李秀君，劉寶利，朱翠敏（.河北省唐山市工人醫(yī)院病理科，河北 唐山 063003；.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 承德 06700）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌的亞型之一，占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%，多數(shù)PTC可被治愈，仍有部分患者治療后發(fā)生復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，影響其預(yù)后。EMT是PTC發(fā)展的關(guān)鍵步驟，因此研究PTC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義[1-2]。?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine up-regulated gene 1，TUG1）為lncRNA之一，有研究[3]發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1在PTC組織與細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，上調(diào)lncRNA TUG1表達(dá)可顯著促進(jìn)PTC細(xì)胞增殖與侵襲，而下調(diào)lncRNA TUG1可明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。lncRNA通過(guò)作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA通過(guò)結(jié)合miRNA影響疾病進(jìn)展，lncRNATUG1通過(guò)結(jié)合miR-524-5p來(lái)介導(dǎo)無(wú)遠(yuǎn)端同源盒1（distalless homeobox 1，DLX1）基因的表達(dá)從而調(diào)控口腔鱗癌的發(fā)展[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，miR-524-5p在PTC組織與細(xì)胞中低表達(dá)，可影響PTC細(xì)胞活力、遷移、侵襲和凋亡。鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因與PTC的發(fā)展密切相關(guān)，其基因突變與PTC患者的臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)[6]。有研究[7]表明，miR-524-5p通過(guò)靶向BRAF和ERK2抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。lncRNA TUG1是否通過(guò)調(diào)控miR-524-5p/BRAF軸影響PTC發(fā)生發(fā)展尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將探索lncRNA TUG1對(duì)PTC細(xì)胞增殖、凋亡、EMT進(jìn)程的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞及主要試劑

選擇2019年5月至2021年4月間在河北省唐山市工人醫(yī)院手術(shù)切除的35例PTC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。患者術(shù)前未經(jīng)任何放化療，年齡29～72歲，平均年齡（60.10±9.30）歲，經(jīng)病理診斷均為PTC。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：GRYYLL-KJ2019-K43），所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

人PTC細(xì)胞TPC-1、BHP10-3、K1、SW-1736及人正常甲狀腺上皮細(xì)胞Nthyori 3-1均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，RPMI 1640培養(yǎng)基（SH30809.01）、胎牛血清（SH30068.03）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。抑制lncRNA TUG1表達(dá)質(zhì)粒（si-TUG1）及對(duì)照質(zhì)粒（si-NC）、miR-524-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（miR-524-5p mimic）及對(duì)照質(zhì)粒（miR-NC）、抑制miR-524-5p表達(dá)質(zhì)粒（miR-524-5p inhibitor）及對(duì)照質(zhì)粒（NC inhibitor）、BRAF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA BRAF）及對(duì)照質(zhì)粒（pcDNA），以及miR-524-5p、lncRNA TUG1及 U6、GAPDH 引物均購(gòu)自GenePharma公司。TRIzol試劑（R0016）、BeyoRTTMⅡcDNA第一鏈合成試劑盒（D7168M）、BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（D7260）、CCK-8試劑盒（C0038）均購(gòu)自Beyotime公司，Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000008）購(gòu)自Invitrogen公司，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（ZY130595）購(gòu)自澤葉生物公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（CA1020）購(gòu)自北京索萊寶公司，兔抗人BRAF（9433）、PCNA（13110）、Caspase-3（14220）抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，兔抗E-cadherin（ab76319） 、 N-cadherin（ab245827） 、 vimentin（ab92547）抗體及HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（ab6721）均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

TPC-1、BHP10-3、K1、SW1736、Nthyori 3-1細(xì)胞均用含10%的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

將TPC-1細(xì)胞分為對(duì)照組、si-NC組、si-TUG1組、miR-NC組、miR-524-5p mimic組、si-TUG1+miR-524-5p inhibitor組、si-TUG1+NC inhibitor組、miR-524-5p mimic+pcDNA組和miR-524-5p mimic+pcDNA BRAF組，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合度至約70%時(shí)，按上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換新的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行鑒定轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qPCR檢測(cè)PTC組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUG1、miR-524-5p表達(dá)

TRIzol試劑提取PTC組織及細(xì)胞總RNA，BeyoRTTMⅡcDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA后，采用SYBR Green法試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。qPCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s、65℃45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。以GAPDH、U6為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算 lncRNA TUG1、miR-524-5p的相對(duì)表達(dá)量。lncRNA TUG1的正向引物為5′-CTATACTCAGCTTCAGTGTT-3′，反向引物為5′-TACTGTATGGCCACCACTCC-3′；GAPDH的正向引物為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物為5′-AGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′；miR-524-5p的正向引物為5′-CTACAAAGGGAA GCACTT-3′，反向引物為5′-GAACATGTCTGCG TATCTC-3′；U6的正向引物為 5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′，反向引物為 5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-524-5p與lncRNATUG1、BRAF之間的靶向關(guān)系

數(shù)據(jù)庫(kù)（Microrna、StarBase和RegRNA）預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-524-5p與lncRNA TUG1、BRAF之間有結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合區(qū)域序列，分別構(gòu)建TUG1-WT、BRAF-WT野生型熒光素酶質(zhì)粒與TUG1-MUT、BRAF-MUT突變熒光素酶質(zhì)粒，將構(gòu)建質(zhì)粒分別和miR-NC、miR-524-5p mimic共轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

各組轉(zhuǎn)染后TPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以每孔2×104個(gè)接種至96孔板中，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)每孔加入10 μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)450 nm處光密度（D）值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 FCM法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h的各組TPC-1細(xì)胞，制備成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 WB法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TPC-1細(xì)胞中BRAF、PCNA、Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)的影響

收集轉(zhuǎn)染后的各組TPC-1細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白用10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉后，分別加入BRAF、PCNA、Caspase-3、E-cadherin（均 1∶1 000 稀釋?zhuān)?、N-cadherin（1∶1 500稀釋?zhuān)imentin（1∶1 000 稀釋?zhuān)┮豢梗?℃處理過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1 500稀釋?zhuān)覝靥幚? h，加入ECL顯色液顯色，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；GraphPad Prism 8.0繪制生長(zhǎng)曲線。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA TUG1在PTC組織及細(xì)胞中呈明顯高表達(dá)

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNATUG1在PTC組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（2.49±0.29vs1.00±0.11，P＜0.05）。與人正常甲狀腺上皮Nthyori 3-1細(xì)胞比較，lncRNA TUG1 在 TPC-1（3.48±0.41vs1.00±0.02）、BHP10-3（2.53±0.32vs1.00±0.02）、K1（1.98±0.24vs1.00±0.02）、SW-1736（2.03±0.27vs1.00±0.02）細(xì)胞中表達(dá)明顯處于高水平（均P＜0.05），其中以TPC-1細(xì)胞中表達(dá)水平最高，故選擇TPC-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 敲減lncRNATUG1表達(dá)可抑制TPC-1細(xì)胞增殖及EMT進(jìn)程而促進(jìn)其凋亡

qPCR結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TUG1組TPC-1細(xì)胞lncRNA TUG1表達(dá)水平顯著降低（0.37±0.05vs0.98±0.10，P＜0.05），說(shuō)明轉(zhuǎn)染si-TUG1有效地敲減了PTC-1細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平。CCK-8（圖1A）、FCM（圖1B）及WB（圖1C）法結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TUG1組TPC-1細(xì)胞增殖能力、PCNA、N-cadherin、vimentin等蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）及其凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、E-cadherin的表達(dá)水平均顯著升高（均P＜0.05），對(duì)照組與si-NC組之間上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，敲減lncRNA TUG1表達(dá)后能抑制TPC-1細(xì)胞增殖及EMT進(jìn)程，并促進(jìn)其凋亡。

2.3 lncRNATUG1靶向miR-524-5p且抑制其表達(dá)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示lncRNA TUG1與miR-524-5p有結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖2B）顯示，與TUG1-WT+miR-NC共轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞比較，TUG1-WT+miR-524-5p mimic共轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞其相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；qPCR 結(jié)果顯示，敲減 lncRNA TUG1表達(dá)后，miR-524-5p表達(dá)水平顯著升高（圖2C，P＜0.05）。上述結(jié)果表明，lncRNA TUG1靶向miR-524-5p且抑制其表達(dá)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-524-5p能抑制TPC-1細(xì)胞增殖和EMT進(jìn)程而促進(jìn)其凋亡

qPCR結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-524-5p mimic組TPC-1細(xì)胞miR-524-5p表達(dá)水平顯著升高（2.36±0.24vs1.05±0.15，P＜0.05），說(shuō) 明轉(zhuǎn)染miR-524-5pmimic后，TPC-1細(xì)胞過(guò)表達(dá)了miR-524-5p。CCK-8（圖3A）、FCM（圖3B）及WB法（圖 3C）檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-524-5p mimic組 TPC-1細(xì)胞增殖與 PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05），細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、E-cadherin等表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05），對(duì)照組與miR-NC組之間上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-524-5p能抑制TPC-1細(xì)胞增殖、EMT進(jìn)程，促進(jìn)其凋亡。

2.5 抑制miR-524-5p能逆轉(zhuǎn)敲減TUG1表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT進(jìn)程的影響

CCK-8（圖 4A）、FCM（圖 4B）及 WB 法（圖4C）檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-TUG1+NC inhibitor組比較，si-TUG1+miR-524-5p inhibitor組TPC-1細(xì)胞增殖與PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05），細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05），si-TUG1組與si-TUG1+NC inhibitor組之間上述指標(biāo)比較差異不顯著（均P＞0.05）。上述結(jié)果表明，抑制miR-524-5p能逆轉(zhuǎn)敲減lncRNA TUG1表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT進(jìn)程的影響。

2.6 miR-524-5p靶向BRAF并抑制其表達(dá)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示BRAF基因與miR-524-5p有靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與BRAF-WT與miR-NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，BRAF-WT與miR-524-5p mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（圖5B，P＜0.05）；WB法結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，過(guò)表達(dá)miR-524-5p后，miR-524-5p mimic組的BRAF蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖5C，P＜0.05）。上述結(jié)果表明，miR-524-5p靶向BRAF并抑制其表達(dá)。

2.7 過(guò)表達(dá)BRAF逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-524-5p對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT進(jìn)程的影響

CCK-8、WB、FCM法檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-524-5p mimic+pc-DNA組比較，miR-524-5p mimic+pcDNA BRAF組TPC-1細(xì)胞增殖（圖6A）與PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平（圖6C）顯著升高（均P＜0.05），細(xì)胞凋亡率（圖6B）及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)水平（圖6C）顯著降低（均P＜0.05），miR-524-5p mimic組 與 miR-524-5p mimic+pc-DNA組之間上述指標(biāo)比較差異不顯著（圖6，均P＞0.05）。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)BRAF可部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-524-5p對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT進(jìn)程的影響。

3 討論

lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，HOTAIR、MALAT1、H19等多種lncRNA已經(jīng)被證明是許多癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子[8-9]。多種lncRNA與PTC的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，可參與調(diào)控PTC細(xì)胞增殖與遷移等惡性生物學(xué)行為[10-11]。lncRNA TUG1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在食管癌中，lncRNA TUG1通過(guò)結(jié)合miR-1294調(diào)節(jié)PLK1表達(dá)影響食管癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲[12]。已有研究[13]顯示，lncRNA TUG1在PTC組織與細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制lncRNA TUG1表達(dá)可靶向作用于miR-145，上調(diào)鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒-1的表達(dá)，抑制PTC細(xì)胞的增殖與侵襲。lncRNATUG1還可通過(guò)結(jié)合miR-382促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT表型的形成[14]。本研究qPCR結(jié)果顯示，lncRNA TUG1在PTC組織與細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，與申偉等[13]研究結(jié)果一致。在TPC-1細(xì)胞中敲減lncRNA TUG1表達(dá)后，TPC-1細(xì)胞增殖與PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、E-cadherin表達(dá)水平顯著升高，提示敲減lncRNA TUG1表達(dá)可顯著抑制TPC-1細(xì)胞增殖及EMT進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與先前報(bào)道結(jié)果[3]類(lèi)似。

lncRNA可通過(guò)作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA結(jié)合miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。在胃癌中，miR-524-5p可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力，發(fā)揮抑癌基因的作用[16]。在乳腺癌中，miR-524-5p可靶向FSTL1抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT進(jìn)程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1能海綿化miR-524-5p并抑制其作用；TPC-1細(xì)胞中敲減lncRNA TUG1表達(dá)可上調(diào)miR-524-5p表達(dá)；TPC-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-524-5p能抑制細(xì)胞增殖與PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)；抑制miR-524-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)敲減lncRNA TUG1表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞的作用。上述結(jié)果表明，lncRNA TUG1通過(guò)靶向miR-524-5p調(diào)控PTC細(xì)胞增殖、凋亡與EMT進(jìn)程。

miR-524-5p可與靶基因的3'UTR區(qū)結(jié)合調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[18-19]。BRAF是MAPK/ERK通路的上游分子，在第600位（V600E）發(fā)生的氨基酸改變即V600E顯性激活突變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[20]。研究[21]顯示，BRAF在PTC中呈陽(yáng)性表達(dá)，其基因突變與PTC腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本研究證實(shí)，miR-524-5p與BRAF存在靶向關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)TPC-1細(xì)胞中miR-524-5p呈高表達(dá)、BRAF呈低表達(dá)；過(guò)表達(dá)BRAF可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-524-5p對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、EMT的抑制和凋亡的促進(jìn)作用，表明miR-524-5p可通過(guò)靶向抑制BRAF表達(dá)，從而抑制TPC-1細(xì)胞增殖及EMT，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，lncRNA TUG1在PTC組織與細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲減lncRNA TUG1可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-524-5p/BRAF軸抑制PTC細(xì)胞增殖與EMT進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。