馮九庚，鄒樹峰,陳偉,2

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南昌 330006；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 201299）

創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury,TBI）的發(fā)病率逐年增長[1]，因神經(jīng)元功能缺失所致的功能障礙改變嚴重影響著患者的生存質(zhì)量[2]。近年來，納米樣隧道管（Tunneling Nanotubes,TnTs）已經(jīng)成為細胞間研究的熱點之一。盡管目前對于TnTs的形成尚不完全明確，有研究顯示哺乳動物的腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)因子2（Tumor Necrosis Factor-alpha Induced Protein2,TNFAIP2，又名Msec）蛋白為TnTs形成過程中不可或缺的蛋白[3-4]，并受腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factoralpha,TNF-α)調(diào)節(jié)，因此我們推測M-sec蛋白可以作為TnTs形成的標記蛋白。本文對TBI患者進行回顧性研究，收集TBI患者268例，動態(tài)檢測傷后血清TNF-α、M-sec蛋白含量的變化，傷后6個月采用蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）評價患者有無認知功能障礙，并比較多時間節(jié)點血清M-sec蛋白含量與MoCA評分的相關(guān)性。

1 研究對象

1.1研究組選入標準 明確的TBI病史，TBI后24小時內(nèi)入院；年齡16~65歲；均受過小學(xué)以上程度教育；病情穩(wěn)定，在急性期內(nèi)可耐受腰穿，后期可進行認知功能的測定。排除標準：既往有嚴重的TBI病史及其它顱內(nèi)疾病史；受傷前有反復(fù)腦卒中及癡呆表現(xiàn)；合并其它嚴重的多臟器損傷；既往有垂體和甲狀腺疾病、嚴重肝衰竭、糖尿病、惡性腫瘤等全身性疾病史；嚴重失語和意識障礙；死亡及失訪病例。共納入研究268例，男性181例，女性87例；年齡18~65歲，平均年齡（41.82±11.22）歲；初中文化程度78例，高中文化程度103例，大學(xué)及以上文化程度87例；受傷方式：車禍傷141例，打擊傷23例，墜落傷88例，跌傷12例；格拉斯哥昏迷評分（Glasgow Coma Score,GCS）3~8分27例，9~12分51例，13~15分190例。同時分別在三個醫(yī)院共選取100例常規(guī)體檢成年患者作為對照，且MoCA評分在正常范圍內(nèi)，其中男性70例，女性30例，年齡在18~65歲，平均年齡（40.38±10.66）歲；初中文化程度28例，高中文化程度38例，大學(xué)及以上文化程度34例。本研究經(jīng)過病人或其家屬的知情同意并自愿參加，上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查同意。兩組年齡、性別和文化程度比較無明顯差異（P>0.05）,具有可比性。

1.2認知功能的評估 本組患者在TBI后6個月由經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)的神經(jīng)外科及創(chuàng)傷中心醫(yī)師對其進行認知功能的測試。測試時間為北京時間下午14:00，最長時限為30分鐘。選用MoCA量表來評估患者認知功能，總分為30分，得分>26分提示存在認知功能障礙。比較認知功能障礙與無認知功能障礙患者的差異。

1.3 TNF-a、M-sec測定方法 研究組于傷后第1、3、5、7、14天清晨采集空腹血4 mL，4000 r/min×10 min，取上清液，-20℃保存待用。采用化學(xué)發(fā)光法分別測定血清TNF-α和M-sec含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），嚴格按照各自試劑盒（博士德生物，中國）的操作說明進行操作，酶標儀（TECAN，奧地利）在450 nm波長下測度吸光度值，通過標準曲線計算血清TNF-α、M-sec蛋白濃度，對照組早晨空腹采集靜脈血4 mL，同上方法保存和測定，分析血清TNF-α、M-sec蛋白動態(tài)變化與認知功能障礙的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，進行分析計量資料用(±s)表示，組間比較有采用設(shè)計兩樣本均數(shù)t檢驗，對有認知功能障礙患者與無認知功能障礙患者比較采用Mann-Whitney U檢驗。TBI后個時間點血清M-sec蛋白與MoCA意義評分采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBI后認知功能障礙情況 根據(jù)MoCA量表評估，研究組傷后6個月存在認知功能障礙108例，（40.29%），認知功能障礙病人在視空間與執(zhí)行、注意力與計算、語言能力、抽象能力及延遲記憶等方面差異明顯（P<0.05）,而在命名和定向力方面無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.2 TBI后血清TNF-α、M-sec蛋白動態(tài)變化TNF-α和M-sec蛋白在正常對照組組含量分別為(0.56±0.11)ng/mL和(54.25±8.66)ng/mL。TBI患者血清TNF-α和M-sec蛋白含量在TBI后隨著患者有無認知功能障礙而表達呈不同趨勢，在無認知功能障礙患者中，TBI后第1天TNF-α、M-sec表達明顯較對照組升高（P<0.05），且在傷后7 d內(nèi)都維持在較高水平（P<0.05），在傷后14 d降低至與正常對照組無明顯差異。而在TBI后有認知功能障礙組表現(xiàn)則不同，TNF-α、M-sec表達在傷后第1天則明顯降低，與正常組及無認知功能障礙組差異明顯（P<0.05），并在傷后第3天TNF-α、M-sec蛋白含量均降至最低水平，并與無認知功能障礙組差異明顯（P<0.05），TBI后第5、7天兩者的表達明顯回升，甚至明顯高于正常組（P<0.05），并與無認知功能障礙組無明顯差異（P>0.05），在傷后14天，有認知功能障礙組的兩者蛋白水平恢復(fù)到與無認知功能障礙組、正常對照組均無明顯差異（P>0.05），見表2，3。

2.3 TBI患者血清M-sec動態(tài)變化與認知功能障礙的相關(guān)性分析 將患者傷后6個月的MoCA評分與各時間點血清M-sec含量進行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，傷后第3天血清M-sec表達與MoCA評分相關(guān)性最為明顯（P<0.05），而傷后第5天Msec含量與MoCA評分則無明顯的相關(guān)性（P>0.05）。說明TBI患者急性期血清M-sec含量有助于預(yù)測患者傷后有無認知功能障礙的發(fā)生，而且在傷后第3天的血清M-sec值與認知功能相關(guān)系數(shù)最大，說明傷后第3天血清M-sec蛋白含量最能反應(yīng)認知功能的預(yù)后，見表4。

表1 有無認知功能障礙TBI患者Mo CA量表各認知領(lǐng)域評分比較

3 討論

TBI后的神經(jīng)元的治療是一個世界范圍內(nèi)的難點、熱點。星形膠質(zhì)細胞（Astrocyte）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞類型，除了支持、營養(yǎng)神經(jīng)元外，還參與調(diào)控神經(jīng)元的功能[5]。我們近期的研究結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細胞可能通過緩解神經(jīng)元的鈣超載從而產(chǎn)生保護作用[6]，但此過程的具體機制并不完全明確。我們前期針對于在星形膠質(zhì)細胞中高表達的縫隙連接蛋白阿爾法1（GJA1）蛋白進行了深入的研究，并已證明非磷酸化的GJA1蛋白在星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的保護中起著極為重要的作用[7-8]，由于神經(jīng)元的數(shù)量遠遠少于星形膠質(zhì)細胞，單純的相鄰星形膠質(zhì)細胞—神經(jīng)元間GJA1的數(shù)量及功能不足以維持星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的保護作用。因此，我們推測其它的細胞間直接連接方式在腦損傷后星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的保護中可能起著更為重要的作用。目前，在這方面與TBI的相關(guān)的研究較少。

15年前，細胞間的TnTs通道被首次提及,其直徑多在50~1000 nm,而長度一般在數(shù)微米到數(shù)百微米，可供較大分子量的物質(zhì)通過（>1.2kD）[9-10]。M-sec最初被稱為TNF-α誘導(dǎo)因子2，其功能尚不完全明確[11]。有研究顯示，M-sec可誘導(dǎo)細胞膜的F-肌動蛋白（F-actin）形成凸起，進而延展形成TNTs通道[12]，因此M-sec蛋白亦被稱為TnTs的標志蛋白[13]。當前與TNTs有關(guān)損傷后保護的研究也日漸增多，但目前多集中在與干細胞有關(guān)的損傷后修復(fù)方面[14-15]，且目前國內(nèi)外在此領(lǐng)域的研究目前僅局限在體外實驗中，尚未涉及到體內(nèi)及臨床領(lǐng)域。因此我們推測，星形膠質(zhì)細胞在TBI后與通過TnTs對神經(jīng)元起著更為廣泛的保護作用。基于該設(shè)想，我們通過本實驗發(fā)現(xiàn)，TBI后有認知功能障礙的患者在TBI后第1天血清TNF-α、M-sec蛋白表達明顯低于正常對照組，而在傷后3天降至最低，盡管其在傷后第5天明顯回升至與無認知功能障礙組無明顯差異，但仍無法逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元及其功能的損傷所致的認知功能障礙。而有趣的是，在TBI后無認知功能障礙患者血清TNF-a、Msec蛋白的表達則出現(xiàn)應(yīng)激性升高，并且在7天內(nèi)維持在一個相對較高的水平。針對于此現(xiàn)象分析，我們認為原因為（1）神經(jīng)元及神經(jīng)功能的損傷呈現(xiàn)不可逆性，尤其在急性期內(nèi)，如缺乏神經(jīng)元保護，則神經(jīng)元及神經(jīng)功能損傷則進一步明顯、（2）無認知功能障礙患者在TBI后，顱內(nèi)TNF-α等炎性代謝產(chǎn)物增多，TNF-α誘導(dǎo)M-sec表達升高，以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞建立更多的與神經(jīng)元的TnTs通道,以保護神經(jīng)元功能。同時大量產(chǎn)生的M-sec蛋白則通過受損的腦血屏障進入血液，導(dǎo)致血清中M-sec表達增高、（3）在有認知功能障礙的患者中，TNF-α表達升高延遲，導(dǎo)致在急性期內(nèi)誘導(dǎo)的M-sec蛋白表達降低，星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元保護性的TnTs構(gòu)建減少，損傷保護性效應(yīng)減弱，神經(jīng)元及神經(jīng)功能損傷相對明顯。

本研究中將患者TBI后6個月的MoCA量表評分與各時間點的M-sec蛋白含量進行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在TBI后1、3天（急性期）M-sec蛋白含量與MoCA評分正相關(guān)，而在亞急性期內(nèi)，M-sec蛋白含量則與MoCA評分無明顯相關(guān)性。這說明TBI急性期的血清M-sec蛋白含量的檢測可能有助于預(yù)測TBI患者傷后有無認知功能障礙發(fā)生，傷后第3天血清M-sec與MoCA相關(guān)系數(shù)R值最大，說明傷后第3天血清M-sec與認知功能的預(yù)后相關(guān)性最大。

表2 TBI患者血清TNF-α含量的變化（ng/mL）

表3 TBI患者血清M-s e c含量的變化（ng/mL）

表4 TBI患者血清M-s e c含量與Mo CA評分的Pe a rs on相關(guān)性分析

綜上所述，TBI患者在急性期內(nèi)的M-sec蛋白含量的降低與認知功能障礙的發(fā)生的相關(guān)性較大。對急性期內(nèi)的M-sec蛋白含量進行動態(tài)監(jiān)測，可能有助于了解星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的直接保護及隨后的神經(jīng)功能的保護的作用、早期預(yù)測TBI后神經(jīng)元、神經(jīng)功能損傷及評估認知功能障礙的程度及預(yù)后。不足之處在于，本研究病例數(shù)仍偏小，今后需進一步擴大臨床樣本，為TBI后神經(jīng)元、神經(jīng)功能的保護及認知功能障礙的預(yù)防、治療提供潛在的靶點。