廖曉捷 于越乾 王真真 孫樂樂 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院)，山東省皮膚病性病防治研究所，山東濟南，250022

遺傳性大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa，EB)是一種罕見且嚴重的機械性皮膚病，在新生兒中的發(fā)病率約為19/106、患病率約為11/106，患者以皮膚或黏膜脆性增加、摩擦或創(chuàng)傷后水皰、大皰的形成為主要臨床特征[1]。我們對2例EB患者進行調(diào)查，應用全外顯子組測序技術(shù)進行分析，再用Sanger測序驗證結(jié)果，為臨床診斷提供確切的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院門診收集2例EB患者。散發(fā)患者1：女，19歲。四肢出現(xiàn)淡粉紅色或褐色的丘疹、結(jié)節(jié)3年，伴劇烈瘙癢，表面破潰，部分皮損愈合后可見結(jié)痂和萎縮性瘢痕。患者無類似疾病家族史，其父母非近親結(jié)婚。皮膚科檢查：雙前臂、雙脛前和雙足背可見大小不等的淡粉紅色或褐色的丘疹、結(jié)節(jié)和結(jié)痂，未見明顯水皰，無血皰(圖1a)；雙足第一趾甲增厚萎縮(圖1b)，口腔黏膜未受累。皮膚組織病理示：表皮角化過度、灶性角化不全，表皮下裂隙，真皮淺層血管、纖維組織增生，血管周圍輕度單一核細胞浸潤，符合大皰性表皮松解癥。結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)和皮膚組織病理檢查，臨床診斷為EB。

圖1 散發(fā)患者1臨床照片 雙脛前紫紅色結(jié)節(jié)、丘疹，部分結(jié)痂(1a)，雙足第一趾甲增厚萎縮、營養(yǎng)不良(1b)

家系患者2：先證者,男，1歲。自出生雙手足背出現(xiàn)白色粟丘疹、水皰，伴右手中指指甲脫落(圖2a)。先證者足月生產(chǎn)，一般情況好，父母非近親婚配。皮膚科檢查：雙手足背白色粟丘疹、水皰伴皮膚破損，右手中指指甲脫落，無自覺癥狀，無血皰，手掌、肘部、膝部等摩擦部位和口腔黏膜均未受累。其父有類似病史，自幼雙手足背水皰，摩擦后加重，隨年齡增長水皰逐漸減輕，但出現(xiàn)雙脛前粟丘疹，伴劇烈瘙癢，可見糜爛結(jié)痂，愈合后留有白色萎縮性瘢痕；雙手足指趾甲均變薄、渾濁，遠端缺損(圖2b)，未曾出現(xiàn)過手掌、足趾等部位的緊張性大皰。結(jié)合病史及皮損表現(xiàn)，臨床擬診為EB。先證者幼小，其父母拒絕對其行皮膚組織病理檢查和抽血檢查，為進一步明確診斷，對患兒父親進行全基因組外顯子測序。

2a：先證者雙手白色粟丘疹、水皰，伴右手中指指甲脫落;2b，2c：其父雙手足白色粟丘疹，雙手足指趾甲均變薄、渾濁，遠端缺損

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 經(jīng)本院倫理委員會批準，經(jīng)過家系成員的知情同意并簽字后，采集患者及其父母的外周血5 mL，EDTA抗凝，采用全自動核酸提取儀提取所有標本DNA，使用核酸濃度測定儀NanoDrop2000對標本 DNA的含量及純度進行測定，并將其標化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 變異篩選 將散發(fā)患者1、家系2先證者父親的外周血 DNA進行全基因組外顯子測序，首先使用AIExome Enrichment Kit V4試劑盒進行捕獲實驗和構(gòu)建文庫，基因組文庫經(jīng)過質(zhì)量檢測合格后通過 Illumina HiSeq 6000 平臺完成高通量測序。測序原始數(shù)據(jù)采用BWA 軟件與參考基因組(hg19)進行比對，比對好的數(shù)據(jù)用GATK軟件進行變異位點的尋找，尋找的位點均通過Annovar軟件評估變異的影響并進行注釋。

1.2.3 Sanger測序驗證 根據(jù)全基因組外顯子測序篩選出的致病基因突變位點，通過NCBI數(shù)據(jù)庫查取突變基因的外顯子序列，應用Primer5.0軟件設計引物，對收集的外周血DNA樣本進行突變位點的Sanger測序驗證。PCR反應條件: 預變性94℃ 10 min、變形 94℃ 30 s、退火55℃ 45 s、延伸 72℃ 10 min，共35個循環(huán)之后72℃延伸10 min；取PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段切膠純化后用ABI 3500Xl Dx Genetic Analyzer測序儀進行檢測。

1.2.4 突變分析 所有測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast數(shù)據(jù)庫、Chromas軟件與相應的突變基因參考序列進行分析比對，檢索Pubmed和萬方數(shù)據(jù)庫至今發(fā)表的關(guān)于本研究中突變位點的文章。

2 結(jié)果

2.1 臨床調(diào)查 調(diào)查患者的臨床資料，其中類似患者2例，分別為散發(fā)患者1和家系2先證者的父親，臨床癥狀均相似：均表現(xiàn)為雙脛前癢疹樣改變，伴有輕度甲營養(yǎng)不良；但發(fā)病年齡不同，前者是近成年才出現(xiàn)皮損，后者是出生后即有皮損，且水皰發(fā)生于四肢伸側(cè)，尤其是趾指關(guān)節(jié)面，愈后留有白色丘疹狀瘢痕，隨年齡增長，水皰性皮損逐漸減少，而出現(xiàn)癢疹樣損害。其余家屬均無相關(guān)臨床表現(xiàn)。

2.2 基因變異分析結(jié)果 散發(fā)患者1的COL7A1基因73號外顯子存在c.6082G>A雜合，導致編碼蛋白質(zhì)的第2028位氨基酸由甘氨酸變成精氨酸(p.G2028R)，其父母均未攜帶該突變(圖3)。該突變已在顯性營養(yǎng)不良型EB中報道過[2]，屬于致病突變。

圖3 散發(fā)患者1及其父母測序結(jié)果 散發(fā)患者1攜帶COL7A1基因c.6082G>A突變，其父母均未攜帶此突變 圖4 家系2先證者及其父母測序結(jié)果 先證者及其父親同時攜帶COL7A1基因c.6235G>A突變和KRT5基因c.499G>A突變，母親未攜帶這2個基因突變

家系2先證者父親的全外顯子組測序結(jié)果顯示雜合2個基因的錯義突變，即COL7A1基因c.6235G>A(p.G2079R)突變和KRT5基因 c.499G>A(p.E167K)突變，經(jīng)Sanger測序先證者也攜帶這2個突變，其母親無這些突變(圖4)，證實先證者這2個基因的突變均來自其父親。本研究中COL7A1基因和KRT5基因的錯義突變分別在顯性營養(yǎng)不良型EB[3]和單純型EBS[4]中報道過，均屬于致病突變。

所有測序結(jié)果均通過反向測序驗證，且在與醫(yī)院自有的364個正常對照的全外顯子組測序數(shù)據(jù)中不存在這些突變。

3 討論

EB根據(jù)超微結(jié)構(gòu)下水皰在皮膚基底膜帶發(fā)生的位置不同，最新的分類將其分為單純型EB(EBS)、交界型EB(JEB)、營養(yǎng)不良型EB(DEB)和kindle EB[5]。DEB的臨床特征為反復發(fā)生的水皰、癢疹樣結(jié)節(jié)、粟丘疹和萎縮性瘢痕，其水皰位于真皮基底膜帶致密板以下，位置深在，所以愈合后留有明顯的瘢痕[6]。

DEB均由編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因突變所致，本研究中2例患者的COL7A1基因突變既往報道均導致顯性遺傳的癢疹樣營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥(dystrophic epidermolysis bullosa pruriginosa，DEB-Pr)。李桐等[7]在2014年于國內(nèi)首次報道DEB-Pr中COL7A1基因p.G2079R該突變位點，文中先證者的表型與家系2先證者父親的表型相同。DEB-Pr于1994年首次由McGrath等[8]提出，其特征是好發(fā)于四肢伸側(cè)的癢疹樣結(jié)節(jié)、苔蘚樣斑塊及紫羅蘭色線狀瘢痕，伴劇烈瘙癢和指趾甲損害[9]。DEB-Pr常于嬰兒早期或兒童期發(fā)病，愈后留有白色丘疹樣瘢痕，伴粟丘疹形成和甲營養(yǎng)不良；少數(shù)病例于成年后發(fā)病，最晚有71歲發(fā)病的報道[10]。

COL7A1基因定位于在3p21，由118個外顯子組成，編碼Ⅶ型膠原蛋白，由Ⅶ型膠原構(gòu)成的錨原纖維是基底膜的重要組成部分[11]。Ⅶ型膠原包括中央三螺旋桿狀膠原區(qū)域以及氨基端和羧基端，其中三螺旋區(qū)的甘氨酸替代的錯義突變?yōu)镈EBP最常見的基因突變類型，Ⅶ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征是Gly-X-Y的連續(xù)重復[12]。甘氨酸是最小的氨基酸且位于三螺旋區(qū)的中央軸，此位置的蛋白鏈緊密折疊，只能容納最小的甘氨酸，所以甘氨酸殘基的替換會扭曲三螺旋的構(gòu)象，膠原合成障礙后使錨原纖維數(shù)量或結(jié)構(gòu)上發(fā)生異常，進而真表皮處的連接功能減弱、皮膚脆性增加，致密板下水皰形成[13]。本研究中2例患者的COL7A1基因突變位點p.G2028R和p.G2079R為發(fā)生在不同外顯子上的相同堿基替換，均為鳥嘌呤變成腺嘌呤，且均導致編碼的氨基酸由甘氨酸變成精氨酸，屬于經(jīng)典的COL7A1三螺旋區(qū)內(nèi)的甘氨酸置換，但發(fā)病時間完全不同，臨床表型和發(fā)病時間不僅取決于致病突變的性質(zhì)，還受細胞類型、微環(huán)境和外部因素的影響[14]。COL7A1基因型和表型的關(guān)系尚不明確，該基因同一突變位點亦有較大的臨床異質(zhì)性。Nakamura等[14]總結(jié)分析3例COL7A1基因中p.G2028R甘氨酸替代突變導致DEB，其表型有單純的甲營養(yǎng)不良、典型的DDEB表型和DEB-Pr的表型，首次證實相同的COL7A1基因甘氨酸替換可引起明顯的表型異質(zhì)性。

角蛋白KRT5由基底層角質(zhì)形成細胞表達，其中間絲蛋白基因突變會引起細胞骨架結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[15]。家系2中KRT5基因突變既往報道導致局限性EBS，表現(xiàn)為局限于手足部位反復發(fā)作的表皮內(nèi)大皰，不累及黏膜和指甲，且愈后不留瘢痕[5]，但家系2的先證者及其父親從未出現(xiàn)過手足等部位的緊張性大皰，無既往報道的相關(guān)臨床表型。角蛋白的結(jié)構(gòu)從氨基端到羧基端分頭區(qū)、桿區(qū)和尾區(qū)三個部分，本研究中KRT5基因的錯義突變導致167位的酸性谷氨酸被堿性賴氨酸取代，突變位于角蛋白頭區(qū)H1的倒數(shù)第二個氨基酸，導致角蛋白絲組裝中斷，削弱角質(zhì)形成細胞抵抗機械應力的能力而引起水皰，角蛋白不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的突變與EBS的嚴重性密切相關(guān)，發(fā)生于頭區(qū)H1的突變常引起輕微的臨床癥狀，可在超微結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出相對正常的角蛋白中間絲[16]。

家系2的先證者及其父親同時攜帶2個基因的錯義突變：COL7A1基因的c.6235G>A和KRT5基因的c.499G>A，雜合這2個基因的錯義突變尚未見報道。家系2未行透射電鏡、免疫熒光等檢測來定位裂隙水平，因此究竟是兩個基因突變還是單個基因突變發(fā)揮作用、家系2是DEB還是DEB和EBS兩亞型復合的EB類型均有待探究。 Vahidnezhad等[17]報道了兩基因共遺傳引起不同亞型共存的EB病例，先證者是EXPH5和COL17A1雙基因純合突變導致的伴發(fā)單純性和交界性的EB，在組織病理學和基因水平上同時具有EBS和JEB這2種不同類型的特點。本研究中先證者表現(xiàn)為手足白色粟丘疹、水皰及中指指甲脫落，尚無雙脛前癢疹樣結(jié)節(jié)，但其父表現(xiàn)出DDEB的臨床表型，家系2先證者隨訪半年未曾出現(xiàn)手掌和足趾等部位的大皰，并未出現(xiàn)EBS的臨床表型，這2個基因突變的共顯性遺傳并沒有加重每個基因單獨突變的后果，推測與KRT5基因該突變位點位于角蛋白頭區(qū)H1本身可導致十分輕微的臨床癥狀且EBS的皮損會隨年齡增長而改善有關(guān)。

綜上所述，2例患者經(jīng)基因檢測的輔助診斷最終確診為EB，家系2雜合COL7A1基因和KRT5基因的錯義突變，同時攜帶這2個基因的雜合突變在國內(nèi)外均為首報，基因檢測的結(jié)果拓展了EB的突變數(shù)據(jù)庫，但EB的臨床表型和基因型之間的關(guān)系仍有待于進一步研究。