王 彬，孫尚德，陳曉中

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450052）

油脂在儲(chǔ)藏期容易氧化劣變，添加抗氧化劑能有效延長(zhǎng)油脂儲(chǔ)藏期。油脂中常用的抗氧化劑有特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）、丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)這些合成抗氧化劑具有潛在毒性，在日本、歐美國(guó)家已經(jīng)禁止或嚴(yán)格限制其應(yīng)用[2-4]。隨著消費(fèi)者對(duì)健康的重視，高效、天然抗氧化劑的應(yīng)用逐漸受到重視?？箟难嶂舅狨ビ煽箟难崤c脂肪酸酯化而成，不僅具有抗壞血酸的功能性且引入脂肪酸鏈可增加其脂溶性[5]，原料均為天然物質(zhì)，對(duì)人體無(wú)毒副作用。目前抗壞血酸衍生物——抗壞血酸棕櫚酸酯是唯一一種可以應(yīng)用于嬰幼兒食品中的抗氧化劑[6]，因此抗壞血酸脂肪酸酯應(yīng)用前景十分廣闊。

抗壞血酸脂肪酸酯主要通過(guò)化學(xué)法合成，如酯化法、酰氯法和酯交換法[7-8]。化學(xué)合成法技術(shù)成熟，但存在副產(chǎn)物多、環(huán)境污染大、對(duì)設(shè)備腐蝕性大等缺點(diǎn)。而酶法合成具有反應(yīng)專(zhuān)一性高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[9]。酶法合成抗壞血酸脂肪酸酯已有大量報(bào)道，Novozym 435和Lipozyme TLIM是具有較好催化性能的商業(yè)固定化酶[10-12]，雖然抗壞血酸脂肪酸酯比抗壞血酸更易溶于油脂，但其在油脂中依然存在低混溶性，因而限制了其使用。長(zhǎng)碳鏈脂肪酸（C>18）或不飽和脂肪酸（如硬脂酸或油酸）的抗壞血酸脂肪酸酯與脂肪產(chǎn)品具有更好的相容性[13]，也可用作食品添加劑。

鑒于酶法合成的優(yōu)點(diǎn)和商業(yè)固定化酶成本高的缺點(diǎn)，為進(jìn)一步提高抗壞血酸脂肪酸酯在油脂中的溶解性。作者對(duì)液體脂肪酶CALB進(jìn)行固定化，在非水介質(zhì)中催化合成AS，探究最佳反應(yīng)條件，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定，并研究其在玉米油中的抗氧化效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CALB液體脂肪酶（初始質(zhì)量濃度22.8 mg/mL）：諾維信公司產(chǎn)品；L-抗壞血酸、硬脂酸、4A分子篩、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、乙腈、正己烷（均為分析純）、玉米油：安徽中糧油脂有限公司產(chǎn)品；大孔吸附樹(shù)脂（XB）、氨基樹(shù)脂（1000EP）：西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；LY20-A水浴恒溫振蕩器：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；Waters e2695型高效液相色譜儀：美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品；892 Rancimat油脂氧化分析儀：瑞士萬(wàn)通公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 酶的預(yù)處理與固定化吸附樹(shù)脂：稱(chēng)取樹(shù)脂5 g，并用磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L、pH7.0）洗滌濾干；氨基樹(shù)脂：取樹(shù)脂5 g，加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.0）和體積分?jǐn)?shù)50%的戊二醛（8 mL）于錐形瓶，并于恒溫水浴振蕩器（25℃、120 r/min）振蕩2 h，取出后用磷酸鹽緩沖液洗滌數(shù)次，濾干。

將酶液與一定體積的緩沖液混合后加入預(yù)處理好的樹(shù)脂，于恒溫水浴振蕩器（25℃、120 r/min）振蕩24 h，抽濾分離出固定化酶，并用緩沖液洗滌數(shù)次，至濾液中檢測(cè)不出酶蛋白，將洗滌后的固定化酶于真空干燥箱（40℃）干燥12 h后儲(chǔ)藏備用。

1.3.2 酶負(fù)載與酶活的測(cè)定按BCA試劑與Cu試劑體積比50∶1配制BCA工作液。以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，將20μL不同質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液加入孔板，再分別加入200μL BCA工作液放置30 min，在562 nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算固定化載體的酶負(fù)載量和酶負(fù)載率。

式中：L為酶負(fù)載量，mg/g；A為固定化前酶液中的酶蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；B為固定化后上清液中殘留的酶蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；V為酶液體積，mL；C為加入固定化載體的質(zhì)量，g。

式中：M為酶負(fù)載率，%；X1為固定化前酶液中的酶蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；X2為固定化后上清液中殘留的酶蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

采用分光光度法測(cè)定脂肪酶催化酯化反應(yīng)酶活[14]，將一定量的對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（pNPP）溶于50 mL正庚烷。稱(chēng)取一定質(zhì)量的酶于試管，加入0.5 mL反應(yīng)液，然后加入30μL無(wú)水乙醇在40℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束取5μL加到96孔板，每個(gè)孔加入200μL的0.1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，放置5 min，用酶標(biāo)儀在410 nm檢測(cè)各孔吸光度。

1.3.3 AS的合成及純化稱(chēng)取3 mmol抗壞血酸、24 mmol硬脂酸、4 g分子篩和20 mL叔丁醇于150 mL錐形瓶，在55℃條件下于水浴恒溫振蕩器預(yù)熱30 min后加入一定量的酶，隔點(diǎn)取樣進(jìn)液相測(cè)產(chǎn)率。反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾除去固體物質(zhì)，旋蒸除去溶劑，采用乙酸乙酯溶解并用去離子水洗滌3次除去抗壞血酸，旋蒸除去乙酸乙酯，用熱正己烷洗滌3~5次除去大量硬脂酸，過(guò)濾得到白色粉末狀A(yù)S，純度約為91%。

1.3.4 AS的HPLC分析采用HPLC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，所用儀器為Waters e2695，色譜柱型號(hào)為C18（5μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇、水、乙酸的混合物，三者體積比為95∶5∶0.05，柱溫為30℃，紫外吸收波長(zhǎng)為250 nm，流量為1 mL/min，洗脫時(shí)間為20 min。根據(jù)面積歸一法計(jì)算產(chǎn)率。

式中：N為產(chǎn)率，%；SAS和SAA分別為AS和抗壞血酸的峰面積。

1.3.5 AS的質(zhì)譜檢測(cè)利用UPLC-QQQ-MS/MS對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，檢測(cè)模式選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）。色譜條件參考1.3.4。質(zhì)譜條件為：離子源電離模式采用ESI，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3.5 kV；脫溶劑氣和錐孔氣流量：700 L/h和100 L/h；離子源溫度：130℃；碰撞能量：25 eV，掃描范圍：m/z 50~500。

1.3.6 AS在油脂中的抗氧化評(píng)價(jià)采用Rancimat法測(cè)定不同AS添加量對(duì)玉米油氧化誘導(dǎo)期的影響，并與TBHQ進(jìn)行比較，篩選與添加50 mg/kg TBHQ氧化誘導(dǎo)時(shí)間相近的AS添加量。玉米油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間測(cè)定參考GB/T 21121—2007《動(dòng)植物油脂 氧化穩(wěn)定性的測(cè)定》，稱(chēng)取3 g玉米油于樣品管，測(cè)定池加入60 mL超純水吸收產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，空氣流量20 L/h，分別測(cè)定在100、110、120℃溫度下的氧化誘導(dǎo)期。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。采用Origin 2021繪圖，用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用雙向方差分析（ANOVA）評(píng)估差異的顯著性，P<0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的固定化及篩選

如表1所示，液體CALB脂肪酶具有催化抗壞血酸與硬脂酸發(fā)生酯化反應(yīng)的能力，但是催化效果較差，對(duì)液體CALB脂肪酶進(jìn)行冷凍干燥脫水得到CALB干粉，顯著提高了其催化能力。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)是在非水相體系進(jìn)行，而液體脂肪酶含有大量的水，水會(huì)包裹其催化酯化的中心位點(diǎn)[15]，致使其催化效率不高。Novozym 435具有較高的酶活和催化效果，這是一種將CALB固定在大孔陰離子樹(shù)脂上的商業(yè)固定化酶。酶的固定化可以改善游離脂肪酶的缺點(diǎn)，作者研究了兩種固定化方式，分別為大孔吸附樹(shù)脂吸附固定化和氨基樹(shù)脂共價(jià)結(jié)合法，并探究酶液配比對(duì)其固定化和催化效果的影響。在相同的處理?xiàng)l件下吸附樹(shù)脂在負(fù)載量、負(fù)載率和酶活方面普遍高于氨基樹(shù)脂，而且有較高的催化效果。隨著酶液與緩沖液配比增加，固定化酶的負(fù)載量增加，結(jié)合AS產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益，選擇吸附樹(shù)脂，同時(shí)酶液與緩沖液體積比為2∶1作為固定化方法。

表1 不同處理方式下酶的性質(zhì)及其催化效果Table 1 Properties and catalytic effects of enzymes under different treatments

2.2 AS合成單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溶劑對(duì)反應(yīng)的影響在非水相體系，溶劑的選擇對(duì)酶催化具有重要影響。Laane規(guī)律揭示了溶劑極性lg P與酶催化活性之間的關(guān)系[16]。反應(yīng)物中抗壞血酸屬于強(qiáng)極性物質(zhì)，而硬脂酸極性相對(duì)較弱。在反應(yīng)過(guò)程中溶劑的選擇不僅要滿足酶在體系中具有較高的催化活性，同時(shí)也要滿足反應(yīng)物在體系中具有較好的溶解度。實(shí)驗(yàn)選擇不同極性的溶劑：叔丁醇（lg P=1.32）、叔戊醇（lg P=1.15）、丙酮（lg P=-0.23）、乙 腈（lg P=-0.33）和 正 己 烷（lg P=3.53），研究反應(yīng)溶劑對(duì)AS合成的影響。溶劑的lg P越低代表溶劑極性越強(qiáng)，當(dāng)溶劑極性越強(qiáng)，脂肪酶的必需水化層將被破壞，酶的活性降低，而當(dāng)溶劑極性減弱，酶具有較好的催化活性。由圖1可以看出，在叔丁醇體系中反應(yīng)產(chǎn)率最高，然后為叔戊醇、丙酮、乙腈和正己烷。丙酮和乙腈相對(duì)叔丁醇體系催化效果不高，這可能是因?yàn)槿軇O性較強(qiáng)對(duì)酶活產(chǎn)生影響。而在弱極性的正己烷溶劑中卻沒(méi)有檢測(cè)到生成物，這是因?yàn)殡m然酶在非極性溶劑中具有較高的酶活，但是反應(yīng)物抗壞血酸屬于強(qiáng)極性物質(zhì)，在正己烷中幾乎不溶解，反應(yīng)幾乎不進(jìn)行。因此選擇叔丁醇作為反應(yīng)溶劑。

圖1 溶劑對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.1 Effect of solvent on reaction system

2.2.2 溫度對(duì)反應(yīng)的影響由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)溫度從35℃增加到55℃，AS產(chǎn)率顯著增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為55℃時(shí)，反應(yīng)24 h產(chǎn)率為（30.65±0.67）%，當(dāng)溫度進(jìn)一步提高，AS產(chǎn)率緩慢增加。這可能是因?yàn)闇囟容^低，酶活相對(duì)較低，同時(shí)抗壞血酸在叔丁醇中溶解度較低致使產(chǎn)率較低。當(dāng)溫度提高可激發(fā)酶的活性中心，反應(yīng)體系黏度降低利于傳質(zhì)，因此產(chǎn)率提高[16]。當(dāng)溫度提高到75℃時(shí)，該酶依然有較好的催化效果。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on yield

2.2.3 酶添加量對(duì)反應(yīng)的影響由圖3可以看出，當(dāng)酶添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）由10%到25%，AS產(chǎn)率明顯提升，當(dāng)酶添加量由25%到35%，反應(yīng)產(chǎn)率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)殡S著酶添加量的增加，可增加酶反應(yīng)位點(diǎn)與反應(yīng)物之間的接觸，從而提高反應(yīng)速率和產(chǎn)率。當(dāng)加入過(guò)多的酶可能會(huì)影響體系的傳質(zhì)，同時(shí)會(huì)造成生產(chǎn)成本浪費(fèi)，因此酶的最佳添加量為25%。

圖3 酶添加量對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on yield

2.2.4 底物物質(zhì)的量比對(duì)反應(yīng)的影響由圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜铮箟难崤c硬脂酸）物質(zhì)的量比從1∶2到1∶15時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率明顯增加。從1∶2到1∶10時(shí)，AS產(chǎn)率具有較高的增加幅度，從1∶10到1∶15，AS產(chǎn)率增加不顯著。這可能是因?yàn)榈孜镂镔|(zhì)的量比的增加引入了更多的硬脂酸以及酶，增加了反應(yīng)物之間的接觸，從而提高產(chǎn)率；當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比到達(dá)臨界值，增加了反應(yīng)體系的黏度，致使反應(yīng)傳質(zhì)變慢，反應(yīng)趨于穩(wěn)定。

圖4 底物物質(zhì)的量比對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of substrate molar ratio on yield

2.2.5 底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響由圖5可知，當(dāng)?shù)孜餄舛龋ㄒ钥箟难嵊?jì)）由0.03 mol/L增加到0.21 mol/L時(shí)，AS產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.12 mol/L時(shí)，產(chǎn)率最高為（37.66±1.54）%。這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛却笥?.12 mol/L后，隨著濃度增加，傳質(zhì)阻力也增加，也可能是部分抗壞血酸沒(méi)有完全溶解，當(dāng)抗壞血酸濃度過(guò)高會(huì)與脂肪酶結(jié)合成復(fù)合體，從而抑制反應(yīng)[17]。因此選擇0.12 mol/L為最佳底物濃度。

圖5 底物濃度對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on yield

2.2.6 分子篩添加量對(duì)反應(yīng)的影響酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，生成物有水。通過(guò)除去生成物的水可以促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，4A分子篩具有吸水能力，可以降低反應(yīng)過(guò)程中生成的水，同時(shí)也能抑制反應(yīng)逆向進(jìn)行，從而提高產(chǎn)率。由圖6可以看出，與不加分子篩相比，加入分子篩能顯著提高反應(yīng)產(chǎn)率，當(dāng)分子篩添加量達(dá)到100 g/L后，隨著分子篩添加量加大，反應(yīng)產(chǎn)率沒(méi)有發(fā)生顯著變化。分子篩作為吸附劑不僅可以吸附水也可能對(duì)反應(yīng)物存在吸附性。綜合考慮選擇100 g/L為最佳分子篩添加量。

圖6 分子篩添加量對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of molecular sieve addition on yield

2.3 AS合成響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析采用響應(yīng)面模型擬合單因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可得到自制固定化脂肪酶催化合成AS的最佳反應(yīng)條件。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化不同變量組合對(duì)合成AS的影響，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

通過(guò)響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析得到反應(yīng)變量與AS產(chǎn)率的二次多項(xiàng)擬合式：

式中：Y代表AS的產(chǎn)率，%；A代表反應(yīng)溫度，℃；B代表酶添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），%；C代表底物物質(zhì)的量比。

由表3可知，反應(yīng)變量與AS產(chǎn)率的二次多項(xiàng)擬合系數(shù)R2=0.979 1，模型P<0.005，表明自制固定化脂肪酶CALB催化合成AS的響應(yīng)面模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著。此外，3個(gè)變量對(duì)合成AS的影響順序?yàn)椋簻囟龋镜孜镂镔|(zhì)的量比＞酶添加量。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果各反應(yīng)變量（溫度、酶添加量、底物物質(zhì)的量比）及其交互作用對(duì)自制固定化脂肪酶CALB催化合成AS的影響可以通過(guò)3D圖來(lái)評(píng)估（見(jiàn)圖7）。隨著溫度（35~75℃）、底物物質(zhì)的量比（1∶2~1∶16）、酶添加量（5%~35%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的變化，AS產(chǎn)率逐漸增加。如圖7（a）所示，溫度與酶添加量的交互作用表明，當(dāng)產(chǎn)率>40%時(shí)，反應(yīng)溫度為57~75℃、酶添加量為11%~15%。圖7（b）表明當(dāng)反應(yīng)溫度為57~75℃，底物物質(zhì)的量比為1∶6~1∶16時(shí)有較高的產(chǎn)率。圖7（c）表明當(dāng)酶添加量為23%~35%，底物物質(zhì)的量比為1∶10~1∶16時(shí)有較高產(chǎn)率。由模型可以發(fā)現(xiàn)酶添加量和底物物質(zhì)的量比的交互作用對(duì)反應(yīng)影響更顯著。

表2 各因素對(duì)AS產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of different factors on AS yield

表3 各因素對(duì)AS產(chǎn)率的響應(yīng)面模型分析Table 3 RSM model analysis of AS yield by different factors

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，在反應(yīng)溫度72℃，底物物質(zhì)的量比1∶12，酶添加量22.49%的最佳反應(yīng)條件下，AS的預(yù)測(cè)產(chǎn)率為45.68%，實(shí)測(cè)值為（41.33±1.81）%，結(jié)果可信。該結(jié)果高于Lerin等使用Novozym 435在超聲環(huán)境催化合成抗壞血酸棕櫚酸酯的產(chǎn)率（27%）[18]，這可能是由于其反應(yīng)時(shí)間較短，反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到終點(diǎn)。

圖7 酶催化合成AS的響應(yīng)面3D圖Fig.7 3D Response surface diagram of enzymatic synthesis of AS

2.4 質(zhì)譜表征

由圖8可知，電離質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z 441.511 4與AS的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)應(yīng)，m/z 283.349 2與硬脂酸的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)應(yīng)，m/z 175.083 8與抗壞血酸相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)應(yīng)。在二級(jí)電離質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z 156.994 7為m/z 175.083 8丟失一分子水形成的[C6H6O5]-離子碎片，m/z 128.949 3（M-1）為[C5H6O4]-離子碎片，m/z 114.955 0（M-1）為[C4H4O4]-離子碎片，m/z 84.963 9（M-1）為[C3H2O3]-離子碎片。由此可判斷產(chǎn)物為AS。AS的電離主要為抗壞血酸硬脂酸酯酯鍵斷裂和抗壞血酸自身電離斷裂。

圖8 抗壞血酸硬脂酸酯的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8 Secondary mass spectrum of ascorbic acid stearate

2.5 油脂氧化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

TBHQ作為一種高效抗氧化劑，添加50 mg/kg有較好抗氧化效果[19]，國(guó)標(biāo)中對(duì)抗壞血酸棕櫚酸酯的添加要求為不超過(guò)200 mg/kg。參考抗壞血酸棕櫚酸酯的添加量，通過(guò)Rancimat法研究不同AS添加量和誘導(dǎo)溫度對(duì)玉米油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的影響。

從圖9可以看出，添加TBHQ和AS與空白相比能顯著延長(zhǎng)氧化誘導(dǎo)時(shí)間，而添加200 mg/kg抗壞血酸（AA）對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間沒(méi)有明顯延長(zhǎng)，這是因?yàn)榭箟难岵蝗苡谟椭?，通過(guò)將抗壞血酸酯化不僅能提高其在油脂中的溶解度，而且能提高其抗氧化性。隨著溫度提高10℃，誘導(dǎo)時(shí)間縮短約一半。在相同條件下，添加100 mg/kg AS與50 mg/kg TBHQ的氧化誘導(dǎo)時(shí)間比較接近，因此AS可以作為一種有效、健康的抗氧化劑應(yīng)用于油脂中。

圖9 抗氧化劑添加量及誘導(dǎo)溫度對(duì)玉米油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的影響Fig.9 Effects of antioxidant dosage and induction temperature on induction time of corn oil oxidation

3 結(jié) 語(yǔ)

作者研究出一種簡(jiǎn)便的液體脂肪酶CALB固定化技術(shù)，固定化負(fù)載率高。并對(duì)反應(yīng)溶劑、溫度、酶添加量、底物物質(zhì)的量比、底物濃度和分子篩添加量進(jìn)行研究，在優(yōu)化條件下：反應(yīng)溫度72℃，底物物質(zhì)的量比1∶12，酶添加量22.49%，反應(yīng)24 h，產(chǎn)率可達(dá)（41.33±1.81）%。單因素對(duì)產(chǎn)率影響順序?yàn)闇囟?底物物質(zhì)的量比>酶添加量。通過(guò)Rancimat法研究表明AS具有較好的抗氧化活性，可作為一種有效、健康的抗氧化劑。但實(shí)驗(yàn)室自制固定化脂肪酶CALB與商品固定化酶的催化能力有一定的差距。