顧智文，巫殷騰，廖存，馬輝，張森，張小龍

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科/廣西消化道腫瘤加速康復(fù)外科基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西 南寧 530021

研究表明，結(jié)直腸癌是我國(guó)癌癥死亡的第五大原因[1]。結(jié)腸癌的治療方法包括傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療，還包括迅速發(fā)展的免疫療法[2]。盡管結(jié)腸癌的治療已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但其發(fā)病率逐年上升，5年生存率較低[3-4]?；蛲蛔?、吸煙、肥胖，以及各種炎性疾病是發(fā)生結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素[5]。雖然炎癥促進(jìn)腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制有待進(jìn)一步明確，但是研究發(fā)現(xiàn)不同的免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和免疫介質(zhì)參與了結(jié)腸癌發(fā)生的全過程[6]。免疫細(xì)胞毒性降低[7]和T細(xì)胞浸潤(rùn)缺乏[8]預(yù)示著結(jié)直腸癌患者的結(jié)局不良。Zhang等[9]研究表明，腫瘤免疫浸潤(rùn)程度越高，臨床預(yù)后越好。近年來，結(jié)腸癌分子標(biāo)志物在診斷、治療反應(yīng)評(píng)估和預(yù)后評(píng)估等方面的研究層出不窮[10]，但結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物與免疫細(xì)胞關(guān)系的研究較少。本研究通過生物信息學(xué)分析結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)基因及其與免疫細(xì)胞的關(guān)系，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和組織樣本收集

在GEO（Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與結(jié)腸癌相關(guān)的全基因組基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，最終納入GSE21510、GSE18105和GSE20916這三個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。GSE21510、GSE18105和GSE20916數(shù)據(jù)集的芯片平臺(tái)都是GPL570。我們使用GSE21510作為訓(xùn)練集，GSE18105和GSE20916作為驗(yàn)證集。收集在廣西醫(yī)科大學(xué)第一癌組織及配對(duì)癌旁正常組織。排除術(shù)前接受化療或放療的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。附屬醫(yī)院行手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的41例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織及配對(duì)癌旁正常組織。排除術(shù)前接受化療或放療的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 差異表達(dá)基因（DEGs）的篩選

獲取GPL570平臺(tái)探針名稱與基因名稱的匹配信息，首先將探針名稱轉(zhuǎn)化為正式的基因名稱。當(dāng)多個(gè)探針匹配同一個(gè)基因名稱時(shí)，選擇最大值的探針作為基因表達(dá)水平。利用Limma軟件包對(duì)GSE21510、GSE18105和GSE20916數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和差異表達(dá)分析。篩選DEGs的標(biāo)準(zhǔn)：校正后P＜0.05；|log FC|＞2，F(xiàn)C為差異倍數(shù)。獲取GSE21510、GSE18105和GSE20916數(shù)據(jù)集的上調(diào)和下調(diào)差異基因之后，將它們的上調(diào)和下調(diào)差異基因取交集，從而獲得三個(gè)數(shù)據(jù)集的共同上調(diào)和共同下調(diào)差異基因。

1.3 DEGs的功能富集分析

使用R“clusterprofiler”包對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體論（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）和預(yù)后基因的篩選

在線STRING（http://string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)整合了蛋白質(zhì)之間所有已知和預(yù)測(cè)的關(guān)聯(lián)，包括物理層面的相互作用及功能關(guān)聯(lián)。通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)篩選出的DEGs所表達(dá)蛋白之間的相互作用關(guān)系以及蛋白與蛋白之間聯(lián)系的緊密程度。將共同上調(diào)和共同下調(diào)的差異基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“智人”作為有機(jī)體，設(shè)置顯著閾值＞0.4，其他設(shè)置默認(rèn)，導(dǎo)出結(jié)果文件。然后，使用Cytoscape軟件繪制PPI圖，再使用MCODE插件篩選出具有高度聯(lián)系的基因簇，從而篩選出與結(jié)腸癌相關(guān)的核心基因。

1.5 預(yù)后分析

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=&clicktag=survival）數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了263例結(jié)腸癌患者樣本數(shù)據(jù)及預(yù)后信息，可用于了解基因?qū)颊呱媲闆r的影響。在對(duì)模塊基因進(jìn)行總體生存分析時(shí)，以每百萬映射讀取外顯子模型千堿基轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（TPM）中位數(shù)為截點(diǎn)，將263例有總生存期資料的樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.6 預(yù)后相關(guān)基因表達(dá)水平分析和驗(yàn)證

分析GSE21510、GSE18105和GSE20916數(shù)據(jù)集中篩選出的結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)基因GCNT2的表達(dá)情況，并通過qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其表達(dá)水平。GCNT2的引物由上海生工生物科技有限公司合成，上游引物為5’-TGTTCCTGGCTCTATGCCAAA-3’；下游引物為5’-TTAGCAAACAGGCTTGGTGAAT-3’。使用 NucleoZol RNA試劑提取結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織的總RNA，TaKaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green PCR試劑盒在ABI7500型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)定條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算GCNT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 預(yù)后相關(guān)基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

利用cibersort R包處理GSE21510原始表達(dá)矩陣，篩選出P＜0.05的樣本，得到免疫細(xì)胞矩陣。對(duì)預(yù)后相關(guān)基因和免疫細(xì)胞進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，并用ggplot 2軟件包可視化結(jié)果。

1.8 預(yù)后相關(guān)基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性驗(yàn)證

利用TIMER 2.0（Tumor Immune Estimation Re-source）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上一步的預(yù)后相關(guān)基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)使用高通量測(cè)序（RNA-Seq表達(dá)譜）數(shù)據(jù)分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，主要提供B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞，以及樹突狀細(xì)胞等6種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況[11]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R studio軟件處理數(shù)據(jù)。差異分析采用貝葉斯算法，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌相關(guān)DEGs

在GSE21510數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)903個(gè)DEGs，其中468個(gè)上調(diào)基因，435個(gè)下調(diào)基因（圖1A）。在GSE18105數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)693個(gè)DEGs，其中311個(gè)上調(diào)基因，382個(gè)下調(diào)基因（圖1B）。在GSE20916數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)318個(gè)DEGs，其中106個(gè)上調(diào)基因，212個(gè)下調(diào)基因（圖1C）。三個(gè)數(shù)據(jù)集取交集得到50個(gè)共同上調(diào)DEGs（圖1D）和130個(gè)共同下調(diào)DEGs（圖1E），即180個(gè)交集基因。

圖1 結(jié)腸癌相關(guān)DEGs分析結(jié)果

2.2 DEGs功能富集分析

對(duì)180個(gè)交集基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，交集基因主要富集在細(xì)胞對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、鋅離子反應(yīng)、細(xì)胞鋅離子穩(wěn)態(tài)、銅離子解毒、對(duì)銅離子的應(yīng)力響應(yīng)等生物學(xué)過程（BP）上（圖2A）。在細(xì)胞組成（CC）方面，交集基因主要富集在細(xì)胞頂端部分、頂端質(zhì)膜、質(zhì)膜的外側(cè)、基底質(zhì)膜等（圖2B）。在分子功能（MF）方面，交集基因主要富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性、G蛋白—偶聯(lián)受體結(jié)合、金屬肽酶活性、羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性等（圖2C）。KEGG富集分析結(jié)果顯示，交集基因主要參與礦物吸收，膽汁分泌，病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用，PPAR信號(hào)通路等（圖2D）。

圖2 GO和KEGG功能富集分析結(jié)果

2.3 180個(gè)DEGs的PPI和核心基因生存分析

將180個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出了7個(gè)具有高度聯(lián)系性的基因簇，得到GUCA2B、SLC26A3、ASCL2、GCNT2等 38個(gè)核心基因（圖3A～3G）。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，GCNT2與黑色素瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，但GCNT2在結(jié)腸癌中的具體作用尚不明確[12]。因此，本研究重點(diǎn)研究GCNT2與結(jié)腸癌的關(guān)系。接下來，我們利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GCNT2進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，結(jié)果顯示GCNT2與結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)，且GCNT2高表達(dá)的結(jié)腸癌患者的生存率低于GCNT2低表達(dá)的結(jié)腸癌患者（P＜0.05）（圖3H）。

圖3 PPI和生存分析結(jié)果

2.4 GCNT 2表達(dá)水平分析和驗(yàn)證

GCNT2在GSE21510、GSE18105、GSE20916數(shù)據(jù)集中均為低表達(dá)（圖4A～4C）；qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCNT2在結(jié)腸癌中低表達(dá)，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致（圖4D）。

圖4 GCNT 2的表達(dá)水平

2.5 GCNT 2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

GCNT2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GCNT2與幼稚B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、活化性自然殺傷細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和靜息性肥大細(xì)胞呈正相關(guān)，與M1型巨噬細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞、靜息性樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、靜息性自然殺傷細(xì)胞和活化記憶性CD4+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖5）。

圖5 GCNT 2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析結(jié)果

2.6 GCNT 2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性驗(yàn)證

cibersort算法結(jié)果顯示，GCNT2與幼稚B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、活化性自然殺傷細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞呈正相關(guān)，與靜息性自然殺傷細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，與上述部分結(jié)果一致（圖6）。

圖6 GCNT 2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性驗(yàn)證

3 討論

目前，早期診斷、手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)和系統(tǒng)的綜合治療改善了結(jié)腸癌患者的整體預(yù)后，但其死亡率仍然較高[13]。有研究表明，免疫微環(huán)境會(huì)對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)展、預(yù)后產(chǎn)生影響[14]。因此，探索結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)基因及其與免疫細(xì)胞的相關(guān)性對(duì)結(jié)腸癌診斷和治療具有指導(dǎo)意義。

本研究通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE21510、GSE18015和GSE20916數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出了180個(gè)交集基因，其中上調(diào)的有50個(gè)，下調(diào)的有130個(gè)，下調(diào)基因明顯多于上調(diào)基因，提示結(jié)腸癌發(fā)生時(shí)大部分基因的表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些交集基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要與鋅離子和銅離子有關(guān)。研究表明，鋅離子和銅離子參與細(xì)胞增殖、凋亡、基因表達(dá)、癌癥轉(zhuǎn)移等過程，頭頸癌等惡性腫瘤中可見鋅和銅的穩(wěn)態(tài)異常[15-16]。Khoshdel等[17]比較了來自伊朗的結(jié)直腸癌患者與健康受試者的血清銅和鋅的濃度，發(fā)現(xiàn)銅和鋅水平的失衡與結(jié)直腸癌相關(guān)，并可能在結(jié)直腸癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。一項(xiàng)調(diào)查機(jī)體內(nèi)銅和鋅水平與結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的病例對(duì)照研究的結(jié)果顯示，機(jī)體內(nèi)較高的銅濃度與結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)，而高鋅水平與癌癥風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，表明在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中銅或鋅的含量不平衡，但其調(diào)控結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚不明確[18]。這些研究與這180個(gè)交集基因富集分析的結(jié)果有較好的一致性，提示這些基因中可能存在對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展起到關(guān)鍵作用的基因。

我們通過Cytoscape的MCODE插件相關(guān)節(jié)點(diǎn)算法分析，篩選出了7個(gè)具有高度聯(lián)系性的基因簇，得到GUCA2B、SLC26A3、ASCL2、GCNT2等 38個(gè)核心基因。通過GEPIA數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，結(jié)果顯示GCNT2高表達(dá)的結(jié)腸癌患者的生存率低于GCNT2低表達(dá)的結(jié)腸癌患者。GCNT2（β-1，6 n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶2）是聚糖相關(guān)基因之一[19]。研究表明，GCNT2與前列腺癌[20]、乳腺癌[21]和黑色素瘤[22]的進(jìn)展相關(guān)。Nakamura等[23]研究發(fā)現(xiàn)，GCNT2在結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中低表達(dá)，與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前，癌癥相關(guān)的聚糖可被用來設(shè)計(jì)合理的藥物或作為免疫治療靶點(diǎn)[24]。而GCNT2在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制及其與免疫反應(yīng)的關(guān)系尚不清楚，因此本研究進(jìn)一步探討GCNT2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

通過分析GSE21510、GSE18105和GSE20916數(shù)據(jù)集中GCNT2在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，并利用qPCR法檢測(cè)GCNT2的表達(dá)，結(jié)果顯示GCNT2在結(jié)腸癌中低表達(dá)，與Nakamura等[23]的研究結(jié)果一致。然后，利用cibersort R包處理GSE21510原始表達(dá)矩陣，篩選得到免疫細(xì)胞矩陣，對(duì)GCNT2和免疫細(xì)胞進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示GCNT2與幼稚B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、活化性自然殺傷細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和靜息性肥大細(xì)胞呈正相關(guān)，與M1型巨噬細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、靜息性自然殺傷細(xì)胞和活化記憶性CD4+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果體現(xiàn)了腫瘤浸潤(rùn)先天性免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞在癌癥的發(fā)展中起雙重作用[25]。此外，有研究在結(jié)腸腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[26]。研究表明，自然殺傷細(xì)胞抑制主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲[27]。在腫瘤免疫功能方面，CD4+T細(xì)胞可以從外周血迅速進(jìn)入腫瘤組織，殺死癌細(xì)胞[28]。M1巨噬細(xì)胞激活Ⅰ型輔助性T細(xì)胞，促進(jìn)炎癥進(jìn)程和延緩腫瘤進(jìn)展[29]。為對(duì)GCNT2與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，我們利用cibersort算法計(jì)算結(jié)腸癌中的免疫細(xì)胞及GCNT2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GCNT2與幼稚B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、活化性自然殺傷細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞呈正相關(guān)，與靜息性自然殺傷細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，提示GCNT2可能與結(jié)腸癌相關(guān)免疫細(xì)胞活性有關(guān)。本研究結(jié)論主要基于為生物信息學(xué)的分析，GCNT2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。

綜上所述，GCNT2與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)，其可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性參與結(jié)腸癌的發(fā)展。

利益沖突聲明 全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。