魏志豪 劉洪超 史康克 張 雨 李佳瓊

河南科技大學(xué)教學(xué)醫(yī)院 洛陽(yáng)新區(qū)人民醫(yī)院病理科，河南省洛陽(yáng)市 471023

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma，GBM)是人類(lèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤，以腫瘤細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)為主要特征，進(jìn)展迅速。近年來(lái)雖然手術(shù)、放化療技術(shù)得到了長(zhǎng)足發(fā)展，但GBM患者的預(yù)后仍沒(méi)有明顯改善，其5年生存率不足10%[1]。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是目前治療GBM的一線化療藥物。TMZ是一種新型口服烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥物，其優(yōu)點(diǎn)是具有較寬的抗腫瘤譜、易于透過(guò)血腦屏障、與其他藥物沒(méi)有疊加毒性等。目前認(rèn)為DNA甲基化和錯(cuò)配修復(fù)失敗是TMZ細(xì)胞毒性的主要機(jī)制[2]。然而臨床研究表明TMZ對(duì)GBM的治療有效率卻只有45%左右，腦膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的最主要原因[3-4]。本研究從基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)中下載TMZ處理裸鼠顱內(nèi)移植瘤的芯片數(shù)據(jù)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索TMZ對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因表達(dá)譜的影響，為深入研究TMZ細(xì)胞毒性機(jī)制和耐藥機(jī)制提供參考依據(jù)，為膠質(zhì)瘤的治療提供有效的新方案。

1 材料與方法

1.1 材料 數(shù)據(jù)來(lái)源：從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE47809，該數(shù)據(jù)集共包含7個(gè)樣品，其中4個(gè)為T(mén)MZ處理組腦腫瘤組織，其余3個(gè)是未處理組腦腫瘤組織。

實(shí)驗(yàn)方案：先采用干細(xì)胞培養(yǎng)液(神經(jīng)培養(yǎng)基中加入B27添加物、30ng/ml表皮生長(zhǎng)因子和30ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤神經(jīng)球(Glio6)，然后利用立體定向注射法將體外培養(yǎng)的神經(jīng)球(含5×105細(xì)胞)注入雌性裸鼠右側(cè)尾狀核，構(gòu)建裸鼠顱內(nèi)移植瘤模型。細(xì)胞移植后45d，其中4只裸鼠灌胃給予TMZ，其余3只裸鼠灌胃給予等體積溶媒，連續(xù)5d。細(xì)胞移植后75d，切除腦部腫瘤組織，采用MirVana分離試劑盒提取總RNA，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄譜檢測(cè)。芯片檢測(cè)平臺(tái)為GPL570平臺(tái)，即Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 差異表達(dá)基因篩選 將GSE47809數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入GEO2R在線工具，定義實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。GEO2R首先采用GEOquery R軟件包將GEO數(shù)據(jù)解析成R數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，然后運(yùn)用limma軟件包統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平[5]。差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGs)的篩選條件為：P<0.05，組別差異倍數(shù)≥2倍。

1.3 基因本體富集分析 基因本體(Gene Ontology，GO)是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類(lèi)系統(tǒng)，對(duì)基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行限定和描述。本研究把篩選出的差異基因向GO數(shù)據(jù)庫(kù)映射，計(jì)算出每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的基因數(shù)目，利用Fisher精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)富集水平，并采用Benjamini-Hochberg方法控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)，顯著富集GO條目的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，F(xiàn)DR<0.05。

1.4 通路富集分析 本研究基于京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Fisher檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)DEGs在各個(gè)通路中的富集程度，以P<0.05為閾值篩選與整個(gè)基因組背景相比，在差異基因中顯著性富集的信號(hào)通路。

1.5 互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)輸入的差異表達(dá)譜數(shù)據(jù)，計(jì)算出各基因間的相關(guān)系數(shù)矩陣，借鑒數(shù)據(jù)所具有的無(wú)標(biāo)度性質(zhì)，通過(guò)基因間的相關(guān)系數(shù)擬合基因的無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。另外以通路為單位，運(yùn)用圖論的方法將顯著性通路基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的相互作用關(guān)系構(gòu)建通路互作網(wǎng)絡(luò)，分析顯著富集通路之間的傳導(dǎo)關(guān)系[6]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果 以未給予TMZ處理的顱內(nèi)移植瘤組織作為對(duì)照組，給予TMZ處理的移植瘤組織作為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)篩選條件P<0.05，差異倍數(shù)≥2倍，共篩選出1 936個(gè)DGEs，其中上調(diào)基因1 031個(gè)，下調(diào)基因905個(gè)，部分差異基因如表1所示。

表1 部分差異表達(dá)基因列表

2.2 GO功能富集分析 對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋后發(fā)現(xiàn)，顯著富集的分子功能主要集中于蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞骨架結(jié)合、蛋白激酶活性、DNA結(jié)合、金屬離子結(jié)合等；顯著富集的生物學(xué)過(guò)程主要包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期停滯和DNA復(fù)制等，富集水平最顯著的前20個(gè)條目列于表2。

表2 差異基因基因本體富集分析

2.3 通路富集分析 將差異基因向KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)映射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、Hippo信號(hào)通路、P53通路等79個(gè)通路顯著富集，富集水平最顯著的前20個(gè)列于表3。

2.4 互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中信號(hào)通路的上下游關(guān)系，構(gòu)建顯著富集通路之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖如圖1所示，圓點(diǎn)大小代表degree值，圓點(diǎn)越大，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。由通路互作網(wǎng)絡(luò)圖可知，核心通路包括MAPK信號(hào)通路(degree=27)、細(xì)胞凋亡(degree=21)、腫瘤通路(degree=19)和細(xì)胞周期(degree=18)。另外基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心基因包括PI3KCD、AKT3、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、蛋白磷酸酶1催化亞基β(PPP1CB)、磷脂酰肌醇5-激酶1α(PIP5K1A)、輔肌動(dòng)蛋白α1(ACTN1)。

3 討論

TMZ細(xì)胞毒性被認(rèn)為是對(duì)DNA的甲基化，甲基化主要發(fā)生在鳥(niǎo)嘌呤的N7和O6位置上。DNA復(fù)制過(guò)程中，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)雖能識(shí)別錯(cuò)誤配對(duì)的堿基對(duì)，但不能為O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤找到配對(duì)堿基，導(dǎo)致子鏈DNA缺口形成。缺口隨細(xì)胞分裂而逐漸積累，最終阻礙復(fù)制啟動(dòng)，從而使細(xì)胞停滯在G2/M期進(jìn)而發(fā)生凋亡。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)能與鳥(niǎo)嘌呤6位氧上的烷基化合物結(jié)合，將烷基轉(zhuǎn)移到MGMT第145號(hào)半胱胺酸活性位上，使烷基化的鳥(niǎo)嘌呤被還原，錯(cuò)配修復(fù)途徑的蛋白復(fù)合物因缺陷而導(dǎo)致不能識(shí)別錯(cuò)配，從而使細(xì)胞容忍甲基化存在，避免子鏈DNA缺口出現(xiàn)，導(dǎo)致TMZ耐藥性[7]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)生TMZ耐藥性不是由單一因素影響導(dǎo)致的，主要包括DNA損傷修復(fù)，促癌基因表達(dá)，化療藥物刺激后機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)等方面[8-9]。

表3 差異基因通路富集分析

圖1 通路相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究對(duì)TMZ處理組和未處理組腦腫瘤組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析，共篩選出1 936個(gè)差異基因，富集分析表明這些差異基因主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期停滯和DNA復(fù)制等生物過(guò)程，參與MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、P53信號(hào)通路等。TMZ處理后GBM組織中PIK3CD、AKT3等基因表達(dá)下調(diào)，EGFR、PPP1CB、ACTN1等基因表達(dá)上調(diào)，引起代謝通路和信號(hào)通路變化，阻滯DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)其凋亡。網(wǎng)絡(luò)分析挖掘出的核心基因和關(guān)鍵通路可能是TMZ抑制GBM的潛在靶點(diǎn)，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，替莫唑胺引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因轉(zhuǎn)錄譜發(fā)生明顯改變，主要涉及細(xì)胞周期阻滯、凋亡誘導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等生物過(guò)程和信號(hào)通路，為深入研究TMZ細(xì)胞毒性機(jī)制和耐藥機(jī)制提供了參考，也為指導(dǎo)臨床個(gè)體化應(yīng)用以及開(kāi)發(fā)新型靶向治療提供基礎(chǔ)。