李瑋瑋，蔡天舒*，冀霞，潘銳，黃晴，謝艷慧

（1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025；2.惠州學(xué)院，廣東 惠州 516007）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種假單胞菌屬的革蘭氏陰性菌，易造成低溫冷藏食品的污染，是水產(chǎn)品[1]、乳制品[2]、肉制品[3]等產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。該菌的生長(zhǎng)迅速，所產(chǎn)生的胞外蛋白酶和脂肪酶會(huì)加速食品中蛋白質(zhì)和脂肪的水解，造成食品腐敗變質(zhì)[2]，感官可接受度下降，甚至喪失可食用價(jià)值，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，熒光假單胞菌還可引起敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等疾病，對(duì)人類(lèi)健康造成威脅[4]。因此，有效抑制食品中的熒光假單胞菌，對(duì)延長(zhǎng)食品貨架期和提升食品質(zhì)量安全具有重要意義。

天然防腐劑因具有安全、無(wú)毒、抗菌譜廣等優(yōu)勢(shì)，已成為食品抑菌防腐領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。香芹酚作為一種良好的天然防腐劑，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）列為公認(rèn)安全的食品成分（generlly recognized as safe，GRAS）[6]。香芹酚生物學(xué)特性廣泛，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)腸道微生物群[7]。研究發(fā)現(xiàn)香芹酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌等食品中常見(jiàn)的食源性致病菌均具有抑制作用[7]。然而，其溶解性差的特點(diǎn)，則制約了其在食品抑菌防腐保鮮中的應(yīng)用。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（ethyl-Nα-lauroyl-L-arginate hydrochloride，LAE）是一種陽(yáng)離子型表面活性劑，水溶性強(qiáng)，對(duì)霉菌、酵母菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌等多種微生物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗菌活性[8]。研究證實(shí)，LAE作為食品添加劑安全性較高，易在體內(nèi)分解成月桂酸和L-精氨酸等天然成分[8]。2005年，LAE被FDA批準(zhǔn)為GRAS類(lèi)食品添加劑[8]。目前，已有學(xué)者將LAE應(yīng)用于果蔬、肉制品、水產(chǎn)品等相關(guān)防腐保鮮研究中[8]。但香芹酚與LAE聯(lián)合對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效果與機(jī)制尚未被探索。

因此，本試驗(yàn)皆在探索一種基于香芹酚的新型復(fù)合食品抑菌劑，即建立香芹酚與LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌的最佳抑菌濃度模式，增強(qiáng)其生物利用度、評(píng)估抑菌效果；探討香芹酚與LAE聯(lián)用潛在的抑菌作用機(jī)制，綜合評(píng)價(jià)其作用模式，從而為擴(kuò)展其在食品工業(yè)中抑菌、防腐領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌ATCC 13525：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、瓊脂：北京陸橋技術(shù)有限公司；香芹酚（分析純，99.07%）：上海阿拉丁有限公司；月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（化學(xué)純，≥97%）：成都傲飛生物化學(xué)品有限責(zé)任公司；細(xì)菌蛋白質(zhì)提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白質(zhì)Marker、戊二醛、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、葡萄糖、無(wú)水乙醇（分析純）、考馬斯亮藍(lán)染色液、1%結(jié)晶紫染色液、冰乙酸（分析純）、96孔板：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HR60-IIA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；HZQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；Infinite M200 Pro NanoQuant多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司；Nano－Drop2000分光光度計(jì)：美國(guó)賽默飛公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡：日本JEOL公司；GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；Eppendorf 5418R離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度測(cè)定

采用二倍稀釋法分別測(cè)定香芹酚和LAE的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[9]。將熒光假單胞菌接種至無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清液保留菌體沉淀。用新鮮無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯重懸菌體，調(diào)整菌液濃度約為107CFU/mL備用。將各質(zhì)量濃度的香芹酚和LAE分別取100 μL加入96孔板中，取100 μL菌液分別加入到已裝有不同濃度的香芹酚和LAE溶液中，使香芹酚的終濃度分別為8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 mg/mL，LAE 溶液的終濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL。對(duì)照組加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯和100 μL菌液。將樣品置于30℃下培養(yǎng)24 h，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制的最低抑菌濃度作為MIC。

1.3.2 聯(lián)合抑菌效應(yīng)的測(cè)定

以“棋盤(pán)法”[9]確定香芹酚與LAE的最佳聯(lián)合抑菌組合。將香芹酚與LAE分別用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至質(zhì)量濃度為各自的1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC和8 MIC。在96孔板中，從左至右，濃度由低至高依次加入50 μL香芹酚溶液，同列中香芹酚濃度相同。同時(shí)由上至下，從低濃度至高濃度依次加入50 μL LAE溶液。然后在每孔中均加入100 μL濃度為107CFU/mL的熒光假單胞菌懸液，并充分混勻，使試驗(yàn)組中每孔含有不同濃度的抑菌劑組合。對(duì)照組加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯和100 μL菌液。將樣品置于30℃下培養(yǎng)24 h，檢測(cè)OD600值，確定兩種抑菌劑聯(lián)用時(shí)的MIC。以部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）判定兩種抑菌劑的聯(lián)用效果，計(jì)算公式如下。

結(jié)果判定依據(jù)：FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1為相加作用；1＜FICI≤2為無(wú)關(guān)作用；FICI＞2為拮抗作用[9]。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線繪制

參考舒慧珍等[10]的方法繪制生長(zhǎng)曲線。用營(yíng)養(yǎng)肉湯將熒光假單胞菌培養(yǎng)并稀釋至濃度約107CFU/mL，備用。依據(jù)聯(lián)合抑菌效應(yīng)的測(cè)定結(jié)果，在96孔板中，每孔中加入菌液100 μL，然后加入100 μL的香芹酚和LAE溶液，使終濃度分別為1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC 香芹酚+1/16 MIC LAE。以加入 100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯和100 μL菌液作為對(duì)照。將樣品置于30℃培養(yǎng)24 h，每2 h測(cè)定一次OD600值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 胞外蛋白質(zhì)和核酸的測(cè)定

參照Cao等[11]的方法測(cè)定胞外蛋白質(zhì)和核酸，并稍作修改。將熒光假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，6 000 r/min離心10 min后收集沉淀，并以1×PBS清洗、重懸和調(diào)整菌體濃度至OD600=1.0。向上述熒光假單胞菌懸液中加入抑菌劑，使終濃度分別為0（對(duì)照）、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC 香芹酚+1/16 MIC LAE，于30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 h。期間分別于0、30、60、90、120、150、180 min收集培養(yǎng)液，以4 ℃、8 000 r/min離心5 min，吸取上清液并用分光光度計(jì)分別檢測(cè)OD260和OD280。

1.3.5 透射電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡結(jié)合超薄切片技術(shù)[11]，觀察熒光假單胞菌細(xì)胞形態(tài)變化。向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液中分別加入終濃度為1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE的抑菌劑，以未加抑菌劑處理組作為對(duì)照，30℃下振蕩培養(yǎng)3 h，取培養(yǎng)液6 000 r/min離心10 min，以1×PBS清洗并調(diào)整至OD600值為1.0。向上述菌體處理液加入等體積的5%戊二醛溶液，在4℃條件下固定16 h。樣品經(jīng)1×PBS清洗3次，去除固定液，用乙醇溶液梯度逐級(jí)脫水、包埋、加溫聚合、超薄切片機(jī)切片、醋酸鈾-硝酸鉛染色后，以透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.6 細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)耿一鳴等[12]的方法并加以修改。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的熒光假單胞菌懸液，離心后用1×PBS清洗、重懸，調(diào)節(jié)至OD600=1.0。加入香芹酚和LAE，使其在菌液中的終濃度分別為0、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE，于30℃振蕩培養(yǎng)3 h，提取不同處理組中的菌體蛋白質(zhì)，并以BCA法于OD562下測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

菌體蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合，100℃沸水浴5 min，瞬時(shí)離心，取等體積上清液進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。濃縮膠恒壓80 V、分離膠電壓120 V，0.1%考馬斯亮藍(lán)染色30 min，脫色液脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰，并拍照分析[13]。

1.3.7 生物被膜的形成

參照戴雨蕓等[14]的方法，將熒光假單胞菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯，30℃培養(yǎng)16 h，6 000 r/min離心10 min后，棄上清液保留菌體沉淀。用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600=1.0，再用含0.2%葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯將上述菌液稀釋100倍。加入香芹酚和LAE，使其在菌液中的終濃度分別為0、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE。取上述菌液160 μL加入圓底96孔板，30℃培養(yǎng)24 h。依次吸去96孔板中的菌液，用無(wú)菌水洗3次，吸干。加入170 μL 0.1%結(jié)晶紫染色15 min，以無(wú)菌水洗3次后吸干。最后加入180 μL 33%冰乙酸溶液充分溶解后，測(cè)定595 nm處OD值。

1.3.8 香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌群集與泳動(dòng)的影響

參照劉楠[15]的方法，并稍作修改。配制群集瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基和泳動(dòng)瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，冷卻至46℃，向上述兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的香芹酚和LAE，充分混勻制備固體平板，使培養(yǎng)基內(nèi)的抑菌物終濃度分別為0、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE。將5 μL熒光假單胞菌液滴加于固體平板中央，無(wú)菌風(fēng)吹干，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株的遷移情況。并分別測(cè)量熒光假單胞菌在群集培養(yǎng)基、泳動(dòng)培養(yǎng)基中的面積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0繪圖，兩組計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用Student's t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效應(yīng)

2.1.1 香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌的MIC測(cè)定

不同濃度的香芹酚和LAE分別對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)抑制情況見(jiàn)表1。

表1 香芹酚與LAE對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用Table 1 Activity of carvacrol and LAE against P.fluorescens

由表1可知，當(dāng)香芹酚濃度≥0.500 mg/mL時(shí)，熒光假單胞菌未見(jiàn)生長(zhǎng)，菌液呈澄清狀態(tài)；且當(dāng)香芹酚濃度=0.500 mg/mL 時(shí)，光密度變化值（△OD600）＜0.05，說(shuō)明香芹酚對(duì)熒光假單胞菌的MIC為0.500 mg/mL。這與Fang等[6]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，表1結(jié)果顯示LAE對(duì)熒光假單胞菌的MIC為64 μg/mL。綜上表明，香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，且抑菌能力有濃度依賴(lài)性。

2.1.2 香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌的聯(lián)合抑菌作用

根據(jù)“棋盤(pán)法”進(jìn)行聯(lián)合抑菌效果的研究，找出最佳聯(lián)合抑菌濃度。不同濃度的香芹酚與LAE組合對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌的聯(lián)合抑菌作用Fig.1 Synergy of carvacrol and LAE against P.fluorescens

由圖1可知，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)液中香芹酚濃度為0.250 mg/mL（1/2 MIC）、LAE 濃度為4 μg/mL（1/16 MIC）時(shí)，作用24 h后，菌液澄清，平板涂布無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，抑菌率為100%。通過(guò)FICI公式計(jì)算，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE的FICI值為0.56，該組合具有相加作用，表明香芹酚與LAE的聯(lián)合應(yīng)用可以有效降低獨(dú)立作用劑量。

香芹酚水溶性差，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者主要采用磷脂[16]、多糖[17]和β-環(huán)糊精[6]等物質(zhì)將其包埋，以解決其溶解性差的問(wèn)題。研究表明，LAE有助于增溶丁香酚，促進(jìn)其與微生物表面的接觸，使丁香酚能夠更好地接觸磷脂膜，具有協(xié)同抑菌活性[18]。LAE可以提高百里香酚納米乳液的穩(wěn)定性和抗菌功效[19]。本研究采用具有抑菌活性的陽(yáng)離子表面活性劑LAE與香芹酚復(fù)配，利于抑菌生物活性的發(fā)揮，提高生物利用度，為雙組分抗菌乳液拓展在食品中的應(yīng)用范圍提供參考。

此外，大鼠遺傳毒性研究顯示，香芹酚（81mg/kgBW～810 mg/kg BW）不會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)基因毒性或氧化性DNA損傷，且無(wú)組織病理學(xué)變化，其作為食品防腐劑的潛在應(yīng)用具有良好的特征[20]。同時(shí)，歐盟食品安全局對(duì)LAE作為食品添加劑的每日允許攝入量為0.5 mg/kg BW[21]。而本研究中所采用的香芹酚和LAE聯(lián)合抑菌劑量遠(yuǎn)低于上述限量標(biāo)準(zhǔn)，符合食品安全要求，將在不同食品中發(fā)揮聯(lián)合抑菌效果。

2.1.3 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響

香芹酚和LAE聯(lián)合使用對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖2。

圖2 香芹酚和LAE聯(lián)合對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.2 Effect of carvacrol and LAE on the growth of P.fluorescens

由圖2可知，對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，4 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌快速生長(zhǎng)，24 h時(shí)細(xì)菌濃度OD600為0.795；當(dāng)培養(yǎng)基中分別加入終濃度為1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE時(shí)，24 h時(shí)細(xì)菌濃度OD600分別為0.394和0.646；當(dāng)1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用時(shí)，培養(yǎng)基未出現(xiàn)渾濁，菌體未見(jiàn)生長(zhǎng)。與對(duì)照相比，24 h處理后，1/2 MIC香芹酚抑菌率為56.3%（P＜0.05），1/16 MIC LAE抑菌率為24.1%（P＞0.05），1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)合抑菌率達(dá)97.9%（P＜0.01）。結(jié)果表明，香芹酚和LAE聯(lián)合作用，對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)抑制能力最強(qiáng)，抑菌效果顯著，表現(xiàn)出良好的聯(lián)合抑菌效應(yīng)。

2.2 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌的抑菌機(jī)制

2.2.1 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)菌體蛋白質(zhì)和核酸泄漏的影響

細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜完整是維持細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[22]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)菌體蛋白質(zhì)與核酸胞外泄漏，分析細(xì)胞質(zhì)膜的完整性。香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)菌體蛋白質(zhì)和核酸泄漏的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，對(duì)照組和1/16 MIC LAE處理組中胞外蛋白質(zhì)（OD280）和核酸（OD260）含量隨時(shí)間變化不顯著（P＞0.05）；1/2 MIC香芹酚組和1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用組中，處理1 h內(nèi)均出現(xiàn)菌體蛋白和核酸泄露。其中，與對(duì)照相比，1/2 MIC香芹酚+1/16MIC LAE聯(lián)用組細(xì)菌懸液中的蛋白質(zhì)和核酸泄漏顯著增加，吸光度OD280和OD260在1 h時(shí)分別升高31.2倍和17.5倍（P＜0.01），之后吸光度趨于穩(wěn)定。上述研究表明，熒光假單胞菌經(jīng)1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE處理后，細(xì)胞質(zhì)膜快速發(fā)生不可逆損傷，導(dǎo)致膜通透性發(fā)生改變，菌體內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏到培養(yǎng)液中，細(xì)胞膜完整性破壞。研究表明，萜類(lèi)化合物可以通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的脂質(zhì)組裝，造成細(xì)胞膜的崩解、細(xì)胞蛋白質(zhì)的變性、細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡[22]。LAE主要通過(guò)與革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖相互作用，使膜去極化，破壞菌體滲透屏障和完整性，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[18]。

圖3 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的泄漏的影響Fig.3 Effect of the combination of carvacrol and LAE on release of intracellular proteins and nucleic acids from P.fluorescens

2.2.2 透射電子顯微鏡觀察香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響

通過(guò)透射電子顯微鏡觀察熒光假單胞菌經(jīng)香芹酚和LAE聯(lián)合處理后菌體超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，對(duì)照組菌體結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，飽滿(mǎn)。1/2 MIC香芹酚處理組和1/16 MIC LAE處理組，菌體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，部分菌體細(xì)胞質(zhì)電子密度下降，不均勻。1/2 MIC香芹酚+1/16MIC LAE聯(lián)用組細(xì)菌形態(tài)不規(guī)則，邊界褶皺，細(xì)胞質(zhì)電子密度顯著下降。有研究發(fā)現(xiàn)，檸檬烯[10]可促進(jìn)熒光假單胞菌體裂解，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，大分子物質(zhì)泄漏，菌體形態(tài)發(fā)生改變。LAE主要的抑菌機(jī)制是破壞細(xì)胞膜，但未導(dǎo)致細(xì)胞裂解[8]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果表明，香芹酚和LAE聯(lián)用促進(jìn)熒光假單胞菌的菌體結(jié)構(gòu)破損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖4 熒光假單胞菌的透射電鏡圖（50 000×）Fig.4 Transmission electron micrographs of P.fluorescens（50 000×）

2.2.3 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的影響

香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 香芹酚與LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌胞內(nèi)總蛋白濃度的影響與SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Effect of carvacrol combined with LAE on intracellular protein content and SDS-PAGE profile of P.fluorescens

由圖5可知，與上述胞外蛋白質(zhì)和核酸泄漏測(cè)定結(jié)果，以及透射電子顯微鏡觀察結(jié)果相一致，與對(duì)照組相比，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用組中，熒光假單胞菌胞內(nèi)蛋白濃度顯著下降，降低了84.1%（P＜0.01），1/2 MIC香芹酚處理組降低了32.1%（P＜0.01），而1/16 MIC LAE處理組無(wú)顯著變化（P＞0.05）。通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)一步分析胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的改變（圖5b），對(duì)照組蛋白質(zhì)電泳條帶豐富且清晰（泳道A）；1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用組中，所有蛋白質(zhì)條帶亮度明顯減弱，甚至消失，僅剩4條微弱的條帶，主要位于135、35、25 kDa和17 kDa（泳道B）。

綜合上述研究結(jié)果表明，在1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE作用下，熒光假單胞菌所表達(dá)的蛋白質(zhì)含量和類(lèi)型減少，進(jìn)一步揭示香芹酚和LAE聯(lián)合作用破壞熒光假單胞菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏，使得胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻。研究表明，松油烯-4-醇[12]、檸檬烯[10]和苯乳酸[13]等抑菌劑也具有相似的抑菌機(jī)制，即通過(guò)改變熒光假單胞菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致大分子蛋白泄漏。

2.3 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成的影響

生物被膜是細(xì)菌處于外界不利環(huán)境時(shí)，細(xì)菌以及其自身所分泌的聚合物所形成的一種聚集膜狀物[23]。研究表明，生物被膜的形成將有效保護(hù)細(xì)菌，使其對(duì)抗菌劑以及機(jī)體免疫系統(tǒng)的抵抗性顯著增強(qiáng)，加劇食品的污染[23]。香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成的影響見(jiàn)圖6。

圖6 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成能力的影響Fig.6 Effect of the combination of carvacrol and LAE onbiofilmforming ability of P.fluorescens

由圖6可知，與對(duì)照相比，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE分別作用24 h后，熒光假單胞菌生物被膜總量分別減少97.0%（P＜0.01）、61.5%（P＜0.01）、3.9%（P＞0.05）。其中，香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌生物被膜的形成有顯著抑制效果。戴雨蕓等[14]研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜有明顯的抑制和清除作用，主要通過(guò)抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞間多糖黏附素的合成和胞外DNA的釋放，減少生物被膜的形成。丁香酚破壞副溶血性弧菌細(xì)胞間連接，分離生物膜，并減少生物膜中的活菌細(xì)胞，具有顯著的抗生物膜活性[24]。

2.4 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)的影響

熒光假單胞菌是一種具有鞭毛的革蘭氏陰性菌，具有鞭毛介導(dǎo)的細(xì)菌群集、泳動(dòng)兩種遷移方式，分別代表細(xì)菌的群體行為與個(gè)體行為[25]。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)特性對(duì)細(xì)菌在宿主表面定植和后繼生物膜的形成具有重要作用[25]。香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌群集與泳動(dòng)的影響及運(yùn)動(dòng)抑制情況見(jiàn)圖7和圖8。

由圖7和圖8可知，與對(duì)照相比，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌群集和泳動(dòng)的抑制率最大，分別為92.5%和65.0%。說(shuō)明香芹酚和LAE聯(lián)用能有效抑制熒光假單胞菌的遷移能力，且與上述抑制生物膜形成的結(jié)果相互驗(yàn)證。已有研究表明，香芹酚在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控?zé)晒饧賳伟廾纬珊腿后w感應(yīng)信號(hào)分子?；?高絲氨酸內(nèi)酯的產(chǎn)生，從而抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)群集運(yùn)動(dòng)[15]。

圖7 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌群集和泳動(dòng)的影響Fig.7 Effect of the combination of carvacrol and LAE on swarming and swimming of P.fluorescens

圖8 香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌運(yùn)動(dòng)面積的影響Fig.8 Effect of the combination of carvacrol and LAE on area of the motility zone of P.fluorescens

3 結(jié)論

香芹酚和LAE對(duì)熒光假單胞菌均具有良好的抑菌活性，MIC分別為0.500 mg/mL和64 μg/mL。棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果表明，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用具有相加抑菌效果，F(xiàn)ICI值為0.56，有效降低各自獨(dú)立作用的劑量。1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯(lián)用使熒光假單胞菌的細(xì)胞膜通透性明顯增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)和核酸泄漏、胞內(nèi)電子密度下降及胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量和類(lèi)型減少。因此，香芹酚與LAE聯(lián)用誘導(dǎo)熒光假單胞菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性受損、超微結(jié)構(gòu)改變、膜功能異常，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)泄漏，使細(xì)菌新陳代謝活性下降，菌體死亡。此外，香芹酚和LAE聯(lián)用對(duì)熒光假單胞菌的生物膜形成、群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)均有顯著的抑制作用，具有抑制群體感應(yīng)活性的作用。