李美雙，趙麗華，李榮鳳，*

1南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

腎臟疾病是最常見的疾病之一，全球約有8.5 億患者飽受急性或慢性腎衰竭的折磨［1］。目前由于透析設(shè)備以及腎臟供體的短缺，每年約有5 萬人死于腎衰竭［2］。腎臟透析療法雖然可以代替腎臟完成排泄功能，但是并不能代替腎臟行使內(nèi)分泌功能。腎臟移植雖然在一定程度上恢復(fù)腎臟功能，但也由于器官供應(yīng)的短缺和免疫抑制藥物的相關(guān)問題而受到阻礙，因此開發(fā)新的低免疫原性的器官具有較大的應(yīng)用前景。利用患者來源的干細(xì)胞通過囊胚互補(bǔ)技術(shù)，有望在大動(dòng)物體內(nèi)再生人源化的腎臟器官。囊胚互補(bǔ)首先利用基因編輯技術(shù)在胚胎發(fā)育早期階段敲除決定某個(gè)器官發(fā)育的關(guān)鍵基因，然后待胚胎發(fā)育到囊胚階段后將多能干細(xì)胞注入到囊胚腔內(nèi)，干細(xì)胞將參入胚胎形成嵌合體，并優(yōu)先去形成由于關(guān)鍵基因敲除導(dǎo)致的缺失的器官。Chen 等［4］將正常小鼠胚胎干細(xì)胞注射到來自rag-2缺陷小鼠的囊胚中，獲得了其成熟B 細(xì)胞和T 細(xì)胞均來源于供體干細(xì)胞的嵌合小鼠。此后，研究者們對(duì)囊胚互補(bǔ)的研究逐漸深入，胸腺［5］、甲狀腺［6］、肺［6-7］等臟器的種內(nèi)囊胚互補(bǔ)均已出現(xiàn)。2010 年Kobayashi 等［8］利用囊胚互補(bǔ)技術(shù)在小鼠體內(nèi)生成大鼠胰腺，論證了利用囊胚互補(bǔ)進(jìn)行異種器官生成的可行性。這提示研究者去探索在人類以外的物種中產(chǎn)生具有功能的人類器官。考慮到在解剖學(xué)、生理學(xué)等方面與人類的相似之處，豬被人認(rèn)為是再生人源性器官的合適載體［9］。

CRISPR 即規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列，最早于1987年由Ishino在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)。研究者們將CRISPR 與Ⅱ型CAS 蛋白相結(jié)合，使其迅速成為應(yīng)用最廣泛的基因編輯工具［10］。體細(xì)胞核移植與CRISPR/Cas9 的聯(lián)合應(yīng)用已廣泛用于大動(dòng)物基因編輯模型的構(gòu)建［11］。例如，2017 年Zhang 等［12］將C3基因敲除，產(chǎn)生了血漿中C3蛋白缺乏的豬模型；2020年Fischer等［13］獲得了GGTA1/CMAH/B4GALNT2三基因敲除的豬模型用于異種免疫排斥的研究。這說明結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)與CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得腎臟發(fā)育缺陷豬模型的可能性。2013 年Matsunari等［14］首先獲得了Pdx1-/-胰腺發(fā)育缺陷的豬模型，隨后他們將帶有熒光標(biāo)記的另一品系的豬胚胎卵裂球注入Pdx1-/-囊胚中，獲得了來源于熒光標(biāo)記細(xì)胞的具有正常組織特征及功能的外源胰腺。2020年Matsunari 等［15］又在HHEX-/-肝臟缺陷的豬模型中通過種內(nèi)囊胚互補(bǔ)獲得了肝臟發(fā)育正常的豬胎兒，這證明了豬進(jìn)行種內(nèi)囊胚互補(bǔ)的可能性。此外，2017 年Wu 等［16］提出人類干細(xì)胞經(jīng)囊胚互補(bǔ)可移植并分化為豬胚胎中的多個(gè)譜系。2020年Das等［17］將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射入ETV-/-豬囊胚中，其后代的血管內(nèi)皮細(xì)胞均來源于人類細(xì)胞。因此，本研究認(rèn)為通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得腎臟器官發(fā)育缺陷的豬模型，并將其與囊胚互補(bǔ)技術(shù)結(jié)合，或許可以實(shí)現(xiàn)在豬體內(nèi)再生人的腎臟器官。

Spalt 樣轉(zhuǎn)錄因子1（spalt like transcription factor1，SALL1）在腎臟發(fā)生過程中極為重要。Sall1基因主要表達(dá)于輸尿管芽周圍的生后腎原基內(nèi)，參與誘導(dǎo)輸尿管芽反復(fù)分支形成輸尿管、腎盂、腎盞和集合小管的腎臟發(fā)育過程。2001 年Nishinakamura等［18］研究發(fā)現(xiàn)Sall1基因的純合缺失小鼠在出生后24 h 內(nèi)死亡，表現(xiàn)出腎發(fā)育不全或嚴(yán)重發(fā)育不良。2019 年Goto 等［19］利用囊胚互補(bǔ)技術(shù)將大鼠胚胎干細(xì)胞注射到Sall1敲除小鼠囊胚內(nèi)，嵌合體比例為69.1%，這提示通過敲除豬Sall1基因獲得腎臟發(fā)育空位，從而進(jìn)行人豬異種囊胚互補(bǔ)的可能性。

關(guān)于豬腎臟發(fā)育不良模型，雖然Watanabe等［20］進(jìn)行了研究，但其獲得的動(dòng)物模型依然存在一定的局限性，目前為止尚未見到腎臟完全缺失的豬模型的報(bào)道。本研究通過對(duì)人、豬、鼠SALL1 蛋白的同源性進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了豬與人SALL1蛋白的相似性，同時(shí)通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)巴馬小型豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行Sall1基因敲除，為獲得腎缺失豬模型以及研究Sall1基因在豬腎臟發(fā)育過程中的作用提供研究材料，并為下一步獲得腎缺失模型以及進(jìn)行人源性干細(xì)胞囊胚互補(bǔ)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

35 d 豬胎兒成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并培養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)液、DPBS、0.25%Trypsin-EDTA、G418 和Penn/Strep solution（Gibco 公司，美國(guó)），胎牛血清（Sigma 公司，美國(guó)），PX330 骨架質(zhì)粒（Addgene公司，美國(guó)），BbsⅠ核酸內(nèi)切酶、Quick Ligase連接酶（New England Biolabs 公司，美國(guó)）；FastPure Gel DNA Extraction mini Kit（南京Vazyme 公司），無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（北京TIANGEN 公司），P3 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒（Lonza 公司，德國(guó)），DH5α感受態(tài)、pMD 18T載體（TaKaRa公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 人、豬、鼠SALL1蛋白的生物信息學(xué)分析

下 載NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）中所提供的人、豬、鼠SALL1蛋白的氨基酸序列，使用DNAMAN 軟件比對(duì)分析人與豬SALL1 氨基酸的相似度及人與鼠SALL1氨基酸的相似度；使用在線網(wǎng)站SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）比對(duì)分析人、豬、鼠SALL1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的比例；使用在線網(wǎng)站SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)人、豬、鼠SALL1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，再使用PyMOL 軟件比較人與豬及人與鼠SALL1 蛋白三維結(jié)構(gòu)的相似度；使用NCBI中CD-search工具比對(duì)人、豬、鼠SALL1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 sgRNA的設(shè)計(jì)與CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI 中所提供的豬Sall1基因序列（Gene ID：100519899），在第1外顯子兩端設(shè)計(jì)可用于擴(kuò)增Sall1基因的PCR 引物并送至南京金斯瑞生物公司合成。以巴馬小型豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblast，PFF）基因組DNA 為PCR 模板，反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s，64 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。通過瓊脂糖凝膠電泳獲得單一條帶后將產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序，確定巴馬小型豬中Sall1基因的具體序列。根據(jù)測(cè)序獲得的Sall1基因序列，利用CRISPR 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：//crispor.tefor.net/），遵循靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則（5′端為G，3′端為PAM序列，即NGG）選擇合適的靶點(diǎn)位置，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為20 bp的sgRNA 序列并在5′端進(jìn)行磷酸化修飾。

CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建由PX330 載體線性化、引物退火、PX330 線性化載體與退火引物連接等步驟組成。首先使用BbsⅠ核酸內(nèi)切酶酶切PX330 質(zhì)粒使其線性化，同時(shí)將合成的5′磷酸化的sgRNA 序列于37 ℃孵育30 min，95 ℃孵育5 min，然后將其以5 ℃/min 的速率將溫度降至25 ℃。再使用Quick Ligase連接酶將已線性化的PX330質(zhì)粒與退火引物連接，反應(yīng)條件為25 ℃連接10 min。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，挑取單菌落保存并送測(cè)序公司檢測(cè)sgRNA 是否成功連入PX330質(zhì)粒，測(cè)序引物為：5′-ACTATCATATGCTTACCGTAAC-3′。經(jīng)測(cè)序分析后選擇連接成功的菌液使用大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.3Sall1基因PX330-sgRNA載體打靶效率驗(yàn)證

使用DMEM 培養(yǎng)基（含15%胎牛血清）于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原代PFF 細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，0.05%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后取1×106個(gè)細(xì)胞，按照P3 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，利用程序EN150，將5 μgSall1-PX330-sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。培養(yǎng)48 h 后提取細(xì)胞基因組。PCR 擴(kuò)增打靶區(qū)域后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化DNA，并用測(cè)序分析方法檢測(cè)sgRNA的打靶效率。首先，PCR 擴(kuò)增打靶區(qū)域基因組后送至南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，PCR 引物和反應(yīng)條件同1.2.2。然后，以野生型細(xì)胞的測(cè)序結(jié)果為對(duì)照，利用在線分析軟件（https：//tider.deskgen.com/）分析打靶載體的效率。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和單克隆細(xì)胞的篩選鑒定

使用DMEM 培養(yǎng)基（含15%胎牛血清）于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原代PFF 細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，0.05%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。將8 μg 的Sall1-PX330-sgRNA 打靶載體與1 μg 的Td-tomato（G418抗性）質(zhì)粒混勻后按照P3細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒，使用程序EN150進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染完成后將細(xì)胞平均分至30個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24 h后將培養(yǎng)液換為含有濃度為1 mg/mL 的G418 培養(yǎng)基進(jìn)行藥物篩選，每3 d更換1次液體。

藥篩至未轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)，將G418 濃度調(diào)整至500 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d 至單克隆細(xì)胞形成。用克隆環(huán)挑取狀態(tài)較好的單克隆細(xì)胞至24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后留取30%于原培養(yǎng)板提基因組，70%傳代至6 孔板中至細(xì)胞長(zhǎng)滿后凍存?zhèn)溆谩?/p>

使用細(xì)胞裂解液NP40裂解細(xì)胞提取基因組DNA并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，裂解反應(yīng)條件為：55 ℃60 min，95 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物測(cè)序后比對(duì)序列，選擇突變的細(xì)胞基因組經(jīng)PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠純化。將純化的基因組DNA 與pMD18-T 載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，每板挑選12 個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與野生型比對(duì)后確定Sall1基因敲除細(xì)胞系。

2 結(jié)果

2.1 人、豬、鼠SALL1 氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果

使用DNAMAN 進(jìn)行氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)：人與豬SALL1氨基酸的相似度為92.46%，人與鼠SALL1氨基酸的相似度為90.19%。使用SOPMA在線網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)：人SALL1 蛋白的α螺旋占比為23.79%，β 轉(zhuǎn)角占比為4.53%，拓展鏈占比為13.44%，無規(guī)卷曲占比為58.23%；豬SALL1蛋白的α螺旋占比為23.23%，β轉(zhuǎn)角占比為4.30%，拓展鏈占比為13.20%，無規(guī)卷曲占比為59.28%；鼠SALL1蛋白的α螺旋占比為22.98%，β轉(zhuǎn)角占比為3.85%，拓展鏈占比為11.87%，無規(guī)卷曲占比為61.30%（圖1）。使用PyMOL 軟件進(jìn)行SALL1 蛋白三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：人與豬三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比時(shí)均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）為0.155，人與鼠三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比時(shí)RMSD 值為12.827（圖2）。使用CD-search 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)：人、豬SALL1 蛋白都具有SUF4-like、SUF4-like super family、zf-H2C2-2、zf-C2H2 4種結(jié)構(gòu)域，而鼠SALL1蛋白具有SUF4-like、SUF4 -like super family、zf -H2C2 -2、zf -C2H2、COG5048這5種結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖1 人、豬、鼠SALL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成Figure 1 Secondary structural composition of human，pig and mouse SALL1 protein

圖2 人與豬、人與鼠SALL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)比較Figure 2 Tertiary structure prediction of human/pig and human/mouse SALL1 protein

圖3 人、豬、鼠SALL1蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ菷igure 3 Comparison of human，pig and mouse SALL1 protein domains

2.2 CRISPR/Cas9敲除位點(diǎn)選擇及打靶載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI 中所提供的豬Sall1基因序列，在其兩端設(shè)計(jì)擴(kuò)增Sall1基因的PCR 引物（Sall1-F：5′-AACCGCACCACTAAGAGCAAGGAT-3′；Sall1-R：5′-AAGGGTTGGCAGATGTTCGTAAAG-3′），以豬PFF 基因組為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到Sall1基因的單一明亮電泳條帶（圖4），同時(shí)將其PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果證明其序列與NCBI 中提供的序列一致。

圖4 Sall1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳Figure 4 The results of PCR amplification products of Sall1

選取Sall1基因第1 外顯子作為CRISPR/Cas9作用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA（圖5），并在其兩端加上可與BbsⅠ酶切位點(diǎn)相連接的黏性末端合成相應(yīng)的Oligo（Sall1 -sgRNA -F：5′ -CACCGAACCTCTCTACCTCAACTCG-3′；Sall1-sgRNA-R：5′-AAACCGAGTTGAGGTAGAGAGGTTC-3′），將使用BbsⅠ酶切后的PX330質(zhì)粒與退火后的Oligo連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)后挑取單克隆菌落送至公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證明PX330成功與sgRNA連接（圖6）。

圖5 Sall1基因sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)模式圖Figure 5 The pattern diagram of Sall1 gene knockout

圖6 重組載體測(cè)序驗(yàn)證Figure 6 Verification of recombinant vector via sequencing

2.3 Sall1基因CRISPR/Cas9打靶載體效率驗(yàn)證

將重組打靶載體PX330-sgRNA 轉(zhuǎn)染至PFF 后，提取細(xì)胞基因組。使用PCR 擴(kuò)增其基因組后送至生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明PX330-sgRNA的打靶效率為51.6%。

2.4 Sall1基因敲除細(xì)胞系的制備及鑒定

將PX330-sgRNA 打靶載體與Td-tomato（G418抗性）質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染原代PFF 后，經(jīng)G418 藥篩獲得33 個(gè)單克隆細(xì)胞系。TA 克隆測(cè)定具體序列，共獲得23 個(gè)Sall1基因敲除的細(xì)胞系，敲除效率為69.7%。其中Sall1雙等位基因敲除的細(xì)胞系16 個(gè)（主要敲除形式見表1），敲除效率為48.5%。

表1 Sall1-/-細(xì)胞系的主要敲除形式Table 1 The knocking-out modalities of Sall1-/-cell line

3 討論

哺乳動(dòng)物胚胎腎臟發(fā)生十分復(fù)雜，可分為前腎、中腎、后腎3個(gè)階段。前腎和中腎在腎臟發(fā)生過程中逐漸退化，后腎最終發(fā)育為永久腎。胎兒發(fā)育晚期輸尿管芽侵入后腎間質(zhì)，隨后這兩種組織相互誘導(dǎo)共同分化促使后腎的發(fā)生。研究已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)后腎發(fā)生至關(guān)重要的基因，主要包括Sall1、Six1、Gdnf、Six4、Eya1等。SALL1蛋白在S形體、逗號(hào)形小體、腎小管和足細(xì)胞等間充質(zhì)衍生結(jié)構(gòu)中大量表達(dá)。研究表明人類Sall1基因突變將會(huì)導(dǎo)致一種與多器官發(fā)育缺陷相關(guān)的常染色體顯性遺傳病，即Townes-Brocks 綜合征，其可表現(xiàn)為腎發(fā)育不全或腎缺陷［21］。Sall1基因敲除的純合子小鼠表現(xiàn)出輸尿管芽生長(zhǎng)及分支受損［22］，這說明Sall1基因?qū)竽I發(fā)育中輸尿管芽的侵襲作用至關(guān)重要。

與嚙齒類動(dòng)物相比，豬的組織形態(tài)與生理和人更為相似［23］。同時(shí)，與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比，豬具有廣泛的可用性、優(yōu)良的育種潛力和較短的生殖成熟期［23］。本研究利用生物信息技術(shù)分析人、豬、鼠SALL1蛋白的氨基酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)豬SALL1蛋白與人SALL1蛋白具有高度同源性。由此本文認(rèn)為，制備Sall1基因敲除的豬PFF細(xì)胞系，以獲得腎臟缺失的豬模型，使下一步通過豬Sall1基因敲除囊胚和人干細(xì)胞互補(bǔ)在豬體內(nèi)再生人源化腎臟成為可能。

早期傳統(tǒng)的基因敲除方法基于同源重組，其用途也主要局限于小鼠模型的開發(fā)［24］。2013 年CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的問世極大地促進(jìn)了大動(dòng)物基因編輯模型的發(fā)展。本課題組在前期研究中已成功構(gòu)建多種基因敲除的豬模型，如C3-/-、Six1-/-和Six1-/-/Six4-/-等基因敲除克隆豬［12，25］，這驗(yàn)證了CRISPR/Cas9在大動(dòng)物基因編輯模型構(gòu)建中的可行性與便捷性。本研究首先通過測(cè)序檢測(cè)用于基因編輯的Sall1-PX330-sgRNA 打靶載體的敲除效率，隨后將其與G418抗性的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入豬PFF細(xì)胞系中。通過藥物篩選共獲得33 個(gè)單克隆細(xì)胞系，經(jīng)過多重鑒定后發(fā)現(xiàn)共有23 個(gè)Sall1單等位基因和雙等位基因敲除的細(xì)胞系，其敲除效率高達(dá)69.7%，而其中雙等位基因敲除的細(xì)胞系有16個(gè)，其敲除效率為48.5%。本研究結(jié)果顯示利用CRISPR/Cas9 技術(shù)制備Sall1基因敲除的豬PFF 細(xì)胞系具有高效性與可實(shí)施性。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法驗(yàn)證了人與豬SALL1 蛋白較高的同源性。同時(shí)構(gòu)建了可用于Sall1基因敲除的CRISPR/Cas9打靶載體，并成功獲得了Sall1雙等位基因敲除的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系可為構(gòu)建豬腎臟缺失模型提供供體細(xì)胞，為探究Sall1基因在豬腎臟發(fā)育過程中的作用提供前期基礎(chǔ)，并為在異種動(dòng)物體內(nèi)再生人源化腎臟提供理論依據(jù)。