陶曉芳 王雅潔 王文斌 費(fèi)年華

咸寧市中心醫(yī)院（湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院）1老年病科，2甲狀腺乳腺外科（湖北咸寧 437000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病的主要病因［1］。大約60%的心肌梗死是由斑塊破裂引起的［2］。易損的AS 斑塊具有脆弱、不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，是急性冠脈綜合征最常見的病因［3］。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡是易損斑塊形成的關(guān)鍵。抑制細(xì)胞凋亡可抑制斑塊破裂并預(yù)防急性心血管事件［4］。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）通過對高血壓的間接誘導(dǎo)作用和對血管壁的直接作用來介導(dǎo)AS 發(fā)病機(jī)制［5］。動物和臨床試驗(yàn)證明，Ang Ⅱ受體阻滯劑可以降低斑塊破裂和冠狀動脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)［6-7］。然而，Ang Ⅱ介導(dǎo)的易破裂斑塊形成的潛在機(jī)制需要進(jìn)一步研究。絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4，MAP4K4）是哺乳動物STE20/MAP4K 家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與多種生物過程，例如細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞增殖和細(xì)胞骨架的重排［8］。已發(fā)現(xiàn)Map4k4 可加速AS 和血管炎癥［9］。最近一項(xiàng)研究表明，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過抑制Map4k4 減緩ApoE-/-小鼠AS 斑塊的形成［10］。然而，Map4k4 與AS 斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)聯(lián)尚不清楚。因此，本研究假設(shè)Map4k4 可能參與AngⅡ?qū)S 病變中巨噬細(xì)胞凋亡和斑塊穩(wěn)定性的影響。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究采用Ang Ⅱ聯(lián)合或不聯(lián)合Lenti-shMap4k4 和Lenti-Map4k4 處理ApoE-/-小鼠和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，探討Map4k4 在巨噬細(xì)胞凋亡和AS 斑塊易損性中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物實(shí)驗(yàn)分組 32只雄性ApoE-/-小鼠（6 ～8周齡）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件［溫度（22 ± 1）℃；濕度55% ～60%；12 h明暗循環(huán)］下飼養(yǎng)，可自由獲取水和食物。適應(yīng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為四組（每組8 只）：Control組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+ shMap4k4（shMap4k4）組（小鼠尾靜脈注射Lenti-shMap4k4）和AngⅡ+ Map4k4（Map4k4）組（小鼠尾靜脈注射Lenti-Map4k4）。除Control 組小鼠外，Ang Ⅱ組小鼠按照標(biāo)準(zhǔn)量［1 000 ng/（min·kg）］配制微量滲透泵，并在常規(guī)麻醉下埋入頸背部皮下12周。在給予Ang Ⅱ4周和8周時(shí)，Ang Ⅱ+shMap4k4組通過鼠尾靜脈向小鼠注射100 μL攜帶shMap4k4的慢病毒（1×108TU/mL），和Ang Ⅱ+Map4k4 組通過鼠尾靜脈向小鼠注射100 μL攜帶Map4k4質(zhì)粒的慢病毒（1×108TU/mL）。在研究結(jié)束時(shí)（埋入頸背部皮下12 周后，即實(shí)驗(yàn)開始后第13 周的第1 天），處死小鼠，收集標(biāo)本。本研究已通過本院倫理委員會審查（批號：2019 第（03）號）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 通過用冰冷的Dulbecco 改良的Eagle′s 中/高糖（DMEM，美國Hyclone 公司）沖洗腹腔分離C57BL6J雄性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。細(xì)胞接種在含10%胎牛血清（Hyclone）和1%青霉素/鏈霉素（美國Gibco 公司）的DMEM/高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞用不同濃度Ang Ⅱ（0、5、100、200、500、1 000 μmol/L）處理24 h或200 μmol/L Ang Ⅱ處理不同時(shí)間（0、6、12、24、48 h），通過Western blot 分析巨噬細(xì)胞中Map4k4 蛋白表達(dá)情況。為了敲低Map4k4 或過度表達(dá)Map4k4，用慢病毒攜帶靶向小鼠Map4k4的shRNA（GGACCAAGTTAGGTTCCAGCTAA，漢恒生物科技（上海）有限公司）（Lenti-shMap4k4）或含有啟動子Map4k4 上游區(qū)域的質(zhì)粒構(gòu)建物（漢恒生物科技（上海）有限公司）（Lenti-Map4k4）轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48 h。為了考察Map4k4 對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡影響，將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一部分考察Map4k4 敲低對巨噬細(xì)胞凋亡影響，細(xì)胞分為：Control 組、Ang Ⅱ組、shMap4k4 組、Ang Ⅱ+shMap4k4組。其中，Control組加入DMSO處理24 h；Ang Ⅱ組加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h；shMap4k4 組用shMap4k4 轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48 h，加入DMSO處理24 h；Ang Ⅱ+shMap4k4組用shMap4k4轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48 h，加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h。第二部分考察Map4k4 過表達(dá)對巨噬細(xì)胞凋亡影響，細(xì)胞分為：Control 組、Ang Ⅱ組、Map4k4 組、Ang Ⅱ+Map4k4 組。其中，Control 組加入DMSO 處理24 h；Ang Ⅱ組加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h；Map4k4組用Map4k4轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48 h，加入DMSO處理24 h；Ang Ⅱ+Map4k4組用Map4k4轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48 h，加入200 μmol/L Ang Ⅱ處理24 h。

1.3 Western blot 分析 使用RIPA 從巨噬細(xì)胞中提取總蛋白。并使用BCA 法（美國Pierce 公司）測定蛋白質(zhì)濃度。樣品（各20 μg）在10%SDS-PAGE凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore 公司）。膜用5%脫脂牛奶封閉后，與不同的一級抗體孵育過夜：Map4k4（英國Abcam 公司），抗切割半胱天冬酶3（c-Caspase3，美國CST 公司），抗Bcl-2（CST），抗Bax（CST）和β-actin（美國Sigma-Aldrich 公司）（稀釋度均為1∶1 000）。然后用PBS 清洗膜，并用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔二級抗體（Abcam；1∶10 000）在室溫下孵育1 h。洗滌后，PVDF 膜與ECL 底物一起孵育以在印跡上產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。利用Image J 進(jìn)行密度分析，定量蛋白質(zhì)條帶。

1.4 RNA分離和實(shí)時(shí)定量PCR 使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）從培養(yǎng)細(xì)胞中分離總RNA。純化的RNA 通過使用逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA 合成試劑盒（日本Takara 公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過SYBR Premix Ex TaqTMII（Takara）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析。使用標(biāo)準(zhǔn)的2-ΔΔCt（周期閾值）方法測定mRNAs 的相對表達(dá)水平。β-actin 作為內(nèi)源性對照用于標(biāo)準(zhǔn)化。本研究中的引物為：小鼠Map4k4：（正向）：5′-GAAGCAAGAGAGAGAGAGCAAGAG-3′（反向）：5′-CCTCGAGAGAGAGAGAGAG-3′；小鼠β-actin（正向）：5′-GTGACGTTGACATCCGTAAA-3′（反向）：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′。

1.5 組織病理學(xué)染色和免疫熒光分析 對所有小鼠，采集主動脈根部包埋在最佳切割溫度的化合物（OCT）中，然后連續(xù)切片成6 μm厚的切片。切片用蘇木精/伊紅（HE）、油紅O（Sigma）、Masson 染色（北京Solaibio公司）和抗α-SMA抗體（Abcam，1∶150）和抗F4/80 抗體（Abcam，1∶100）染色。油紅O 染色用于脂質(zhì)積累分析；Masson 染色用于膠原分析；α-肌動蛋白免疫熒光染色用于平滑肌細(xì)胞分析；F4/80染色用于巨噬細(xì)胞分析。切片通過F4/80和Map4k4一級抗體的雙重免疫熒光染色，并在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與特異性熒光標(biāo)記二級抗體孵育2 h。使用熒光倒置顯微鏡捕獲熒光信號，并使用Image J 對F4/80+Map4k4+細(xì)胞進(jìn)行量化。斑塊易損性指數(shù)=（巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)核心）陽性染色面積/（平滑肌細(xì)胞+膠原）陽性染色面積。

1.6 TUNEL 染色 采用原位TUNEL 試劑盒（瑞士Roche 公司）檢測AS 病變中的細(xì)胞凋亡。小鼠主動脈根部的F4/80+TUNEL+細(xì)胞首先用F4/80+一抗在37 ℃染色2 h，然后依次與FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體和TUNEL 反應(yīng)混合物在37 ℃孵育1 h。使用熒光倒置顯微鏡捕獲熒光信號，并使用Image J 進(jìn)行量化。

1.7 血漿AngⅡ水平分析 從小鼠眼眶靜脈收集血樣。根據(jù)小鼠外周血Ang ⅡELISA 檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）檢測血漿AngⅡ水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均由Graph Prism 5.0 進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組之間的比較采用Student′st檢驗(yàn)。多組比較采用單向方差分析和Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ加劇ApoE-/-小鼠AS 發(fā)展并促進(jìn)斑塊易損性 為了證實(shí)AngⅡ誘導(dǎo)的AngⅡ動脈粥樣硬化小鼠模型（Ang Ⅱ組小鼠），研究首先檢測了小鼠血漿Ang Ⅱ濃度，發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ組小鼠血漿Ang Ⅱ濃度較Control 組顯著升高（P＜0.01，圖1A）。與Control 組相比，Ang Ⅱ組小鼠主動脈根部的壞死核心大小顯著擴(kuò)大（P＜0.01，圖1B-D）。此外，Ang Ⅱ組小鼠顯示巨噬細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.01），但病變區(qū)域的膠原沉積減少（P＜0.01），平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01），表明存在易損斑塊表型（圖1E-J）。

圖1 Ang Ⅱ加劇ApoE-/-小鼠AS 的發(fā)展并促進(jìn)斑塊易損性Fig.1 Ang Ⅱaggravated the development of AS and promoted plaque vulnerability in ApoE-/-mice

2.2 AngⅡ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)外上調(diào)Map4k4 通過TUNEL 和F4/80 聯(lián)合染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ組小鼠主動脈根部中巨噬細(xì)胞的凋亡比例高于Control 組（P＜0.05，圖2A），并且AngⅡ組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞中Map4k4 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，圖2B）。與體內(nèi)結(jié)果一致，AngⅡ顯著增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Map4k4 的表達(dá)（P＜0.05），并在200 μmol/L Ang Ⅱ和處理24 h時(shí)達(dá)到峰值（圖2C）。

圖2 AngⅡ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)外上調(diào)Map4k4Fig.2 AngⅡinduced apoptosis of macrophages and up-regulated Map4k4 in vitro and in vivo

2.3 Map4k4介導(dǎo)AngⅡ處理的ApoE-/-小鼠AS病變的發(fā)展和易損斑塊的形成 為了評估AngⅡ存在時(shí)Map4k4對AS的影響，通過尾靜脈注射Lenti-Map4k4 shRNA 來抑制Map4k4 表達(dá)或Lenti-Map4k4 來誘導(dǎo)小鼠中Map4k4過度表達(dá)。通過實(shí)時(shí)PCR 檢測證實(shí)在主動脈中出現(xiàn)Map4k4 抑制或過表達(dá)（P＜0.05，圖3A）。各組小鼠血漿Ang Ⅱ濃度均在15 μmol/L以上，不受慢病毒注射的影響（圖3B）。與AngⅡ組小鼠相比，AngⅡ+shMap4k4 組小鼠的主動脈根部壞死核心大小顯著減少，但在Ang Ⅱ+Map4k4 組小鼠中顯著增加（P＜0.05，圖3C-E）。同時(shí)，AngⅡ+shMap4k4 組顯著降低了脂質(zhì)積累、巨噬細(xì)胞浸潤和斑塊易損指數(shù)（均P＜0.05），并增加了斑塊內(nèi)的膠原沉積和平滑肌細(xì)胞數(shù)量（均P＜0.05），而Ang Ⅱ+Map4k4 組的作用相反（圖3F-K）。

圖3 Map4k4 介導(dǎo)AngⅡ處理的ApoE-/-小鼠AS 病變的發(fā)展和易損斑塊的形成Fig.3 Map4k4 mediated the development of AS lesions and the formation of vulnerable plaques in AngⅡ-treated ApoE-/-mice

2.4 Map4k4 通過減少巨噬細(xì)胞凋亡促進(jìn)AngⅡAS 小鼠易損斑塊的形成 使用Map4k4 和F4/80共染色評估了Map4k4 在AS 斑塊巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AngⅡ組中Map4k4+F4/80+細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），修飾的慢病毒可以有效地敲低或上調(diào)Map4k4（P＜0.05，圖4A）。然后使用具有F4/80 共染色的TUNEL 檢測巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。與AngⅡ組小鼠相比，AngⅡ+Map4k4 組增加了TUNEL+F4/80+細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05）。而AngⅡ+shMap4k4 組沉默了Map4k4 會減少TUNEL+F4/80+細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05），見圖4B。

圖4 Map4k4 通過減少巨噬細(xì)胞凋亡促進(jìn)Ang ⅡAS 小鼠易損斑塊的形成（n=6）Fig.4 Map4k4 promoted the formation of vulnerable plaques in Ang ⅡAS mice by reducing macrophage apoptosis（n=6）

2.5 Map4k4 促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡 使用修飾的慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞中的Map4k4 敲低或過表達(dá)。Map4k4 敲低有效減弱了AngⅡ誘導(dǎo)的c-Caspase3、Bax 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），并增強(qiáng)了Bcl-2 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。而Map4k4 過表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了Ang Ⅱ的誘導(dǎo)作用（P＜0.05，圖5A-B）。

圖5 Map4k4 促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡（n=3）Fig.5 Map4k4 promoted Ang Ⅱ-induced apoptosis of mouse peritoneal macrophages（n=3）

3 討論

急性冠狀動脈綜合征是常見的臨床事件，會導(dǎo)致相當(dāng)大的即刻死亡和冠狀動脈意外發(fā)生。進(jìn)一步了解斑塊破裂的分子機(jī)制對于探索新的急性冠狀動脈綜合征治療靶點(diǎn)至關(guān)重要［11］。AngⅡ作為一種有效的促炎細(xì)胞因子，其通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖來促進(jìn)AS，但潛在機(jī)制仍未明確［12］。先前研究報(bào)道，AngⅡ通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的組蛋白甲基化和抑制膽固醇流出來促進(jìn)AS 的進(jìn)展［13］。觀察性研究表明，AngⅡ是急性心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。最近，急性冠脈綜合征隊(duì)列研究也證實(shí)了AngⅡ與斑塊進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)［14］。然而，沒有直接證據(jù)表明AngⅡ與巨噬細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以加速ApoE-/-小鼠AS 斑塊的進(jìn)展并促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性，包括更大的主動脈根部的病變面積和壞死核心，更多的巨噬細(xì)胞浸潤以及病變區(qū)域的膠原沉積和平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少。此外，TUNEL 染色表明巨噬細(xì)胞凋亡與AngⅡ誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠中不穩(wěn)定斑塊形成有關(guān)。最重要的是，AngⅡ上調(diào)了巨噬細(xì)胞中Map4k4 的表達(dá)。沉默Map4k4 可防止AngⅡ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和AS 中易損斑塊的形成，表明Map4k4 可能是AngⅡ誘導(dǎo)AS 的潛在治療靶點(diǎn)。

AS 是血管死亡的主要原因，通常由斑塊破裂引起，進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成和血管閉塞［15-16］。巨噬細(xì)胞凋亡是AS 斑塊發(fā)展的一個(gè)重要特征［17］。巨噬細(xì)胞凋亡極大地促進(jìn)了不穩(wěn)定的斑塊形成，并且隨著斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡的積累，壞死核心的形成加速，斑塊容易破裂［18-19］。最終可能會發(fā)生與急性動脈粥樣硬化血栓形成相關(guān)的血管疾病。研究表明，Map4k4 是一種促炎激酶，并且是介導(dǎo)多種細(xì)胞類型中TNF-α 的有害功能所必需的［20-21］。最近研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞Map4k4 可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子可促進(jìn)小鼠和人類AS的進(jìn)展［22］。因此，使用基因缺失策略敲低巨噬細(xì)胞中Map4k4表達(dá)可以改善AS［10］。本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ在體內(nèi)和體外均促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)Map4k4+F4/80+細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。通過沉默Map4k4會減少TUNEL+F4/80+細(xì)胞的數(shù)量，相應(yīng)的斑塊中脂質(zhì)積累、巨噬細(xì)胞浸潤和斑塊易損指數(shù)降低，并增加了斑塊內(nèi)的膠原沉積和平滑肌細(xì)胞數(shù)量。此外，敲低Ang Ⅱ處理的巨噬細(xì)胞中Map4k4表達(dá)可以抑制caspase-3 的激活，下調(diào)了促凋亡Bax 的表達(dá)并上調(diào)了抗凋亡Bcl-2 的表達(dá)?？傊?，Map4k4在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和易損AS斑塊的發(fā)展中起重要作用。但是，本研究沒有測試該調(diào)節(jié)中的其他凋亡途徑，仍需要在未來進(jìn)行探索。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ通過上調(diào)Map4k4 表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步參與AS 中易損斑塊的形成。Map4k4 可能是Ang Ⅱ誘導(dǎo)的AS 的潛在治療靶點(diǎn)。深入了解Map4k4 對易損斑塊形成的作用機(jī)制可能為預(yù)防急性冠狀動脈綜合征和不良心血管事件提供新的治療方法。