姚冬梅，張達(dá)娟，張樹林，張 迎

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又名南美白對蝦，為我國對蝦養(yǎng)殖的主要品種之一[1]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的規(guī)?；l(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷提高，水中的氮、磷和有機物含量也不斷增高[2-3]，導(dǎo)致水質(zhì)不斷惡化，造成病害頻發(fā)，引起巨大經(jīng)濟損失。水產(chǎn)微生物制劑常用于調(diào)水、肥水、改底等，但微生物制劑中的游離菌體極易失活[4]，受養(yǎng)殖背景環(huán)境(生物因子：物種組成和生物量；非生物因子：水溫、光照、pH、溶解氧、營養(yǎng)鹽和有機質(zhì)含量)影響大，且有研究表明，在對蝦養(yǎng)殖池塘中，微生物制劑對細(xì)菌群落優(yōu)勢種的重塑能力有限，不能定殖在養(yǎng)殖水體成為優(yōu)勢種[5]。而微藻因其活性強、受環(huán)境影響弱、易占主導(dǎo)等特點成為近年來研究的熱點[6-7]。通過接種微藻來有效調(diào)控水質(zhì)、降低病害發(fā)生頻率是目前有效確保水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要調(diào)控手段[8]，普通小球藻(Chlorellavulgaris)因其營養(yǎng)豐富，對環(huán)境的適應(yīng)能力強，生長、繁殖迅速,易于培養(yǎng)等特點被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)調(diào)控中[9]。

對蝦養(yǎng)殖周期適逢夏季高溫，微囊藻(Microcystis)大量增殖而引起的水華頻發(fā)，其釋放的藍(lán)藻毒素顯著抑制對蝦的生長和繁殖，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致對蝦大規(guī)模死亡[10]。而接種小球藻會與微囊藻產(chǎn)生競爭抑制效應(yīng)，使微囊藻的生長受到抑制。朱為菊[11]研究表明，4.5×108個/L初始密度的微囊藻與小球藻混養(yǎng)時，隨著小球藻接種密度的提高，對微囊藻生長的抑制效果愈加明顯。張坤等[12]在此研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了微囊藻的初始密度，當(dāng)微囊藻初始密度為1.8×109個/L時，小球藻接種密度的提高對微囊藻生長抑制效果不明顯。上述研究大多在條件可控、相對穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，且藻類種類存在局限性，忽視了微藻群落結(jié)構(gòu)變化與對蝦健康養(yǎng)殖的密切關(guān)系。而對蝦養(yǎng)殖在不同季節(jié)和不同階段水體中藻相會發(fā)生動態(tài)變化，如張振華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)養(yǎng)殖池接種小球藻后，水體中的藻類組成發(fā)生了改變。因此關(guān)于在凡納濱對蝦自然養(yǎng)殖水體中接種小球藻對微藻群落結(jié)構(gòu)的影響仍需進(jìn)一步研究。

水體中氨氮和亞硝態(tài)氮含量是制約凡納濱對蝦健康的主要水質(zhì)因子。Hargeraves等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氨氮和亞硝態(tài)氮含量過高會直接造成凡納濱對蝦的死亡。蔡志輝[15]指出，氨氮質(zhì)量濃度<0.6 mg/L、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度<0.1 mg/L的水體才能保證凡納濱對蝦生長及成活。而微藻群落結(jié)構(gòu)的變化對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝態(tài)氮的去除鮮有報道。因此筆者在凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘定向接種普通小球藻，分析微藻群落結(jié)構(gòu)的變化特征，查明接種普通小球藻與環(huán)境因子互作關(guān)系以及對氨氮和亞硝態(tài)氮的影響，以期為合理接種普通小球藻以及接種后日間合理控制環(huán)境因子調(diào)控凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

接種用的普通小球藻FACHB-8購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，經(jīng)培養(yǎng)后含藻細(xì)胞密度為1.0×1010個/L。

1.2 試驗設(shè)計

試驗池塘位于天津市寶坻區(qū)富淼水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社的兩口凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘，池塘占地面積均為100 m2，平均水深1.5 m。

試驗于2018年5—8月進(jìn)行，每10 d于12：00采集1次樣本，共進(jìn)行9次，設(shè)不接種小球藻(對照組)和接種小球藻(試驗組)2個處理組，試驗組每10 d投放25 L密度為1.0×1010個/L的小球藻，試驗組接種終密度為1.5×107個/L。為確保2個處理組對蝦養(yǎng)殖池塘的條件相同，將對照組養(yǎng)殖用水轉(zhuǎn)移至試驗組，添加養(yǎng)殖用水至兩池水位相同，試驗前測量兩池浮游植物種類，使其種類相差不超過5%、密度相差不超過5%。

1.3 樣品采集及處理

1.3.1 微藻

為避免微藻晝夜垂直運動在水體不同水層分布不同的影響，使用1 L的有機玻璃采水器，在池塘中心的水體表層、中層、底層各取樣1 L，將各層水體處取得樣品混合均勻后再從混合樣中取1 L，每升加入15 mL魯哥試劑固定并貼好標(biāo)簽。帶回實驗室將水樣靜置沉淀48 h后，虹吸至30 mL待檢。微藻種類鑒定參考《中國淡水藻類》[16]。

1.3.2 理化因子

使用1 L的有機玻璃采水器在水體表層、中層、底層各取樣1 L，將各層水體處取得樣品混合均勻后再從混合樣中取1 L，帶回實驗室用于氨氮、亞硝態(tài)氮的測定。氨氮、亞硝態(tài)氮含量的測定方法參考《水與廢水監(jiān)測分析方法》[17]。

現(xiàn)場采用pH meter、ORP instrument、flexi溶解氧測定儀、Portable REFRACTOMETER和透明度盤測定pH、氧化還原電位、水溫、溶解氧濃度、透明度等物理環(huán)境因子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 浮游植物優(yōu)勢度

優(yōu)勢度(Y)的計算公式為：

Y=(ni/n)×fi

(1)

式中，ni為樣品中某藻數(shù)量，n為采集樣品中浮游植物總數(shù)量，fi為樣品中某浮游植物出現(xiàn)的頻率。當(dāng)物種優(yōu)勢度>0.02時，該種即為優(yōu)勢種群[18]。

1.4.2 浮游植物群落結(jié)構(gòu)分析

采用 PRIMER 6.0 進(jìn)行多元統(tǒng)計分析：首先對物種的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換以平衡優(yōu)勢種和稀有種在群落中的影響,并計算不同采樣時間內(nèi)的Bray-Curtis相似性系數(shù)，構(gòu)建相似性矩陣，然后采用等級聚類方法和非度量多維標(biāo)度排序方法分析浮游植物的群落分布格局。通過單因子相似性分析檢驗不同聚類組間的差異性[19]，并通過相似性百分比分析不同物種對各群落組內(nèi)相似性和組間差異性的平均貢獻(xiàn)率。

Bray-Curtis相似性系數(shù)(B)計算公式如下：

(2)

式中，S為微藻種類數(shù)，Xij和Xim分別表示第i個種類在第j個采樣日期和第m個采樣日期之間的平均微藻密度。

1.4.3 浮游植物群落與環(huán)境因子的分析

利用CANOCO 4.5軟件分析物理環(huán)境因子與浮游植物優(yōu)勢屬種間的關(guān)系。先對凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘內(nèi)浮游植物優(yōu)勢屬密度作去趨勢對應(yīng)分析(DCA)，判斷單峰響應(yīng)梯度SD值的大小，若4個軸中梯度最大值大于4則選擇單峰模型，進(jìn)行典范對應(yīng)分析(CCA)，若4個軸中梯度最大值小于4則選擇線性模型，進(jìn)行冗余分析(RDA)。物種密度和物理環(huán)境因子的數(shù)值進(jìn)行量綱的統(tǒng)一，并經(jīng)過lg(x+1)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗對養(yǎng)殖池塘微藻群落結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 微藻種類組成及優(yōu)勢種

試驗前，對照組鑒定出微藻共5門36屬(種)：藍(lán)藻門6種，占全部種類的16.7%；綠藻門22種，占總種類的61.1%；硅藻門5種，占總種類的13.9%；裸藻門2種，占總種類的5.5%；隱藻門1種，占總種類的2.8%。接種普通小球藻的試驗組鑒定出微藻5門38屬(種)：藍(lán)藻門6種，占總種類的15.8%；綠藻門24種，占總種類的63.2%；硅藻門5種，占總種類的13.1%；裸藻門2種，占總種類的5.3%；隱藻門1種，占總種類的2.6%。

對照組微藻總密度呈先升后降的趨勢，最大密度達(dá)到1.3174×108個/L，藍(lán)藻門微藻密度呈先升后降的趨勢，最大密度達(dá)到1.1862×108個/L，綠藻門微藻密度呈下降趨勢，其余微藻密度變化穩(wěn)定。試驗組微藻總密度整體呈先升后降的趨勢，試驗后期起伏明顯，最大密度達(dá)到1.2148×108個/L，藍(lán)藻門微藻密度呈先升后降的趨勢，最大密度達(dá)到 2.552×107個/L，較對照組平均密度比例下降了76.32%，綠藻門微藻密度整體呈先升后降的趨勢，波動明顯，較對照組平均密度比例上升了70.32%，其余微藻密度變化穩(wěn)定(圖1)。

兩池微藻群落的共有優(yōu)勢種為銅綠微囊藻(M.aeruginosa)、四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)、尖細(xì)柵藻(S.acuminatus)、二形柵藻(S.dimorphus)、斜生柵藻(S.obliquus)、雙列柵藻(S.bijugatus)、規(guī)則四角藻(Tetraedronregulare)，對照組以藍(lán)藻門的銅綠微囊藻占絕對優(yōu)勢，試驗組以綠藻門的普通小球藻占絕對優(yōu)勢，經(jīng)小球藻長期接種后，銅綠微囊藻已不占明顯優(yōu)勢，但微藻群落優(yōu)勢種比例減少50%(表1)。

表1 兩口池塘不同采樣時間微藻優(yōu)勢度變化

2.1.2 微藻群落結(jié)構(gòu)變化

兩口池塘微藻群落聚類分析圖和相應(yīng)的非度量多維標(biāo)度排序圖一致(圖2)，且脅強系數(shù)均小于0.1，聚類排序可靠。對照組、試驗組微藻群落在試驗期間依據(jù)密度變化均分成3個集群，其中試驗組與對照組相比，綠藻門微藻群落結(jié)構(gòu)變化較大，分組有明顯差異，且試驗組Bray-Curtis相似性(70%)高于對照組(60%)，說明接種小球藻后微藻群落結(jié)構(gòu)變化穩(wěn)定、連續(xù)性更好。

對兩口池塘全部微藻種類在時間梯度上進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明，兩次調(diào)查的不同聚類組間均存在顯著性差異(對照組：R=0.988，P<0.05；試驗組：R=0.66，P<0.05)。相似性百分比分析表明，以85%的相似性將對照組微藻群落分為2組，A組為試驗后3次采樣，B組為試驗前6次采樣。以85%的相似性將試驗組微藻群落分為2組，C組為試驗后3次采樣，D組為試驗前6次采樣。

A組平均相似性為90.63%，主要貢獻(xiàn)物種為銅綠微囊藻(26.63%)、其余各物種貢獻(xiàn)率均低于5%。B組平均相似性為90.15%，無主要貢獻(xiàn)物種，各物種貢獻(xiàn)率均低于5%。C組平均相似性為91.90%，主要貢獻(xiàn)物種為普通小球藻(19.10%)、銅綠微囊藻(9.64%)，其余各物種貢獻(xiàn)率均低于5%。D組平均相似性為89.36%，主要貢獻(xiàn)物種為普通小球藻(13.36%)，各物種貢獻(xiàn)率均低于5%。試驗結(jié)果表明，池塘接種普通小球藻后，對微藻群落結(jié)構(gòu)變化有顯著影響，表現(xiàn)為銅綠微囊藻的貢獻(xiàn)率顯著下降，普通小球藻貢獻(xiàn)率顯著上升。

圖2 兩口池塘微藻群落聚類分析(a)和多維尺度排序分析(b)Fig.2 Cluster (a) and multi-dimensional scale sequencing (b) of microalga communities in two kinds of ponds

2.2 試驗組微藻優(yōu)勢種群與環(huán)境因子關(guān)系

利用CANOCO 4.5對接種普通小球藻的試驗組微藻優(yōu)勢類群密度先進(jìn)行去趨勢對應(yīng)分析，以檢驗其第1軸的梯度長，其結(jié)果為0.757，因此選擇冗余分析進(jìn)行約束性排序。環(huán)境因子對試驗組微藻優(yōu)勢類群1、2軸共解釋量分別為98.8%、94.5%(表2)，這表明微藻優(yōu)勢類群密度與環(huán)境因子之間的關(guān)系基本得到全面解釋。

由表2、圖3可見，經(jīng)蒙特卡羅檢驗后，試驗組微藻優(yōu)勢類群密度與水溫、pH、溶解氧質(zhì)量濃度密切相關(guān)，與氧化還原電位、透明度相關(guān)程度弱，其中水溫、pH、溶解氧對試驗組密度變化均有顯著影響(P<0.01)，其余兩種環(huán)境因子對密度變化影響較差。

2.3 試驗對亞硝態(tài)氮、氨氮的影響

對照組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在試驗期間整體呈上升趨勢，其平均值為0.055 mg/L，試驗組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在試驗期間整體呈先降后升的趨勢，其平均值為0.029 mg/L(表3、圖4)。對照組氨氮質(zhì)量濃度在試驗期間整體呈上升趨勢，其平均值為0.531 mg/L，試驗組氨氮質(zhì)量濃度在試驗期間整體呈先降后升的趨勢，其平均值為0.296 mg/L。試驗組較對照組亞硝態(tài)氮、氨氮質(zhì)量濃度均表現(xiàn)出顯著下降的趨勢(表3、圖4)。

表2 蒙特卡羅檢驗環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)

圖3 微藻優(yōu)勢類群密度與環(huán)境因子冗余分析排序Fig.3 Redundancy analysis of ranking of dominant microalgae group density and environmental factor

表3 試驗期間環(huán)境因子的變化

圖4 2種池塘亞硝態(tài)氮、氨氮質(zhì)量濃度變化Fig.4 Changes in nitrite and ammonia nitrogen levels in two kinds of ponds

3 討 論

3.1 接種普通小球藻對微藻群落結(jié)構(gòu)的影響

微藻作為水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者，是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ)[21]。本試驗建立在封閉水體的基礎(chǔ)上，一定程度上減少了水動力學(xué)特征、水文動態(tài)、透明度等對微藻群落結(jié)構(gòu)的影響，為探究接種普通小球藻后池塘微藻群落結(jié)構(gòu)的變化建立了優(yōu)勢。從物種數(shù)量來看，試驗組較對照組種類數(shù)多5%，兩池綠藻門生物均占總種類60%以上，這與張瑜斌等[22]的研究結(jié)果——對蝦池塘中微藻群落以綠藻門的種類最多一致。從密度變化來看，試驗組較對照組藍(lán)藻門生物平均密度比例下降了76.32%、綠藻門生物平均密度比例上升了70.32%，再結(jié)合群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，接種普通小球藻后微藻群落結(jié)構(gòu)變化穩(wěn)定、連續(xù)性更好，且銅綠微囊藻的貢獻(xiàn)率顯著下降，普通小球藻貢獻(xiàn)率顯著上升。表明接種普通小球藻后顯著抑制了銅綠微囊藻的生長，這與朱為菊[11]的研究結(jié)果——普通小球藻對微囊藻生長具有顯著抑制作用一致。有研究表明，蝦池接種普通小球藻后，改變了水體藻類的組成、數(shù)量和比例[13]，是接種普通小球藻對微藻群落組成和數(shù)量有積極影響的表現(xiàn)。

3.2 接種普通小球藻與環(huán)境因子互作關(guān)系

養(yǎng)殖池塘是一個相對封閉的生態(tài)系統(tǒng)，不同的浮游植物有不同的最適生長環(huán)境[23]，尤其以環(huán)境理化因子與浮游植物種類和數(shù)量的關(guān)系最為密切[24]，一般認(rèn)為水體營養(yǎng)鹽[25]、溫度[26]、溶解氧濃度[27]等環(huán)境因子可以直接影響浮游植物的群落組成、細(xì)胞密度、生命周期及分布等[28]。胡長玉等[29-31]研究發(fā)現(xiàn)，不同流域、不同水體類型中，影響浮游植物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子具有一定的差異性。本試驗中，溫度、pH、溶解氧質(zhì)量濃度對試驗組微藻密度變化均有顯著影響(P<0.01)，其余兩種環(huán)境因子對密度變化影響較差?？梢姕囟?、pH、溶解氧質(zhì)量濃度是影響接種普通小球藻對蝦池塘浮游植物的主要環(huán)境因子，結(jié)合亞硝態(tài)氮及氨氮質(zhì)量濃度的變化可知，接種普通小球藻的對蝦池塘較未接種普通小球藻的對蝦池塘亞硝態(tài)氮和氨氮平均質(zhì)量濃度在時空尺度內(nèi)分別下降了47.27%、44.26%，這與劉梅等[32]的研究結(jié)果——小球藻以及衣藻、隱藻等其他藻類均能顯著降低水體中氨氮和亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度相符，但未達(dá)到張繼平等[33]的研究結(jié)果——小球藻能顯著降低水體中亞硝態(tài)氮的含量及最高降解率達(dá)75.6%的程度，這可能與小球藻的接種密度不夠有關(guān)。

雖然普通小球藻顯著抑制了銅綠微囊藻的生長，但微囊藻的緩慢生長說明藍(lán)藻仍然會有負(fù)面影響，藍(lán)藻不但影響了池塘內(nèi)浮游植物的生長也影響了理化因子對浮游植物群落的調(diào)控作用。夏季藍(lán)藻暴發(fā)產(chǎn)生大量的微囊藻毒素[34]，Sedmak等[35]研究發(fā)現(xiàn)，微囊藻毒素參與浮游植物的種群調(diào)節(jié)，可調(diào)控藻類的增殖。微囊藻毒素正是通過抑制藻類的光合系統(tǒng)PS Ⅱ活性從而使兩池內(nèi)浮游植物藻類生長受到阻礙。微囊藻毒素也會對理化因子造成影響。蘇發(fā)文等[36]在微囊藻和普通小球藻對水環(huán)境pH的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度在25 ℃以上微囊藻抑制pH的升高，而普通小球藻會促進(jìn)pH的升高。但本試驗中，兩池pH均偏高，一方面可能是由于試驗用水為對蝦養(yǎng)殖池塘水，另一方面可能是接種普通小球藻后，在銅綠微囊藻與普通小球藻的共同作用下導(dǎo)致池塘內(nèi)的環(huán)境理化因子升降趨勢不明顯。

本試驗結(jié)果表明，接種普通小球藻不僅對浮游植物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，也會抑制環(huán)境理化因子的失控，降低亞硝態(tài)氮、氨氮等有害水質(zhì)因子的質(zhì)量濃度。由于普通小球藻的生長周期一般為10 d，且小球藻晝夜遷移時，0：00—8：00分裂增殖緩慢，8：00—12：00迅速生長，12：00—24：00緩慢生長，因此筆者建議接種頻率為1次/10 d，接種時間為8：00，此條件下接種普通小球藻效果最佳。但仍需對接種小球藻的密度以及采樣頻率進(jìn)行試驗優(yōu)化，進(jìn)一步找到小球藻的最適接種密度，以便為合理控制環(huán)境因子調(diào)控凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘提供參考。

4 結(jié) 論

(1)接種普通小球藻后凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘浮游植物種類數(shù)增加、銅綠微囊藻的貢獻(xiàn)率顯著下降，普通小球藻貢獻(xiàn)率顯著上升，使池塘浮游植物群落結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，接種普通小球藻對浮游植物群落組成和數(shù)量有積極影響。

(2)冗余分析表明，接種小球藻的對蝦池塘浮游植物受溫度、pH、溶解氧影響(P<0.01)，是調(diào)控浮游植物的環(huán)境因子，再結(jié)合亞硝態(tài)氮、氨氮的去除效應(yīng)，建議接種頻率為1次/10 d，接種時間為8：00，此條件下接種普通小球藻效果最佳。

(3)試驗應(yīng)進(jìn)一步研究在不同接種小球藻密度下，對持續(xù)接種小球藻去除亞硝態(tài)氮及氮磷的效應(yīng)機制，并分別在日間和夜間監(jiān)測以得到更完善的研究成果。