李瑞花，蔣引娣，劉接班

咸陽(yáng)市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 咸陽(yáng) 712000

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一種惡性B細(xì)胞淋巴瘤，其5年生存率介于32%～81%[1]。目前，DLBCL的發(fā)病機(jī)制仍不明確，導(dǎo)致治療方式較為局限，病死率居高不下[2]。因此將新興的分子靶向治療應(yīng)用于DLBCL有著重要意義。近年來，許多研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)參與腫瘤發(fā)病過程，可以作為治療靶點(diǎn)或預(yù)后指標(biāo)[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA微小染色體維系蛋白3結(jié)合蛋白反義1(long non-coding RNA Microchromosome maintenance protein 3-associated protein antisense 1，lncRNA MCM3AP-AS1)位于人類染色體21q22.3上，參與調(diào)節(jié)多種疾病中的蛋白表達(dá)，并與宮頸癌、口腔鱗癌、前列腺癌、肝癌、非小細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等癌癥發(fā)病機(jī)制有關(guān)[3-6]。研究表明，lncRNA可以通過與微小RNA(microRNA，miR)結(jié)合來影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[7]。HOU等[4]有關(guān)口腔鱗癌的研究結(jié)果顯示，MCM3AP-AS1在口腔鱗癌中的高表達(dá)與口腔鱗癌患者不良預(yù)后有關(guān)，MCM3AP-AS1直接靶向抑制miR-363-5P，對(duì)口腔鱗癌的發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)作用。SHEN等[6]的研究表明，MCM3AP-AS1在非小細(xì)胞癌組織及癌細(xì)胞中呈上調(diào)表達(dá)且能夠加速病情進(jìn)展，miR-195-5p則下調(diào)表達(dá)，MCM3AP-AS1通過直接靶向抑制miR-195-5p來促進(jìn)非小細(xì)胞癌的發(fā)展。然而，MCM3AP-AS1、miR-195-5p在DLBCL中的作用尚不清楚。因此，本研究通過探討MCM3AP-AS1、miR-195-5p在DLBCL組織中的表達(dá)，初步分析兩者在DLBCL中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料共納入于2017年1月至2018年7月在咸陽(yáng)市中心醫(yī)院血液內(nèi)科接受手術(shù)治療的DLBCL患者80例，并在術(shù)中收集組織樣本(癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織)，樣本離體后，迅速置于液氮中保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴腫瘤診斷分類標(biāo)準(zhǔn)(2017年)[8]；入組前未接受放療或化療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)法行化療、放療者；(2)繼發(fā)性DLBCL；(3)既往有非DLBCL的惡性腫瘤史；(4)有精神疾病。本研究嚴(yán)格按照倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行，所有研究對(duì)象均自愿參加并簽署知情同意書。收集患者性別、年齡等一般資料，以及原發(fā)部位(結(jié)外或結(jié)內(nèi))、血清乳酸脫氫酶水平、腫瘤直徑、B癥狀、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分、病理分型、臨床分期(Ann Arbor分期)[9]等臨床病理資料。其中年齡＜60歲36例、≥60歲44例；男性41例，女性39例；乳酸脫氫酶水平正常者42例，升高者38例；原發(fā)部位在淋巴結(jié)外35例，淋巴結(jié)內(nèi)45例。

1.2 熒光定量PCR檢測(cè)MCM3AP-AS1和miR-195-5p表達(dá)水平取-80℃凍存的樣品，液氮磨樣后取50～100 mg樣品，使用試劑盒(QIAGEN，美國(guó))提取總RNA，超微量核酸蛋白分析儀(Biofuture，英國(guó))檢測(cè)RNA質(zhì)量，以O(shè)D260/OD280值在1.8～2.0之間為質(zhì)量較好，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN，德國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照SYBRGreen試劑盒(Invitrogen，美國(guó))說明書配置反應(yīng)體系，并在實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(Corbett Research，澳大利亞)上分析樣品。MCM3AP-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-195-5p以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算MCM3AP-AS1和miR-195-5p表達(dá)水平。本研究所有引物均由上海英濰捷基生物公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列

1.3 隨訪入組患者均于術(shù)后每6個(gè)月隨訪一次，以復(fù)診或電話方式進(jìn)行，準(zhǔn)確記錄隨訪結(jié)果，隨訪時(shí)間截至2021年8月，共3年。無(wú)失訪者。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均使用SPSS25.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料以例表示，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；組間差異分析行χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)；MCM3AP-AS1與miR-195-5p相關(guān)性分析使用Pearson法；Logistics回歸分析影響DLBCL患者預(yù)后的因素；構(gòu)建Kaplan-Meier生存曲線比較MCM3AP-AS1、miR-195-5p不同表達(dá)水平與患者術(shù)后3年累積生存率的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL癌組織及其癌旁組織的MCM3AP-A-S1、miR-195-5p表達(dá)水平比較DLBCL癌組織中MCM3AP-AS1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，而miR-195-5p表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 DLBCL癌組織及其癌旁組織的MCM 3AP-AS1和mi R-195-5p表達(dá)水平比較(±s)

表2 DLBCL癌組織及其癌旁組織的MCM 3AP-AS1和mi R-195-5p表達(dá)水平比較(±s)

2.2 MCM3AP-AS1與miR-195-5p的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析顯示，DLBCL患者癌組織中MCM3AP-AS1與miR-195-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.560，P=0.000)，見圖1。

圖1 MCM 3AP-AS1與miR-195-5p的相關(guān)性

2.3 癌組織MCM3AP-AS1、miR-195-5p表達(dá)水平與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系分別以DLBCL癌組織中MCM3AP-AS1、miR-195-5p表達(dá)水平的平均值為界限，將DLBCL患者分為MCM3AP-AS1高表達(dá)組(41例)和低表達(dá)組(39例)，miR-195-5p高表達(dá)(37例)和低表達(dá)組(43例)。MCM3AP-AS1、miR-195-5p不同表達(dá)水平與患者年齡、性別、原發(fā)部位、血清乳酸脫氫酶水平無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)；MCM3AP-AS1、miR-195-5p不同表達(dá)水平與患者B癥狀、臨床分期、IPI評(píng)分、腫瘤直徑有關(guān)(P＜0.05)，見表3。

表3 MCM 3AP-AS1、miR-195-5p水平與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.4 MCM3AP-AS1、miR-195-5p表達(dá)水平與DLBCL患者生存時(shí)間的關(guān)系80例患者術(shù)后隨訪3年，其中27例死亡，53例生存，總生存率為66.25%。MCM3AP-AS1高表達(dá)組患者的平均生存時(shí)間為27.37個(gè)月、低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為32.03個(gè)月，MCM3AP-AS1高表達(dá)組患者的累積生存率為41.46%，低于低表達(dá)組的66.67%(Logrankχ2=5.888，P=0.015)。miR-195-5p高表達(dá)組、低表達(dá)組患者生存時(shí)間均值分別為31.76個(gè)月、27.81個(gè)月，其中低表達(dá)組患者累積生存率為41.86%，顯著低于高表達(dá)組的67.57%(Logrankχ2=5.230，P=0.022)，見圖2。

圖2 MCM3AP-AS1、miR-195-5p表達(dá)水平與DLBCL患者累積生存率的關(guān)系

2.5 影響DLBCL患者預(yù)后的因素將MCM3A P-AS1、miR-195-5p以及表3中有差異的臨床分期、B癥狀、IPI評(píng)分、腫瘤直徑納入Logistics回歸分析。結(jié)果顯示，MCM3AP-AS1、miR-195-5p水平以及IPI評(píng)分、臨床分期、B癥狀是影響患者預(yù)后的主要因素(P＜0.05)，見表4。

表4 影響DLBCL患者預(yù)后的多因素Logistics回歸分析結(jié)果

3 討論

DLBCL是一種侵襲性的淋巴系統(tǒng)增生性疾病，屬于非霍奇金淋巴瘤(NHL)常見的亞型，并占所有NHL病例數(shù)的1/3以上[10]。DLBCL作為一種淋巴瘤，可在人體的任何部位發(fā)病，給患者生命帶來巨大威脅。DLBCL的主要臨床癥狀為無(wú)痛性進(jìn)行性腫塊增大，伴有盜汗、發(fā)熱，其主要治療方案為全身放療、一線化療方案為R-CHOP(rituximab combined with CHOP)方案，盡管R-CHOP方案對(duì)DLBCL的治療有效，但是超一半的患者會(huì)出現(xiàn)化療耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，導(dǎo)致五年生存率非常低[11]。因此，尋找新的有效治療靶點(diǎn)及探究DLBCL發(fā)病分子機(jī)制對(duì)改善預(yù)后尤為重要。

lncRNA與胰腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，被認(rèn)為是癌癥治療的靶點(diǎn)，同時(shí)其在DLBCL發(fā)病過程、預(yù)后及耐藥性中也起著重要作用[2，12]。例如，研究顯示lncRNA SNHG8在DLBCL中表達(dá)水平增加，將其沉默后則對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制并促進(jìn)其凋亡[12]。張寧等[13]發(fā)現(xiàn)，lncRNA BCAR4在DLBCL患者血清中高表達(dá)，其高表達(dá)不僅與較大的腫瘤、較高分期、較高IPI評(píng)分、有B癥狀相關(guān)，還與較差預(yù)后有關(guān)。值得注意的是，MCM3AP-AS1也在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用。ZHOU等[14]發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1在結(jié)直腸癌組織中上調(diào)表達(dá)，并與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，將其沉默后顯著抑制了癌細(xì)胞遷移能力。YU等[5]通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中MCM3AP-AS1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，MCM3AP-AS1在子宮內(nèi)膜癌中顯著上調(diào)表達(dá)，其高表達(dá)與較低的生存率相關(guān)。此外，在非小細(xì)胞癌中MCM3AP-AS1的高表達(dá)與患者較大的腫瘤直徑大小、低分化、較高的TNM分期密切相關(guān)[6]。結(jié)合本研究中MCM3AP-AS1在癌組織中的表達(dá)水平升高，其表達(dá)水平與B癥狀、臨床分期、IPI評(píng)分、腫瘤直徑有關(guān)，說明MCM3AP-AS1可能參與調(diào)控DLBCL病理過程。

miRNA參與調(diào)控人體基礎(chǔ)代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等過程，并在腫瘤中異常表達(dá)且參與調(diào)控腫瘤相關(guān)基因。位于17號(hào)染色體上的miR-195被認(rèn)為是腫瘤增殖的抑制劑，在腫瘤治療中具有廣闊的前景[15]。其中，miR-195-5p在多種腫瘤中低表達(dá)，例如宮頸癌、喉癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌，表明miR-195-5p與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。張小婷[16]的研究結(jié)果顯示，miR-195-5p在卵巢癌患者血清中表達(dá)水平降低，其表達(dá)水平與糖類抗原125、病理分級(jí)、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期、淋巴轉(zhuǎn)移及較低的生存率有關(guān)。韓肖驊等[17]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清miR-195-5p水平顯著升高，其表達(dá)水平與患者孕激素受體、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分子分型、TNM分期等密切相關(guān)，對(duì)乳腺癌的診斷有一定的價(jià)值。另有研究顯示，DLBCL組織中miR-195表達(dá)下調(diào)發(fā)揮抑癌基因功能[9]。結(jié)合本研究中miR-195-5p的低表達(dá)，并且miR-195-5p的不同表達(dá)水平與患者臨床分期、B癥狀、IPI評(píng)分、腫瘤直徑具有明顯相關(guān)性，提示miR-195-5p可能負(fù)向調(diào)控DLBCL發(fā)病進(jìn)程。

在腫瘤發(fā)展過程中，具有miRNA結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA可以競(jìng)爭(zhēng)性和miRNA結(jié)合，兩者相互作用調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)[1]。先前研究顯示，MCM3AP-AS1可以與miR-194-5p、miR-138-5p、miR-211-5p和miR-142-3p等多種miRNA結(jié)合共同調(diào)控疾病進(jìn)展[14]。趙天增等[18]研究了MCM3AP-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞中MCM3AP-AS1表達(dá)水平顯著增加，抑制其表達(dá)可對(duì)癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生消極作用，miR-16-5p在癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，將miR-16-5p過表達(dá)同樣對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1通過靶向負(fù)調(diào)控miR-16-5p的表達(dá)來影響肺癌細(xì)胞的生物活動(dòng)。SHEN等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞癌中MCM3AP-AS1上調(diào)表達(dá)，其高表達(dá)會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲等，而miR-195-5p在癌組織中下調(diào)表達(dá)且是MCM3AP-AS1的靶點(diǎn)，MCM3AP-AS1通過靶向抑制miR-195-5p來發(fā)揮促癌作用。本研究中Pearson結(jié)果顯示MCM3AP-AS1與miR-195-5p呈 負(fù) 相 關(guān)(r=-0.560，P=0.000)，提 示 在DLBCL中MCM3AP-AS1可能通過直接負(fù)調(diào)控miR-195-5p的表達(dá)來加重病情。本研究中Logistics回歸分析結(jié)果顯示，MCM3AP-AS1、miR-195-5p、臨床分期、B癥狀、IPI評(píng)分是影響該病患者預(yù)后的主要因素(P＜0.05)。吳亮等[19]的研究也指出IPI評(píng)分高、臨床分期高、有B癥狀是影響DLBCL患者術(shù)后生存情況的危險(xiǎn)因素。通過構(gòu)建術(shù)后3年的生存分析曲線，結(jié)果顯示MCM3AP-AS1低表達(dá)、miR-195-5p高表達(dá)時(shí)的患者累積生存率較高，提示當(dāng)DLBCL組織中MCM3AP-AS1低表達(dá)、miR-195-5p高表達(dá)時(shí)，DLBCL患者預(yù)后較好。以上結(jié)果提示，MCM3AP-AS1、miR-195-5p與DLBCL的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，推測(cè)其分別發(fā)揮促癌基因、抑癌基因功能。

綜上所述，DLBCL患者癌組織中MCM3AP-AS1高表達(dá)，miR-195-5p呈低表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)MCM3AP-AS1高表達(dá)、miR-195-5p低表達(dá)時(shí)患者預(yù)后效果較差。本研究結(jié)果提示MCM3AP-AS1可能是治療DLBCL的一個(gè)有前景的新靶點(diǎn)。但是，本研究納入的樣本量有限，影響DLBCL不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素未能完全分析，且MCM3AP-AS1、miR-195-5p對(duì)癌細(xì)胞的具體調(diào)控方式仍需進(jìn)一步研究。