趙日虹，賀蔚緯，姜秋杰，王 楠，孫長(zhǎng)江，馮 新，顧敬敏*，韓文瑜* (.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 006;.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 006；.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 006)

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)是最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病性病原體之一，通常會(huì)引起多種醫(yī)院獲得性感染以及社區(qū)獲得性感染。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，肺炎克雷伯菌可引發(fā)一系列病理變化，如肺炎、乳腺炎、子宮炎等化膿性炎癥甚至敗血癥[1]。目前隨著養(yǎng)殖業(yè)和臨床大量且無(wú)節(jié)制的濫用抗生素，肺炎克雷伯菌已趨向于多重耐藥(MDR)[2]，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantK.pneumoniae,CRKP)已經(jīng)受到世界衛(wèi)生組織的“重點(diǎn)關(guān)注”，成為世界上治療最為困難的革蘭陰性菌之一[3]。耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn)，給臨床治療用藥選擇造成極大困難，研發(fā)新型抑菌藥物迫在眉睫。

噬菌體作為細(xì)菌的天然殺手，能特異性感染并殺滅細(xì)菌。目前，噬菌體療法越來(lái)越多地被報(bào)道為MDR細(xì)菌感染患者的最后希望，甚至被用于治療COVID-19感染者的繼發(fā)性細(xì)菌感染[4]。在治療肺炎克雷伯菌感染的案例中，噬菌體雞尾酒和抗生素聯(lián)合療法成功治愈由MDR 肺炎克雷伯菌引起的多灶性尿道感染[5]。噬菌體KPJH46和抗生素通過(guò)靜脈注射聯(lián)合治療，成功挽救一位飽受困擾11年之久的人工膝關(guān)節(jié)感染肺炎克雷伯菌患者[6]。噬菌體良好的治療效果，顯示出其在防控細(xì)菌感染方面的巨大潛力。

本研究利用耐碳青霉烯類K47型肺炎克雷伯菌KPN-1從污水中分離得到一株新型裂解性噬菌體，并對(duì)其生物學(xué)特性及全基因組序列進(jìn)行分析，為肺炎克雷伯菌噬菌體及耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來(lái)源與鑒定 肺炎克雷伯菌KPN-1分離自吉林大學(xué)第一醫(yī)院的臨床樣本(中國(guó)，長(zhǎng)春)，并通過(guò)16S rRNA基因鑒定引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R (5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行初步鑒定[7]。通過(guò)對(duì)莢膜多糖合成相關(guān)基因wzi[8](F：5′-GTGCCGCGAGCGCTTTCTATCTTGGTATTCC-3′，R：5′-GAGAGCCACTGGTTCCAGAA-CTTCACCGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將測(cè)序得到的序列上傳至https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，鑒定KPN-1的血清型。

1.1.2主要試劑和儀器 胰蛋白胨及酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID 公司；0.22 μm一次性針頭過(guò)濾器購(gòu)于Merck Millipore公司； DNaseⅠ、RNase A購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自Doraville公司(美國(guó))；透射電子顯微鏡購(gòu)于Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1噬菌體的分離純化 采集長(zhǎng)春城市污水樣品，以KPN-1為宿主菌進(jìn)行噬菌體分離，具體步驟：用紗布過(guò)濾后的污水樣品配置LB培養(yǎng)基，將1 mL對(duì)數(shù)期(D600 nm=0.6～0.8)的KPN-1菌液與之混合。將混合物置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，12 000×g離心2 min， 收集上清并通過(guò)0.22 μm 濾器進(jìn)行過(guò)濾，獲得噬菌體原液并保存。利用空斑法[9]檢測(cè)噬菌體，并通過(guò)雙層平板法[10]對(duì)噬菌體進(jìn)行純化，重復(fù)雙層平板試驗(yàn)，挑取4～5次單個(gè)噬菌斑，將噬菌體純化至噬菌斑大小一致，將獲得的噬菌體命名為vB_KpnP_ZK2(簡(jiǎn)稱ZK2)

1.2.2噬菌體的電鏡觀察 將純化后的ZK2進(jìn)行大量擴(kuò)增并用PEG-8000進(jìn)行沉淀，離心回收沉淀的噬菌體顆粒，加入SM液充分洗滌沉淀后，用氯仿抽提濃縮。取1滴濃縮后的噬菌體懸液滴在銅網(wǎng)上，15 min后用濾紙吸去多余的液體，用 2%的磷鎢酸(PTA)染色1～2 min，干燥后使用透射電鏡觀察。

1.2.3噬菌體ZK2最佳感染復(fù)數(shù) (MOI) 的測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的KPN-1調(diào)整為108CFU/mL，將噬菌體與KPN-1按照一定比例(分別為MOI=0.000 000 001，0.000 000 01，0.000 000 1，0.000 001，0.000 01，0.000 1，0.001，0.01，0.1，1)進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h。將培養(yǎng)液4℃,12 000×g離心15 min，用0.22 μm 濾器對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾得到噬菌體增殖液，進(jìn)行10倍倍比稀釋后，利用雙層平板法測(cè)定噬菌體滴度，以確定噬菌體的最佳 MOI，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的KPN-1與ZK2按照MOI=0.001的比例混合，于37℃孵育2 min后，4℃，10 000×g離心10 min，用10 mL LB液體培養(yǎng)基將沉淀懸起，懸液于37℃振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)的0，1，2，3，5，10，15，20，25，30，40，50，60 min各取1次樣品，利用雙層平板法測(cè)定噬菌體的滴度，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，繪制出噬菌體感染細(xì)菌的一步生長(zhǎng)曲線。

1.2.5噬菌體的宿主譜測(cè)定 將ZK2滴度調(diào)整為108PFU/mL，選擇多株肺炎克雷伯菌，通過(guò)空斑法和雙層平板法對(duì)ZK2的宿主譜進(jìn)行測(cè)定，觀察是否形成空斑或噬菌斑，若形成則說(shuō)明ZK2對(duì)該菌有裂解活性。共選取26株肺炎克雷伯菌進(jìn)行測(cè)試，全部分離菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.6藥敏試驗(yàn) 將對(duì)ZK2敏感的肺炎克雷伯菌接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)4～6 h。將菌液調(diào)整為麥?zhǔn)蠞岫葹?.5后，用棉簽將其均勻涂布LB固體平板，干燥后通過(guò)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。耐藥性評(píng)價(jià)參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7噬菌體基因組的提取和測(cè)序分析 使用病毒基因組提取試劑盒(Omega Bio-Tek Inc.，美國(guó))從1.2.1濃縮的噬菌體中提取基因組，并通過(guò)Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，利用 Newbler v.2.8進(jìn)行序列組裝[11]。使用GeneMarks軟件預(yù)測(cè)噬菌體ZK2潛在的開(kāi)放閱讀框架(ORF)[12]。通過(guò)NCBI的PSI-BLAST(閾值=0.000 1)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)搜索比較，注釋ZK2中編碼區(qū)域的功能[13]。使用CLC Main Workbench軟件(CLC Bio-Qiagen，Aarhus，Denmark)生成噬菌體基因組的示意圖。 使用PHYLIP軟件繪制噬菌體DNA聚合酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離和純化利用KPN-1從污水中分離出1株噬菌體，純化培養(yǎng)24 h后，獲得周圍有半透明暈環(huán)、中心透亮的噬菌斑(圖1)，表明該噬菌體具有較強(qiáng)的裂解活性，可能具有產(chǎn)生解聚酶的能力，將其命名為vB_KpnP_ZK2(簡(jiǎn)稱ZK2)。

圖1 噬菌體ZK2 純化后在雙層板上產(chǎn)生的噬斑

2.2 噬菌體的形態(tài)學(xué)特征利用透射電子顯微鏡進(jìn)行ZK2的形態(tài)學(xué)觀察。電鏡下可見(jiàn)ZK2具有一個(gè)二十面體的頭部以及一個(gè)短的不可收縮的尾部(圖2)，這些特點(diǎn)表明ZK2 屬于有尾噬菌體目，短尾噬菌體科。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)ZK2的頭部直徑為(60 ± 5) nm，尾部長(zhǎng)(5 ± 5) nm。

圖2 噬菌體ZK2 的透射電鏡圖(比例尺100 nm)

2.3 噬菌體的最佳MOI將ZK2與宿主菌KPN-1按一定比例混合，當(dāng)以MOI為 0.000 000 01 時(shí)，ZK2產(chǎn)生最大滴度(圖3)，表明 0.000 000 01是ZK2的最佳MOI。

圖3 噬菌體ZK2的感染復(fù)數(shù)

2.4 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線ZK2的一步生長(zhǎng)曲線如圖4所示，在MOI為0.001的條件下， ZK2的潛伏期約為2 min，大約50 min達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái)階段，每個(gè)感染細(xì)胞的暴發(fā)量約為186 PFU/cell。

圖4 噬菌體ZK2的一步生長(zhǎng)曲線

2.5 噬菌體的宿主譜利用空斑法和雙層瓊脂平板法測(cè)定ZK2的宿主譜，結(jié)果顯示在所有26株測(cè)試的肺炎克雷伯菌菌株的平板上，有6株能產(chǎn)生空斑和噬菌斑，且這6株肺炎克雷伯菌均為K47血清型(表1)，表明ZK2對(duì)K47血清型的肺炎克雷伯菌有高度特異性。

表1 噬菌體ZK2的裂解譜

2.6 肺炎克雷伯菌的藥敏試驗(yàn)對(duì)能產(chǎn)生空斑和噬菌斑的6株肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示大部分菌株對(duì)多黏菌素、氟本尼考和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出敏感性，全部菌株均對(duì)青霉素、紅霉素、四環(huán)素、阿莫西林、氨芐西林和強(qiáng)力霉素表現(xiàn)出耐藥性(表2)。值得注意的是，這6株K47型肺炎克雷伯菌中有5株對(duì)美羅培南和亞胺培南表現(xiàn)出耐藥性，表明這5株菌為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。

表2 ZK2敏感菌株對(duì)抗生素的耐藥性評(píng)價(jià)

2.7 噬菌體的全基因組分析對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行測(cè)序和拼接，將噬菌體ZK2的完整基因組序列上傳至 GenBank(OL409034)，并對(duì)全基因組進(jìn)行分析。結(jié)果表明ZK2的基因組類型為雙鏈DNA，長(zhǎng)度為40 946 bp，G+C的含量52.27%。共具有48個(gè)ORF；所有的ORF包括3種不同的起始密碼子，其中以ATG作為起始密碼子的為89.6% (43/48)，以GTG作為起始密碼子的為8.3% (4/48)，另外2.1% (1/48) 以TTG作為起始密碼子，所有的ORF的編碼方向均為正向。

利用NCBI BLAST程序?qū)κ删w的全基因組進(jìn)行比較分析(表3)，結(jié)果表明ZK2在全基因水平和肺炎克雷伯菌噬菌體SH-KP152226同源性最高(同源性92.57%、覆蓋率93%)，此外，肺炎克雷伯菌噬菌體IME304、066015、066013和vB_KpnP_IME205與ZK2也有90%以上的同源性，覆蓋率在90%以上。為進(jìn)一步確定噬菌體之間的親緣關(guān)系，選取在噬菌體進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守的DNA聚合酶繪制進(jìn)化樹(shù)，以大腸桿菌噬菌體T7作為外群，利用軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)繪制(圖5)。從圖中可以看出ZK2和肺炎克雷伯菌噬菌體SH-Kp 152410、066056以及P509親緣關(guān)系最近，其次是vB_KpnP_KpV767。

圖5 基于DNA聚合酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 噬菌體ZK2全基因組同源性比較

利用NCBI對(duì)ZK2的ORF功能進(jìn)行初步的預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)利用軟件對(duì)噬菌體ZK2 的基因功能繪制圖譜(圖6)。在已知的數(shù)據(jù)庫(kù)中，有30個(gè)ORF與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能的序列高度相似，表明這些蛋白可能具有相同的對(duì)應(yīng)功能，剩余的17個(gè)ORF注釋為假定蛋白，此外，ORF20與數(shù)據(jù)庫(kù)中任何病毒和原核生物的蛋白均沒(méi)有同源性。所有預(yù)測(cè)的功能蛋白中，主要參與核酸代謝和復(fù)制、裂解、DNA包裝以及結(jié)構(gòu)組成，其中預(yù)測(cè)為尾絲蛋白的ORF42與K47型肺炎克雷伯菌噬菌體SH-KP152226的解聚酶Depo42(QDF14644.1)有較高的同源性(98%)。同時(shí)，在預(yù)測(cè)分析過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)ZK2有與耐藥性或溶原性相關(guān)的基因序列，說(shuō)明ZK2具有作為肺炎克雷伯菌治療藥物的潛力。

圖6 噬菌體ZK2的蛋白功能圖譜

3 討論

目前，肺炎克雷伯菌耐藥問(wèn)題日漸嚴(yán)重，全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)在2014-2019年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告中指明肺炎克雷伯菌對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、亞胺培南和美羅培南的耐藥率在不斷升高，對(duì)臨床及獸用常見(jiàn)的頭孢曲松和頭孢噻肟的耐藥率也都高達(dá)30%以上[2]，逐年升高的耐藥率給肺炎克雷伯菌感染的治療帶來(lái)巨大威脅。面對(duì)多重耐藥的肺炎克雷伯菌，噬菌體療法已多次成功挽救患者，成為一種可行的抗生素替代藥物。

在本研究中，利用肺炎克雷伯菌KPN-1成功分離獲得一株具有高效裂解活性的新型噬菌體vB_KpnP_ZK2，對(duì)其生物學(xué)特性及基因組進(jìn)行分析。對(duì)ZK2敏感的肺炎克雷伯菌均為K47型肺炎克雷伯菌且大多對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，K47型是我國(guó)耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌中最常見(jiàn)的莢膜血清型之一，同時(shí)，與碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌相比，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的致死率更高[15]。從公共安全角度思考，阻止耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的傳播至關(guān)重要，而噬菌體作為高度特異性的高效殺菌制劑值得人們的關(guān)注。潛伏期是體現(xiàn)噬菌體特性最重要的生長(zhǎng)階段之一。一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示ZK2具有極短的潛伏期(2 min)和較短的裂解周期(50 min)，能夠快速吸附細(xì)菌細(xì)胞并裂解細(xì)菌，同時(shí)暴發(fā)量約為186 PFU/cell，體現(xiàn)出ZK2的高效性和良好的殺菌活性。ZK2的噬菌斑周圍形成半透明暈環(huán)，表明ZK2可能在裂解細(xì)菌的過(guò)程中形成具有清除細(xì)菌莢膜多糖作用的解聚酶。噬菌體的尾纖 (tail fiber) 或尾刺 (tail spikes) 蛋白通常表現(xiàn)出噬菌體的莢膜解聚酶活性[16]。本研究通過(guò)對(duì)ZK2全基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ORF42編碼噬菌體的尾絲蛋白，并且和已證實(shí)為噬菌體SH-KP152226解聚酶的Depo42有高度同源性，表明ORF42可能是ZK2的解聚酶。同時(shí)，ZK2的基因組中不存在與細(xì)菌毒力、抗生素耐藥以及溶原相關(guān)的基因，這些特點(diǎn)都表明 ZK2有作為耐碳青霉烯酶類K47型肺炎克雷伯菌抗菌制劑的潛力。

綜上所述，噬菌體vB_KpnP_ZK2 是一株具有高效裂解活性和高度特異性的短尾噬菌體，能夠有針對(duì)性的裂解K47型肺炎克雷伯菌，在噬斑周圍形成由于解聚酶作用而產(chǎn)生的半透明光暈，值得對(duì)其進(jìn)一步深入研究。本研究為使用噬菌體或噬菌體衍生蛋白治療耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌感染提供了參考依據(jù)。