涂海聲，邱嘉琦，徐 雅，張 靖，3，丘小惠，3，黃志海，3，李 鐘，徐 文，3*，韓 彬*

（1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006；3.廣州市中藥活性成分手性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃屬（Syzygium）植物具有重要的藥用和食用價(jià)值，代表性植物如蒲桃［1］、丁香［2］、海南蒲桃、烏墨［3］、滇南蒲桃等，其根皮莖葉果均可入藥或食用。已有研究表明，蒲桃屬植物中含有豐富的化學(xué)成分，如黃酮類［4］、萜類［5］、酚酸類［6］、間苯三酚類［7-8］等，且具有抗炎［9］、抗氧化［10］、抗菌［11］、降血糖［12-13］等廣泛的生物活性和藥理作用。

本屬植物短序蒲桃（Syzygium brachythyrsumMerr.et Perry），又名野冬青果、山蒲桃、麻栗果等，分布于云南、廣東、廣西等地［14］。其果實(shí)與莖葉以“野冬青果”之名收載于《云南中草藥》，具有止咳平喘的功效，主要用于寒性哮喘、哮喘等［15-16］，其作為特色民族中草藥在西南地區(qū)有廣泛的應(yīng)用。然而，目前尚未見短序蒲桃藥學(xué)相關(guān)的系統(tǒng)報(bào)道，其化學(xué)成分、生物活性、藥理作用等方面的研究仍為空白。

本課題組前期首次開展了短序蒲桃葉的化學(xué)成分和生物活性研究［17］，分離得到2 種新巖白菜素衍生物（圖1）和一系列巖白菜素衍生物，首次證實(shí)了蒲桃屬植物中富含大量的巖白菜素類衍生物。巖白菜素因具有良好的止咳作用，已作為上市藥物收錄于《中國藥典》［18］。近年來大量研究表明巖白菜素具有降糖、保肝等多種潛在的治療作用，以及抗炎、抗腫瘤、抗心律失常、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理活性［19-21］。但巖白菜素的生物利用度較低，為充分發(fā)揮其藥用價(jià)值，提高其生物利用度及生物活性，從天然來源或人工合成手段發(fā)現(xiàn)活性更高的巖白菜素衍生物成為新的研究熱點(diǎn)。

圖1 新化合物短序蒲桃酚A（化合物19，A）及短序蒲桃酚B（化合物18，B）的結(jié)構(gòu)圖［17］Fig.1 Structures of brachythol A（compound 19，A）and brachythol B（compound 18，B）［17］

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）已逐步發(fā)展成為一項(xiàng)常規(guī)分析技術(shù)，將LC-MS 尤其是高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于天然藥物化學(xué)研究，是對傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物分離技術(shù)的有力支撐。結(jié)合高效液相色譜強(qiáng)大的分離能力與質(zhì)譜技術(shù)的高靈敏度、高選擇性以及準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)雜化學(xué)成分導(dǎo)向分離和鑒定，有助于快速發(fā)現(xiàn)新穎和感興趣的天然產(chǎn)物。在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive-MS）技術(shù)［22-24］，通過采集模式化合物的高分辨質(zhì)譜信息，結(jié)合特征碎片離子信息和化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，并與前期分離的實(shí)體成分和SciFinder Scholar 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，對短序蒲桃葉中巖白菜素類等具有沒食子酸糖苷結(jié)構(gòu)的類似成分進(jìn)行快速分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)潛在新穎的巖白菜素衍生物成分，為短序蒲桃葉的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和后續(xù)開發(fā)奠定化學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Q-Exactive Plus hybrid Orbitrap 質(zhì)譜儀與Accela 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific）。LK/CSJ-20型超聲波清洗機(jī)（成都老肯科技股份有限公司），BT-125D 型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），Eppendorf-5424高速離心機(jī)（艾本德中國有限公司）。HPLC級甲醇、乙腈和甲酸（默克公司），實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水（Millipore公司，18.2 MΩ·cm）。

短序蒲桃葉（PT，采自云南省西雙版納傣族自治州勐?？h），經(jīng)暨南大學(xué)周光雄教授鑒定為桃金娘科蒲桃屬短序蒲桃（S. brachythyrsum）的莖和葉，樣本（編號：201903S）保存于廣東省中醫(yī)院中藥制劑室標(biāo)本庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 參考前期［25］的樣品處理方法，取少量短序蒲桃葉乙酸乙酯提取物浸膏100 mg，采用10 mL 80%甲醇超聲10 min，15 000 r/min 離心10 min，取上清液適量，過0.22 μm 微孔濾膜，待分析。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的對照品巖白菜素、去甲巖白菜素、短序蒲桃酚A、短序蒲桃酚B適量，加適量甲醇溶解稀釋后制得20μg/mL的單一對照品儲備液。

1.2.3 色譜參數(shù) 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速為200 μL/min。梯度洗脫：0～2 min，17% A；2～3.5 min，17%～23% A；3.5～6 min，23%～45% A；6～13 min，45%～90% A；13～15 min，90% A；15～16 min，90%～17%A；16～19 min，17%A。

1.2.4 質(zhì)譜參數(shù) 采用電噴霧離子源（ESI）負(fù)離子模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。噴霧電壓為-3 700 V；鞘氣為40 arb，輔助氣為15 arb，探針及毛細(xì)管溫度均為350 ℃，一級掃描分辨率為35 000，質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍為m/z130～2 000，二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA），分辨率為17 500，碰撞能量（NCE）為30%。質(zhì)譜采集為Xcalbur軟件（美國Thermo Fisher Scientific），用于記錄和整合色譜圖。質(zhì)譜裂解規(guī)律參考模擬軟件Mass Frontier 6.0（美國Thermo Fisher Science）。

2 結(jié)果與討論

2.1 短序蒲桃葉酚酸類成分的LC-MS分析

采用UHPLC-Q-Exactive-MS 負(fù)離子模式對短序蒲桃葉酚酸類部位進(jìn)行分析，其LCMS 總離子流圖如圖2。對圖2 中主要色譜峰進(jìn)行LC-MS鑒定，策略為：①根據(jù)前期化學(xué)成分研究獲取的主要模式成分進(jìn)行質(zhì)譜裂解規(guī)律研究，按照質(zhì)譜學(xué)一般規(guī)律結(jié)合Mass Frontier 6.0模擬軟件推測模式成分母核的裂解規(guī)律并總結(jié)特征碎片離子；②根據(jù)母離子Orbitrap 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合N 規(guī)律、同位素峰規(guī)律確定未知成分的元素組成；③根據(jù)母離子、多級質(zhì)譜信息和精確相對分子質(zhì)量，對短序蒲桃葉中的酚酸類成分進(jìn)行鑒定、歸類與分析；④將部分已知成分與前期已分離得到的實(shí)體化合物或文獻(xiàn)進(jìn)行對照。從短序蒲桃葉中共鑒定出54 種酚酸類成分，其保留時(shí)間、高分辨母離子信息、質(zhì)量偏差、多級質(zhì)譜信息及可能的結(jié)構(gòu)信息見表1。結(jié)果表明，短序蒲桃葉中巖白菜素衍生物等酚酸類成分主要在保留時(shí)間1～10 min范圍內(nèi)出峰。

表1 短序蒲桃葉中酚酸類成分的UHPLC-Q-Exactive-MS鑒定結(jié)果Table 1 Identified results of phenolic acids in PT by UHPLC-Q-Exactive-MS

（續(xù)表1）

圖2 短序蒲桃葉酚酸類提取物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of PT phenolics extract the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 巖白菜素模式成分的Orbitrap質(zhì)譜特征裂解規(guī)律研究

采用LC-Orbitrap MS 對特征碎片離子初步提取和分析，結(jié)果表明短序蒲桃葉中的酚酸類成分以巖白菜素、去甲巖白菜素和課題組分離得到的新化合物短序蒲桃酚B（Brachythol B）的衍生物為主，為此本研究對上述3 種模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行歸納，并總結(jié)其特征碎片和關(guān)鍵的中性丟失，為未知成分的快速發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

2.2.1 巖白菜素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 巖白菜素為沒食子酰葡萄糖類化合物，在Orbitrap 質(zhì)譜中形成m/z327.070 5（C14H15O9）的［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，其在二級質(zhì)譜中主要碎裂成m/z312.046 6、249.038 8、234.015 2、207.028 1、192.004 5 等碎片。根據(jù)其元素組成及相關(guān)文獻(xiàn)［26-27］，推測巖白菜素的質(zhì)譜裂解主要為發(fā)生在C環(huán)的內(nèi)部裂解，其中m/z249.038 8推測為發(fā)生在3，4位逆狄爾斯-阿爾德裂解（retro-Diels-Alder fragmentation，RDA）形成的3，4A 碎片離子（圖3），并進(jìn)一步在A 環(huán)的甲基發(fā)生均裂形成m/z234.015 2的自由基離子。由C環(huán)10b，4a位發(fā)生非典型RDA裂解導(dǎo)致C4H8O4（120 Da）殘基的中性丟失，形成m/z207.028 1 的10b，4aA 特征離子（圖3）。10b，4aA 特征離子在A 環(huán)進(jìn)一步均裂失去甲基形成m/z192.004 5的自由基離子。通過與前期分離的實(shí)體化合物進(jìn)行保留時(shí)間及質(zhì)譜信息比對，確定峰11為巖白菜素，峰5為其異構(gòu)體。

圖3 對照品巖白菜素的色譜圖（A）、二級質(zhì)譜（B）及其特征質(zhì)譜裂解規(guī)律（C）Fig.3 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of bergenin

以巖白菜素的上述5 個(gè)特征碎片離子為依據(jù)，可快速獲得具有巖白菜素相同母核的衍生物成分。經(jīng)對主要色譜峰的精確母離子和多級質(zhì)譜信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)化合物5、19、24、31、35、37、39、41 和43～52 均具有與巖白菜素相同的特征離子峰及相似的質(zhì)譜裂解途徑，關(guān)鍵的中性丟失和精確的元素組學(xué)信息表明它們?yōu)槎喾N酚酸取代的巖白菜素衍生物。以19 號峰為例，說明化合物的鑒定過程及其裂解規(guī)律。化合物19 的保留時(shí)間為4.6 min，在負(fù)離子模式下形成［M-H］-的準(zhǔn)分子離子峰m/z479.083 2，推測分子式為C21H20O13。其在二級質(zhì)譜中進(jìn)一步碎裂形成特征碎片離子m/z327.070 3、312.047 2、271.044 9、249.039 2、234.015 4、207.027 9、169.012 4。其中m/z327 為失去沒食子酰取代基生成的巖白菜素母核碎片，m/z312 為進(jìn)一步均裂脫去8 位甲氧基形成的碎片的碎片，3，4A 碎片以及巖白菜素特征碎片離子3，4A、10b，4aA 等。其主要碎裂途徑與上述巖白菜素基本一致，可判斷其為巖白菜素類衍生物。根據(jù)其元素組成及m/z169.012 4取代基碎片離子，可推測化合物19為沒食子酰取代的巖白菜素衍生物。通過與前期分離的實(shí)體化合物進(jìn)行保留時(shí)間及質(zhì)譜信息比對，確定其為新化合物短序蒲桃酚A。

通過對Orbitrap 負(fù)離子質(zhì)譜信息分析及與巖白菜素特征離子峰比對及篩選，發(fā)現(xiàn)潛在的巖白菜素類異構(gòu)體及衍生物共19 種，主要為沒食子酰（化合物19、31、37、39）、香豆酰（化合物45、46、49）、阿魏酰（化合物50、52）等取代的巖白菜素類衍生物。均為在蒲桃屬植物中首次發(fā)現(xiàn)。

2.2.2 去甲巖白菜素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 去甲巖白菜素（Norbergenin，峰7）為巖白菜素巖A 環(huán)上的甲氧基被羥基取代而成，因此兩者裂解方式相似。去甲巖白菜素在Orbitrap 質(zhì)譜中形成m/z313.055 2（C13H13O9）的［M-H］-峰，在二級質(zhì)譜中主要碎裂成m/z235.024 0、207.028 9、193.013 1特征離子。其中m/z235.024 0 和193.013 1 碎片的裂解途徑與巖白菜素一致，均為分別發(fā)生在C 環(huán)3，4 位和10b，4a位的RDA裂解形成3，4A碎片離子和10b，4aA特征離子（圖4）。此外，C環(huán)3，4位發(fā)生裂解后進(jìn)一步重排，形成m/z207.028 9 的特征離子。上述3 個(gè)特征碎片離子峰可作為去甲巖白菜素類衍生物的診斷離子，用于相關(guān)色譜峰的鑒定。

圖4 對照品去甲巖白菜素的色譜圖（A）、二級質(zhì)譜（B）及其特征質(zhì)譜裂解規(guī)律（C）Fig.4 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of norbergenin

以化合物30 為例，其保留時(shí)間為6.4 min。在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-為m/z433.076 0，通過精確質(zhì)譜測定推測其分子式為C20H18O11。分析二級質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)其主要碎片離子為m/z313.055 9、235.022 9、193.012 4，推測其分別為準(zhǔn)分子離子峰失去取代基生成的去甲巖白菜素母核碎片、3，4A 碎片及10b，4aA 碎片，初步判斷其為去甲巖白菜素類衍生物。根據(jù)元素組成推測其取代基為水楊酸基團(tuán)，該化合物為水楊酸去甲巖白菜素，通過SciFinder Scholar 數(shù)據(jù)庫搜索，推測其為潛在的新成分。

基于上述策略，發(fā)現(xiàn)潛在的去甲巖白菜素類異構(gòu)體（化合物3）及衍生物共11 種，主要為沒食子酰（化合物4、12、14、22）、阿魏酰（化合物40、42）及咖啡酰（化合物28）取代的去甲巖白菜素。均為從蒲桃屬植物中首次發(fā)現(xiàn)，其中化合物30（水楊酸去甲巖白菜素）為潛在的新化合物。

2.2.3 新型巖白菜素衍生物短序蒲桃酚B類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 短序蒲桃酚B（Brachythol B，峰18）為本實(shí)驗(yàn)室前期［17］首次從短序蒲桃葉酚酸類成分中發(fā)現(xiàn)并分離得到的新型巖白菜素類衍生物。短序蒲桃酚B 在結(jié)構(gòu)上為巖白菜素C 環(huán)2，3 位上羥基被六羥基聯(lián)苯甲?；鶊F(tuán)（HHDP）取代形成的新衍生物。在Orbitrap 一級質(zhì)譜中，短序蒲桃酚B 形成m/z629.076 7（C28H21O17）的［M-H］-峰，其進(jìn)一步碎裂成m/z300.997 6、275.018 8 2 個(gè)特征碎片離子。推測其質(zhì)譜裂解途徑主要為C 環(huán)內(nèi)部發(fā)生斷裂并重排，形成與HHDP 基團(tuán)相關(guān)的碎片離子（圖5），其中特征離子m/z275.018 8 為HHDP 基團(tuán)7'，7''位上酯基裂解后重排形成的碎片離子，而m/z300.997 6 為HHDP 殘基經(jīng)脫氫重排后形成的鞣花酸特征碎片離子，該碎片離子因具有高度的共軛而較為穩(wěn)定，故離子豐度最強(qiáng)。此外，C 環(huán)上的內(nèi)部裂解還形成了巖白菜素殘基碎片如m/z249.038 8和207.028 0，但離子豐度較低，可用于佐證巖白菜素的存在。而HHDP殘基碎片m/z300.997 6和275.018 8具有較高的離子豐度，且具有特異性，因此可作為短序蒲桃酚B 母核的特征碎片離子。由此將上述兩種離子作為短序蒲桃酚B 的診斷離子對其衍生物進(jìn)行篩選和鑒定分析。

圖5 對照品短序蒲桃酚B的色譜圖（A）、二級質(zhì)譜（B）及其特征質(zhì)譜裂解規(guī)律（C）Fig.5 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of brachythol B

化合物38 的保留時(shí)間為7.6 min。在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z659.086 6［M-H］-，分子式為C29H24O18。通過分析二級質(zhì)譜碎片發(fā)現(xiàn)其主要碎片離子m/z300.997 7、275.018 6 與上述短序蒲桃酚B 的母核特征峰一致，可初步判斷其為短序蒲桃酚B 類衍生物。根據(jù)其元素組成可確定化合物38為甲氧基短序蒲桃酚B，為潛在的新成分。

同理可推斷出峰26 和33 分別為短序蒲桃酚B 同分異構(gòu)體HHDP-巖白菜素和沒食子酰短序蒲桃酚B。同時(shí)篩選出3 個(gè)具有HHDP 結(jié)構(gòu)的沒食子酰-HHDP-葡萄糖苷衍生物（化合物2、9、10）。短序蒲桃酚B及其衍生物均為潛在的新化合物。

綜上所述，通過對Orbitrap 負(fù)離子質(zhì)譜信息進(jìn)行分析及與特征離子峰比對和篩選，從短序蒲桃葉酚酸類成分中推測出巖白菜素類衍生物34 種，非巖白菜素類化合物4 種，均為首次在蒲桃屬植物中發(fā)現(xiàn)。其中9種巖白菜素類衍生物為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物，1種為以短序蒲桃酚B為代表的新型巖白菜素類衍生物構(gòu)型。

2.3 其他成分

除巖白菜素類化合物外，本研究還從短序蒲桃葉酚酸類成分中鑒定出17 種黃酮及其他酚酸類成分，并發(fā)現(xiàn)1種新化合物沒食子酰二甲基沒食子酸（Galloyl-O-di-methylgallate）。

2.4 討 論

本文采用UHPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)對短序蒲桃葉中巖白菜素類化合物進(jìn)行快速分析，從中發(fā)現(xiàn)或推測出30余種巖白菜素及其衍生物，包括多種潛在的新型巖白菜素類衍生物構(gòu)型，并總結(jié)了巖白菜素類、去甲巖白菜素類及新構(gòu)型短序蒲桃酚B類3種巖白菜素化合物構(gòu)型的質(zhì)譜裂解規(guī)律，豐富了巖白菜素類化合物的天然來源，為其快速鑒定及進(jìn)一步的成分分離、結(jié)構(gòu)修飾及活性篩選提供了參考?；衔锷锘钚耘c其取代基團(tuán)息息相關(guān)，Kashima等［19］研究表明，當(dāng)巖白菜素取代基中含有苯甲?；虮郊柞；Y(jié)構(gòu)時(shí)具有較強(qiáng)的生物活性。本研究首次發(fā)現(xiàn)的多種短序蒲桃酚B衍生物具有六羥基聯(lián)苯甲酰基團(tuán)（HHDP），且前期研究［17］也證實(shí)短序蒲桃酚B具有較強(qiáng)的抗炎及抗氧化活性，推測這些成分具有良好的生物活性，對其進(jìn)行深入的化學(xué)成分研究、活性評價(jià)和構(gòu)型關(guān)系研究具有重要意義。

本研究僅對少數(shù)推測出的化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品比對，大量的異構(gòu)體成分無法獲得結(jié)構(gòu)確證，存在一定的局限性?；赨HPLC-Q-Exactive-MS 技術(shù)，后續(xù)擬開展短序蒲桃葉的導(dǎo)向分離，進(jìn)一步明確短序蒲桃葉的物質(zhì)基礎(chǔ)，為該民族中草藥的開發(fā)和藥理藥效學(xué)評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿軌道阱質(zhì)譜分析了特色民族藥物短序蒲桃葉中的酚酸類成分，通過條件優(yōu)化，短序蒲桃葉中的巖白菜素類成分得到較好的分離和質(zhì)譜響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短序蒲桃葉中巖白菜素類成分在負(fù)離子模式下易形成［M-H］-母離子峰。根據(jù)獲得的母離子、多級質(zhì)譜信息和精確分子量，對比對照品的質(zhì)譜信息，并參考已有文獻(xiàn)，從短序蒲桃葉酚酸類成分中推測出54種成分，其中38個(gè)成分為首次從蒲桃屬植物中發(fā)現(xiàn)（包括34種巖白菜素類化合物、4種非巖白菜素類化合物），除已報(bào)道的巖白菜素類成分外，還發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)以短序蒲桃酚B 為基本母核的潛在新巖白菜素衍生物。上述發(fā)現(xiàn)為短序蒲桃葉的化學(xué)成分及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步研究巖白菜素類化合物的生物活性及其構(gòu)效關(guān)系提供了新的依據(jù)。