甘油三油酸酯含量,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 不同薏苡仁炮制品中甘油三油酸酯含量
結(jié)果表明,法薏苡仁的甘油三油酸酯含量最高;薏苡仁的甘油三油酸酯含量均大于0.50%,麩炒薏苡仁的甘油三油酸酯含量均大于0.40%,都符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。
在同一色譜條件,比較特征圖譜下7個(gè)共有峰成分相對(duì)含量的變化,分別計(jì)算不同薏苡仁炮制品共有成分的相對(duì)含量,結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和表4。
注:A:峰1;B:峰2;C:峰3;D:峰4;E:峰5;F:峰6;G:甘油三油酸酯。圖1 不同薏苡仁炮制品共有成分
圖2 不同薏苡仁炮制品中共有峰相對(duì)含量變化
表4 7個(gè)共有峰成分的相對(duì)含量(%)
結(jié)果表明,不同薏苡仁炮制品中,峰1、峰3和峰5的相對(duì)含量變化顯著,這種變化對(duì)療效的影響值得進(jìn)一步深入研究。
薏苡仁抗腫瘤主要成分是薏苡仁油中的甘油三酯類(lèi)成分,包括甘油三油酸酯、甘油三亞油酸酯、1,2-油酸-3-亞油酸甘油酯、1,2-油酸-3-棕櫚酸甘油酯等[10],其中甘油三油酸酯為2020年版《中國(guó)藥典》中薏苡仁和麩炒薏苡仁質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分[2]。
本研究結(jié)果表明,同一地區(qū)(貴州)產(chǎn)的薏苡仁藥材,甘油三油酸酯含量雖有一定的差異,但被炮制成法薏苡仁后,其檢測(cè)出的甘油三油酸酯含量差異不大,均大于1.8%,含量最高且質(zhì)量穩(wěn)定。麩炒之后,甘油三油酸酯含量變化不大,說(shuō)明麩炒并不會(huì)對(duì)薏苡仁的炮制以及成分發(fā)生根本性改變。本次收集的市面上麩炒薏苡仁的甘油三油酸酯含量參差不齊,但都不超過(guò)0.9%,遠(yuǎn)低于法薏苡仁。
從不同炮制品薏苡仁共有峰成分的相對(duì)含量結(jié)果分析,薏苡仁炮制成法薏苡仁后,共有成分的相對(duì)含量變化明顯,峰1、峰3的相對(duì)含量明顯升高,峰5的相對(duì)含量明顯降低,峰2、峰4、峰6和甘油三油酸酯的相對(duì)含量變化不大。法薏苡仁與麩炒薏苡仁相比,法薏苡仁的峰1和甘油三油酸酯的相對(duì)含量明顯較高。這意味著薏苡仁炮制品中峰1、峰3和峰5的相對(duì)含量發(fā)生改變可能是法薏苡仁藥效顯著增強(qiáng)的成分基礎(chǔ),法薏苡仁具有更強(qiáng)的利水祛濕、健脾止瀉功效,則很有可能與峰1相對(duì)含量的升高有關(guān)。
本研究結(jié)果顯示,相比于生薏苡仁和麩炒薏苡仁,法薏苡仁的甘油三油酸酯含量更高,抗腫瘤效果更佳;薏苡仁炮制品中7個(gè)共有峰成分的相對(duì)含量,尤其是峰1、峰3、峰5的相對(duì)含量,可能是法薏苡仁健脾祛濕藥效顯著增強(qiáng)的成分基礎(chǔ)。薏苡仁炮制品中7個(gè)共有成分的檢識(shí)、以及相對(duì)含量的變化對(duì)療效的確切影響和作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入發(fā)掘及研究。