陳鴻煒，農(nóng)艷瑛，朱一帆，梁運(yùn)嘯，周海琳，張嘉豪，張淇淞*

（1.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530011；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）又稱大腸癌，是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤。癌癥是世界各國的主要死亡原因，而CRC 在世界癌癥的致死率為9.4%，是癌癥死亡的主要原因［1］。CRC 的早期發(fā)現(xiàn)對于患者的治療和愈后有著很大影響，CRC早期患者5年以上生存率達(dá)98%，而終末期患者5年以上的生存率則不足10%［2］，且早期患者的預(yù)后良好。因此，CRC 的早期診斷和發(fā)現(xiàn)可有效降低死亡率和提高生存率。然而，由于CRC 早期缺乏典型臨床表征且診斷困難，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為癌癥中晚期。目前，CRC 的常規(guī)診斷方法分為侵入性和非侵入性兩種。前者包括柔性乙狀結(jié)腸鏡和結(jié)腸鏡檢查，后者包括糞便、血液檢查以及放射學(xué)檢查［3］?，F(xiàn)有的非侵入性檢查診斷雖較為簡便，且患者依從性好，但敏感性和特異性較低；侵入性的腸鏡檢查為結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度高，但患者耐受性差，并發(fā)穿孔和出血等風(fēng)險(xiǎn)，且檢查費(fèi)用和技術(shù)要求高，大規(guī)模應(yīng)用難以實(shí)現(xiàn)［4］。因此，急需尋找一種診斷性能高、微創(chuàng)且便捷的標(biāo)志物用于CRC診斷。

脂質(zhì)是一類分布廣泛的內(nèi)源性代謝物，具有許多重要的生理功能。脂質(zhì)代謝途徑的改變在許多常見疾病的預(yù)測、預(yù)后和診斷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其在疾病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用在許多人類疾病中得到廣泛研究［5］。脂類物質(zhì)也被證實(shí)參與多種癌癥的發(fā)生與惡化［6-7］。近年來，研究證實(shí)CRC與脂質(zhì)代謝異常存在密切關(guān)系［8-9］。脂質(zhì)組學(xué)是研究生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝的一種有效技術(shù)，同時在腫瘤標(biāo)志物的探索中表現(xiàn)出巨大潛力，近期已成為研究熱點(diǎn)［10］。通過CRC 組織脂質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，溶血肝磷脂酰膽堿（LPCs）和磷脂酰膽堿（PCs）是與CRC 產(chǎn)生和惡化最密切相關(guān)的生物標(biāo)志物［11-12］。然而，目前尚無采用血清脂質(zhì)組學(xué)探索CRC生物標(biāo)志物的研究報(bào)道。

超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜（UHPLC-HRMS）以其高通量、高選擇性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)成為脂質(zhì)組學(xué)中最常用的分析技術(shù)。本文利用高靈敏度和高分辨率的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q Exactive-Orbitrap MS）進(jìn)行CRC患者的血清非靶向脂質(zhì)組學(xué)研究，通過對比發(fā)現(xiàn)健康人和CRC 患者的脂質(zhì)代謝輪廓差異，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對其進(jìn)行篩選和評價，進(jìn)而獲得具有良好診斷效能的腫瘤標(biāo)志物，為CRC的臨床診斷提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜儀-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜（美國賽默飛世爾科技公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德公司）；密理博超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；渦旋器（上海精科儀器有限公司）；超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）；制冰機(jī)（意大利Scotsman公司）。

棕櫚酰乙醇胺、棕櫚酸、鞘氨醇標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma-Aldrich 公司。甲醇、二氯甲烷、異丙醇、乙腈、甲酸銨、甲酸（色譜純，美國默克公司）；超純水（美國密理博公司）。

1.2 樣本來源及處理

CRC患者和健康人（NR）血清樣品均采集于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，且研究方案經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：KY-DZX-202008），所有受試者均簽署知情同意書。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)納入CRC 患者（n=50）：（1）病理診斷為結(jié)直腸癌；（2）術(shù)前未接受手術(shù)、化療、放療；（3）無嚴(yán)重代謝性、血液病或惡性腫瘤。健康受試者（n=50）為經(jīng)結(jié)腸鏡檢查證實(shí)無任何腸道腫瘤且無嚴(yán)重代謝性、血液病或惡性腫瘤的健康人群。術(shù)前受試者禁食8 h后，通過促凝采血管采集全血樣本，在室溫下靜置1 h后，以5 000 r/min在4 ℃下離心10 min，分離上層血清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，80 ℃下冷凍儲存?zhèn)溆谩?/p>

血清樣品制備：將超低溫儲存的血清置于冰上解凍，吸取50μL血清，加入500μL預(yù)冷卻的二氯甲烷-甲醇溶液（3∶1，體積比），渦旋5 min 后置于冰浴下10 min，以13 000 r/min 在4 ℃下離心10 min，離心管中的溶液分成3 層。取中層的二氯甲烷溶液300μL，在真空下干燥。干燥樣品用600μL 乙腈-異丙醇溶液（1∶1，體積比）復(fù)溶，渦旋2 min 后，于冰浴條件下超聲5 min。渦旋1 min 后將混合物在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液用于血清脂質(zhì)分析。在正式進(jìn)樣前，精密吸取已制備的各待測血清樣品5μL混合，作為質(zhì)量控制樣品（QC），用于評價分析系統(tǒng)和方法的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流速為0.3 mL/min；流動相：A 為體積比60∶40 的乙腈-水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸銨），B 相為體積比90∶10的異丙醇-乙腈溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸銨）。梯度洗脫程序?yàn)椋?.0～4.0 min，70%～40%A；4.0～9.0 min，40%～0%A；9.0～15 min，0%A；15～18 min，0%～70%A；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI 源），輔助氣流速為13 arb，鞘氣流速為40μL/min，毛細(xì)管溫度為320 ℃，霧化氣溫度為420 ℃，噴霧電壓為3.50 kV（正離子）或2.80 kV（負(fù)離子）；數(shù)據(jù)采集模式為Full Scan+ddMS2；階梯式碰撞能量（10、20、40 eV）；一級掃描范圍為m/z100～1 200，一級和二級質(zhì)譜的分辨率分別為70 000和17 500。

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理及分析

（1）將2 組樣品的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入代謝組數(shù)據(jù)處理軟件Compound Discovery 3.1（Thermo Scientific，F(xiàn)remont，CA，USA）中，提取脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)（包括離子特征、保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度），并應(yīng)用QC數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊和歸一化處理。（2）根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Student’t檢驗(yàn)進(jìn)行脂質(zhì)特征的組間差異分析，P＜0.05則認(rèn)為該特征組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）將已提取數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Simca-P 14.0 軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），并通過200 次置換檢驗(yàn)進(jìn)一步考察OPLS-DA 模型的可靠性和適用性，避免數(shù)據(jù)分析的過度擬合。結(jié)合倍數(shù)變化小于0.67或大于1.5且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異脂質(zhì)特征。（4）根據(jù)精確分子量和保留時間誤差（10 ppm 和0.2 min），以及自帶數(shù)據(jù)庫mzCloud 和LipidBlast 鑒定脂質(zhì)標(biāo)志物。（5）采用MetaboAnalyst 5.0軟件對組間差異脂質(zhì)進(jìn)行受試者工作特征曲線（ROC）分析，以探索CRC的診斷脂質(zhì)標(biāo)志物。

1.5 研究對象的基線特征

本研究的受試者共有100名，NR和CRC臨床血清樣本各50例?；镜呐R床信息如表1所示，兩組間的性別和年齡構(gòu)成無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CRC 患者病變部位以結(jié)腸和直腸進(jìn)行分類，其分化程度和腫瘤分期用于評估CRC的嚴(yán)重程度。

表1 受試者的基本臨床信息Table 1 Basic clinical informations of subjects

2 結(jié)果與討論

2.1 主成分分析

通過建立PCA 模型進(jìn)行分析，考察儀器系統(tǒng)和檢測方法的穩(wěn)定性及樣本的分布趨勢。由PCA 三維得分圖（圖1A、1B）可知，QC 樣本在2 種ESI模式下均緊密聚集，表明其脂質(zhì)組學(xué)特征未發(fā)生漂移，說明分析系統(tǒng)在批量分析過程中具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，滿足脂質(zhì)組學(xué)分析的要求。NR 組和CRC組分別位于得分圖兩側(cè)，組間區(qū)分較為明顯，說明兩組的血清脂質(zhì)譜存在差異。同時，大多數(shù)樣本在95%的置信區(qū)間內(nèi)，少數(shù)超出95%置信區(qū)間的樣本呈現(xiàn)較為離散趨勢，可能由于存在較大的個體差異。提取QC 組中各脂質(zhì)特征的峰面積，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)脂質(zhì)特征峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于20%，表明整個測試過程中分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。

2.2 正交偏最小二乘判別分析

為了更清楚地辨別出NR 與CRC 組間的血清脂質(zhì)譜差異，在PCA 分析的基礎(chǔ)上基于所有檢測到的脂質(zhì)特征構(gòu)建OPLS-DA 模型進(jìn)行分析，以篩選生物標(biāo)志物。相對于PCA 分析，由OPLS-DA 分析的三維得分圖（圖1C、1D）可以看出NR 組和CRC 組的組間區(qū)分更明顯，表明兩者血清脂質(zhì)譜差異顯著。正離子模式下OPLS-DA 模型的R2X、R2Y、Q2 值分別為0.488、0.980、0.947；負(fù)離子模式下分別為0.549、0.923、0.770，表明所建立的模型對數(shù)據(jù)描述和預(yù)測能力良好。采用200次置換檢驗(yàn)進(jìn)一步考察了OPLS-DA 模型的可靠性，正離子模式下置換檢驗(yàn)主要參數(shù)R2、Q2、P值分別為0.784、-0.361 和0.000（圖1E），負(fù)離子模式下3 個參數(shù)值分別為0.685、-0.358 和0.000（圖1F），且直線初始點(diǎn)均高于樣品點(diǎn)，提示該分析模型不存在過擬合，應(yīng)用合理。

圖1 健康對照組（NR）和結(jié)直腸癌組（CRC）血清脂質(zhì)組學(xué)的PCA三維得分圖（A、B）、OPLS-DA三維得分圖（C、D）以及OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)圖（E、F）Fig.1 PCA 3D score plots（A，B），OPLS-DA 3D score plots（C，D）and permutations test for the OPLS-DA model（E，F(xiàn)）of serum lipids in normal control group（NR）and colorectal cancer group（CRC）A，C and E：in ESI+mode；B，D and F：in ESI- mode

2.3 生物標(biāo)志物的篩選與診斷效能評價

根據(jù)兩組間的變化倍數(shù)和差異分析統(tǒng)計(jì)值，以倍數(shù)變化＞1.5或＜0.67，且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選組間差異脂質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)155 種差異脂質(zhì)（ESI+、ESI-模式下分別有18 種和137 種）。其中，DAG、TAG、PC、LPC、LPE、SM、PE、PI、Cer、FA 的數(shù)量構(gòu)成比例分別為1.94%、27.10%、30.32%、9.03%、1.29%、9.68%、3.87%、2.58%、7.74%、6.45%（圖2）。PC 和TAG 的總構(gòu)成比高達(dá)57.42%，表明PC 和TAG 的代謝紊亂可能與CRC 的癌變機(jī)制有關(guān)。另外，相對于NR組，大多數(shù)差異脂質(zhì)在CRC組血清中表達(dá)均呈顯著下調(diào)，只有9個差異脂質(zhì)在CRC組血清中表達(dá)呈顯著上調(diào)。

圖2 不同類別差異脂質(zhì)的構(gòu)成分布Fig.2 Component distribution of differential lipids DAG：diacylglycerol（甘油二酯）；TAG：triacylglycerol（甘油三酯）；PC：phosphatidylcholine（磷脂酰膽堿）；LPC：lysophosphatidylcholine（溶血磷脂酰膽堿）；LPE：lysophosphatidylethanolamine（溶血磷脂酰乙醇胺）；SM：sphingomyelin（鞘磷脂）；PE：phosphatidylethanolamine（磷脂酰乙醇胺）；PI：phosphatidylinositol（磷脂酰肌醇）；Cer：ceramide（神經(jīng)酰胺）；FA：fatty acid（脂肪酸）

基于以上篩選的差異脂質(zhì)，采用受試者工作特征曲線（ROC）的曲線下面積（AUC）值評估其對CRC 的診斷能力，根據(jù)AUC ＞0.80 篩選CRC 潛在診斷脂質(zhì)標(biāo)志物。在ROC 分析中，發(fā)現(xiàn)9 個潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物具有良好的CRC 診斷能力（AUC ＞0.80），包括棕櫚酰乙醇胺、棕櫚酸、鞘氨醇、SM d40∶3、SM d36∶0、TAG 58∶1、PC 34∶2、PC 36∶6 和PC 38∶7，其AUC 值分別為1.00、0.86、0.81、0.85、0.81、0.89、0.81、0.87 和0.83。其中，棕櫚酰乙醇胺具有最高的AUC 值（為1.00），表明其對CRC的診斷效能突出，而SM d36∶0、PC34∶2和鞘氨醇的AUC 值則相對較低，均為0.81。mzCloud 和LipidBlast 脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配的鑒定結(jié)果如圖3 所示，鑒定效果良好。總體上，上述9 種差異脂質(zhì)對CRC 均呈現(xiàn)良好的診斷效能，可作為CRC的候選診斷標(biāo)志物。

圖3 9種高診斷效能差異脂質(zhì)的鑒定過程Fig.3 Identification of 9 differential lipids with high diagnostic ability

為進(jìn)一步對以上9種差異脂質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)，采用脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的母離子及其碎裂信息與數(shù)據(jù)庫一級和二級質(zhì)譜圖信息進(jìn)行匹配，同時比較其與實(shí)際樣品保留時間的誤差。由于目前缺乏SM d40∶3、SM d36∶0、TAG 58∶1、PC 34∶2、PC 36∶6、PC 38∶7商品化的脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，因此只對棕櫚酸乙醇胺、棕櫚酸、鞘氨醇3種脂質(zhì)進(jìn)行LC-MS/MS驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品與數(shù)據(jù)庫的一級和二級質(zhì)譜圖匹配結(jié)果良好，同時其與樣品保留時間的誤差均小于0.1 min（圖3、4），因此，上述3 種差異脂質(zhì)可作為CRC診斷的潛在血清脂質(zhì)標(biāo)志物。

通過對以上9 種差異脂質(zhì)的QC 歸一化峰強(qiáng)度進(jìn)行比較，進(jìn)一步明確其在組間的水平變化趨勢。結(jié)果表明，6 種差異脂質(zhì)（包括棕櫚酸乙醇胺、棕櫚酸、SM d40∶3、PC 34∶2、SM d36∶0、鞘氨醇）在CRC 組中水平顯著上調(diào)，3種差異脂質(zhì)（包括TAG 58∶1、PC 36∶6、PC 38∶7）在CRC 組中顯著下調(diào)，表明對CRC 呈現(xiàn)高診斷效能的潛在標(biāo)志物主要是在CRC 血清中明顯上調(diào)的差異脂質(zhì)，且主要屬于脂肪酸類、磷脂酰膽堿類和鞘磷脂類脂質(zhì)成分（圖5）。

圖4 3種高診斷效能差異脂質(zhì)的LC-MS/MS驗(yàn)證Fig.4 Identification of 3 differential lipids with high diagnostic ability by LC-MS/MS method

圖5 9種高診斷效能差異脂質(zhì)的組間變化趨勢Fig.5 Change trend of nine differential lipids with high diagnostic ability the relative concentration of differential lipids was presented as mean±SEM

2.4 討 論

本研究對NR 和CRC 患者的血清樣本進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，共發(fā)現(xiàn)155種差異脂質(zhì)，其中9種差異脂質(zhì)對CRC 具有良好的診斷效能（AUC ＞0.80），可作為CRC 的潛在診斷標(biāo)志物。此外，在差異脂質(zhì)中，PC和TAG占比高達(dá)57.42%，提示這兩類脂質(zhì)代謝紊亂可能與CRC的形成有關(guān)。

雖然部分研究已報(bào)道CRC 患者血漿和組織中潛在的脂質(zhì)標(biāo)志物和脂質(zhì)代謝紊亂。然而，大部分脂質(zhì)標(biāo)志物均未被證實(shí)，且通過大樣本血清脂質(zhì)組學(xué)探索CRC 診斷生物標(biāo)志物的研究相對較少。磷脂是脂質(zhì)的主要成分，參與細(xì)胞膜的生成、代謝和細(xì)胞信號傳導(dǎo)。磷脂的失調(diào)和腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)［13-14］，也是報(bào)道最多的針對CRC 診斷的潛在脂質(zhì)標(biāo)志物［15-17］。Shen等［11］通過分析25例CRC 患者和10例NR 對照者血漿中的脂質(zhì)種類，共發(fā)現(xiàn)64種差異脂質(zhì)，其中PG（34∶0）、SM（42∶2）、Cer（44∶5）、LPC（18∶3）、LPC（18∶2）、PE（O-36∶3）、PE（O-38∶3）和SM（38∶8）被認(rèn)為是CRC 的潛在脂質(zhì)標(biāo)志物，其大部分為磷脂類脂質(zhì)。同時，PC 已被證實(shí)在CRC 細(xì)胞系中顯著上調(diào)［13］，然而，其降解產(chǎn)物L(fēng)PC 卻在CRC 患者血漿中顯著下調(diào)，且與體重減少密切相關(guān)［18］。本研究中，磷脂也是主要的差異脂質(zhì)，在所有差異脂質(zhì)中，PC 占比最高為30.32%，且其占比為潛在生物標(biāo)記物的5/9，對CRC 具有良好的診斷性能（AUC ＞0.80）。因此，磷脂可作為CRC 的潛在生物標(biāo)志物。此外，磷脂還具有一定的抗腫瘤活性，但其在單一治療研究中的治療潛力較低，仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)磷脂在CRC化療中的作用與優(yōu)勢［19］。

TAG 是細(xì)胞膜脂質(zhì)合成所必需的，也是目前公認(rèn)的許多癌癥的標(biāo)志物，它不僅與癌細(xì)胞的病理生理特征有關(guān)，而且參與腫瘤的產(chǎn)生和惡化［20］。目前，有關(guān)血中TAG水平與CRC關(guān)系的研究結(jié)果仍存在爭議。據(jù)報(bào)道，血漿或血清的TAG 水平升高與結(jié)直腸腺瘤（CRC 重要的癌前病變）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［21-22］，而部分研究證明血清或血漿的TAG水平與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并無明顯關(guān)聯(lián)［23-24］。另外，CRC組織中TAG 54∶0 的含量相對于良性腺瘤組織顯著下調(diào)，而相對于正常組織則顯著上調(diào)［25］。晚期結(jié)直腸癌患者血漿中的TAG 水平較早期結(jié)直腸癌患者升高［20］。本研究發(fā)現(xiàn)差異TAG 對CRC 和NR 組展現(xiàn)良好的區(qū)分性能，且其占所有鑒別差異脂質(zhì)的27.10%，也是主要的紊亂脂質(zhì)成分（圖2）。此外，脂肪酸和鞘脂也是CRC 常見的脂類標(biāo)記物。蠟酸（26∶0）［26］和長鏈脂肪酸［27］只在CRC 血清中存在，其可區(qū)分早期和晚期癌癥［28］，或作為CRC 生存的預(yù)測指標(biāo)［29］。文獻(xiàn)顯示，一種質(zhì)荷比為742.988 69的鞘磷脂可作為監(jiān)測晚期CRC 癌的血漿候選生物標(biāo)志物［30］，本研究也觀察到類似的結(jié)果，脂肪酸和鞘脂占所有差異脂質(zhì)的23.87%，且3 種鞘脂和2 種脂肪酸類脂質(zhì)對CRC 表現(xiàn)良好的診斷效能。說明TAG、FA 和SM 亦可作為CRC臨床診斷的潛在脂質(zhì)標(biāo)志物。

3 結(jié) 論

CRC 的診斷和治療是降低其死亡率的有效途徑，脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷標(biāo)志物和機(jī)制探索研究中表現(xiàn)出巨大潛力。本研究利用UHPLC-Q Exactive-Orbitrap MS 技術(shù)的高通量和高分辨率優(yōu)勢，結(jié)合單因素和多元統(tǒng)計(jì)分析揭示CRC 與NR 組的血清脂質(zhì)譜差異，篩選獲得155 種組間差異脂質(zhì)，且以PC 和TAG 為主，表明其代謝在CRC 中出現(xiàn)明顯紊亂，可能參與CRC 的形成。此外，ROC 分析發(fā)現(xiàn)共有9種差異脂質(zhì)對CRC 具有良好的診斷效能，可以選擇其進(jìn)行聯(lián)合使用作為CRC 的診斷標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)為深入研究CRC的脂質(zhì)特征提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對于CRC的臨床篩查和診斷具有較高的參考價值。但由于臨床樣本數(shù)量和脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的限制，將本發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。