裴雪晨，陰法文，鐘 旭，劉惠麟，宋 亮，趙冠華，王永富，周大勇*

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.青島海智源生命科技有限公司，山東 青島 266200）

核桃（Juglans regia L.）因油脂含量高（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%~70%）而被認(rèn)為是一種有價(jià)值的油料作物[1]。核桃油不僅富含油酸和亞油酸，還含有生育酚、脂溶性維生素和植物甾醇等營(yíng)養(yǎng)功能因子，具有降低心臟病風(fēng)險(xiǎn)、保護(hù)心血管健康以及抗癌等活性[2]。核桃油既可用于直接烹飪，也可加工成水包油乳液產(chǎn)品，如牛奶、沙拉醬和醬汁。

核桃油中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）含量高（質(zhì)量分?jǐn)?shù)約70%），易被氧化。此外，在水包核桃油乳液中，因脂質(zhì)與水中的促氧化劑之間的接觸面積更大，脂質(zhì)氧化更快[3]。近年來(lái)，抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于提高富含PUFAs的植物油及其水包油乳液的穩(wěn)定性。其中，多酚類抗氧化劑因出色的抗氧化能力、安全性以及抗癌、抗炎和保護(hù)血管等多種活性而被廣泛應(yīng)用[4-5]。研究人員已經(jīng)使用多酚來(lái)延緩核桃油的氧化。例如Martínez等報(bào)道了迷迭香提取物可以延緩核桃油的氧化[4]。施琳等發(fā)現(xiàn)苦杏殼木醋液多酚在核桃油中表現(xiàn)出良好的抗氧化活性[5]。

酚酯是一種多酚衍生物，通過(guò)酯鍵將脂肪酸與酚結(jié)合而得，與游離多酚相比，具有更強(qiáng)的疏水性。因此，酚酯比游離多酚更容易與脂肪和油脂基體結(jié)合，并能更有效地發(fā)揮抗氧化能力[6]。近年來(lái)，游離多酚及其酚酯在散裝油和水包油乳液中的抗氧化性能得到了廣泛研究。在油脂中，游離多酚及其酚酯的抗氧化性能并不完全依賴于疏水性，極性的游離多酚抗氧化效果甚至強(qiáng)于疏水性強(qiáng)的酚酯[7]。然而在乳液中，人們發(fā)現(xiàn)其抗氧化性能與鏈長(zhǎng)之間呈現(xiàn)拋物線關(guān)系，特定疏水性閾值范圍內(nèi)的酚酯具有優(yōu)異的抗氧化性能，這種現(xiàn)象被稱為“截?cái)嘈?yīng)”[8]。然而，游離多酚及其酚酯在核桃油及其水包油乳液中的抗氧化性能尚未得到研究。

作者研究了沒食子酸（gallic acid，GA）及其烷基酯（沒食子酸乙酯（GA-C2）、沒食子酸丁酯（GAC4）、沒食子酸辛酯（GA-C8）、沒食子酸月桂酯（GA-C12）、沒食子酸十六烷基酯（GA-C16）、沒食子酸十八烷基酯（GA-C18））在核桃油和水包核桃油乳液中的抗氧化性能。此外，還采用1，1-二苯基-2-苦肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazl，DPPH）和2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除能力表征了GA及其烷基酯的抗氧化能力。研究結(jié)果為選擇適用于核桃油及其水包油乳液的抗氧化劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精制核桃油（不含抗氧化劑）：青島海智源生命科技有限公司提供。抗氧化劑GA、GA-C2、GA-C4、GA-C8、GA-C12、GA-C16和GA-C18：北京寶希迪有限公司產(chǎn)品。所有分析純?cè)噭┚鶠樘旖蚩泼軞W化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-N型電子分析天平：梅特勒-托利多有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A漩渦振蕩器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；Infinite M200多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Tican公司產(chǎn)品；UV-5500紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；T25數(shù)顯勻漿機(jī)：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡：日本尼康公司產(chǎn)品。

1.3 研究方法

1.3.1 油和乳液樣品的制備樣品中抗氧化劑的添加量見表1。對(duì)于含有GA及其烷基酯的油樣，添加量為0.47 mmol/kg（中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014[9]所允許的沒食子酸丙酯的最大添加量）。以上述核桃油樣品為原料，制備了以吐溫20為乳化劑的油與水體積比為6∶4的水包核桃油乳液。首先，將2 g吐溫20溶于48 g去離子水。然后，將油樣（12 g）與乳化劑溶液（8 g）混合，用高速勻漿機(jī)勻漿5 min制得乳液。采用倒置顯微鏡觀察新制備乳液的明場(chǎng)顯微圖。

表1 不同樣品中抗氧化劑的添加量Table 1 Addition of adding antioxidants in different samples

1.3.2 脂質(zhì)氧化程度測(cè)定將上述油和乳液樣品置于避光容器中，貯藏在60℃的烘箱中，在規(guī)定的時(shí)間取樣測(cè)定。

1）POV的測(cè)定 參考Wagner等的方法[10]。將乳液樣品（0.167 g）或油樣品（0.1 g）分別溶解在1.5 mL異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）和1.5 mL異辛烷中。取乳液的上層有機(jī)相或油的稀釋液（50μL）溶解在1.45 mL甲醇與正丁醇的混合溶液（體積比2∶1）中，與10μL二價(jià)鐵離子溶液（通過(guò)將0.806 g氯化鋇、1 g硫酸亞鐵、1 mL 10 mol/L鹽酸溶解在25 mL去離子水制得）和10μL 3.94 mol/L硫氰酸銨溶液在避光條件下反應(yīng)20 min，測(cè)定510 nm處的吸光度。根據(jù)過(guò)氧化氫異丙苯標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的POV。

2）共軛二烯值（CD）的測(cè)定 參考中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22500—2008的方法[11]并適當(dāng)修改。將0.016 7 g乳液樣品用異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）稀釋至10 mL，以233 nm處測(cè)定的吸光度表示，以異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）為空白，并計(jì)算CD。

式中：Aλ為樣品溶液在波長(zhǎng)λ處的吸光度；C為樣品溶液的質(zhì)量濃度，g/dL。

3）硫代巴比妥酸（TBA）值的測(cè)定 參考John等的方法測(cè)定[12]。將乳液樣品（0.167 g）或油樣（0.1 g）溶于1 mL氯仿與乙醇的混合溶液（體積比1∶1）中，然后加入2.5 mL TBA試劑。沸水浴10 min后冷卻，在2 500 r/min的條件下離心10 min，在532 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度。根據(jù)丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TBA值。

4）茴香胺值（p-AV）的測(cè)定 基于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24304—2009的方法[13]，并稍微修改。將乳液樣品（1.25 g）用異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）稀釋至25 mL，在350 nm處測(cè)定吸光度。將上述混合物（5 mL）與1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的p-茴香胺試劑（通過(guò)將0.25 g的p-茴香胺溶解于100 mL冰乙酸中制得）反應(yīng)10 min后，再次在350 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算p-AV值。

式中：Q為測(cè)定溶液中的樣品質(zhì)量濃度，1 g/dL；V為溶解試樣的體積，25 mL；A2為與p-茴香胺試劑反應(yīng)后樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 自由基清除能力測(cè)定

1）DPPH自由基清除能力的測(cè)定 根據(jù)Xu等的方法對(duì)GA及其烷基酯的DPPH自由基清除能力進(jìn)行評(píng)估[14]。將2 mL GA及其烷基酯的乙醇溶液（0.047 mmol/L）與2 mL DPPH乙醇溶液（0.3 mmol/L）渦旋1 min，然后避光貯存30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算DPPH自由基清除能力。

式中：As為樣品反應(yīng)液在517 nm處的吸光度；Ac為乙醇溶液在517 nm處的吸光度。

2）ABTS自由基清除能力的測(cè)定 采用Re等的方法并稍微改進(jìn)，以評(píng)價(jià)GA及其烷基酯的ABTS自由基清除能力[15]。制備好ABTS溶液后用乙醇稀釋，至其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。將0.8 mL GA及其烷基酯的乙醇溶液（0.047 mmol/L）與0.2 mL ABTS-乙醇試劑渦旋1 min，然后避光貯存6 min，于734 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算ABTS自由基清除能力。

式中：As為樣品反應(yīng)液在734 nm處的吸光度；Ac為乙醇溶液在734 nm處的吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件、Origin 2018和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析（Student-Newman-Keuls test）對(duì)平均值進(jìn)行比較和顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水包核桃油乳液的表征

新制備的含有GA及其烷基酯的水包核桃油乳液的外觀和微觀圖片見圖1和圖2。所有新鮮乳液呈白色，分散均勻。這些乳液的油滴呈圓形，表面光滑，彼此之間沒有交聯(lián)。此外，所制備的乳液在60℃加速貯存5 d仍保持物理穩(wěn)定性?？梢?，所制備的水包油乳液是成功的且抗氧化劑對(duì)乳液的微觀形貌影響不大。

圖1 新制備的水包核桃油乳液的外觀照片F(xiàn)ig.1 Macroscopic pictures of the freshly prepared walnut oil-in-water emulsions

圖2 新制備的水包核桃油乳液的明場(chǎng)微觀顯微圖Fig.2 Brightfield microscopy micrographs of the freshly prepared walnut oil-in-water emulsions

2.2 沒食子酸烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能

POV和CD分別是反映脂質(zhì)過(guò)氧化物和共軛二烯等初級(jí)氧化產(chǎn)物生成的指標(biāo)。如圖3（a）和圖3（b）所示，60℃加速貯藏時(shí)，兩項(xiàng)指標(biāo)均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，表明水包油乳液中持續(xù)生成初級(jí)氧化產(chǎn)物。與未添加抗氧化劑的水包油乳液相比，添加GA及其烷基酯的水包油乳液的POV和CD水平顯著降低（P<0.05），表明GA及其烷基酯具有良好的抗氧化性能。此外，烷基鏈長(zhǎng)影響沒食子酸烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能，其中GA-C2的抗氧化活性最強(qiáng)（P<0.05）。

采用TBA和p-AV來(lái)監(jiān)測(cè)丙二醛、2，4-二烯醛和2-烯烴醛等次級(jí)氧化產(chǎn)物的形成。如圖3（c）和圖3（d）所示，60℃加速貯藏過(guò)程中，兩項(xiàng)指標(biāo)均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，說(shuō)明初級(jí)氧化產(chǎn)物不斷分解為次級(jí)氧化產(chǎn)物。添加GA及其烷基酯的水包油乳液的TBA和p-AV水平均顯著低于未添加抗氧化劑的水包油乳液（P<0.05），再次彰顯了其良好的抗氧化性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示GA-C2具有最強(qiáng)的抗氧化活性（P<0.05）。

加速貯藏實(shí)驗(yàn)表明，GA及其烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能隨鏈長(zhǎng)增加出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，呈現(xiàn)“截?cái)嘈?yīng)”。此前也有研究報(bào)道游離多酚及其酚酯在水包油乳液體系中存在“截?cái)嘈?yīng)”。例如，Elder等觀察到烷基間苯二酚及其烷基酯在水包藻類油乳液中的抗氧化性能呈上升又下降趨勢(shì)，當(dāng)烷基鏈長(zhǎng)為20時(shí)表現(xiàn)出最佳的抗氧化性能[16]。Almeida等發(fā)現(xiàn)，在水包橄欖油乳液中，羥基酪醇及其脂肪酸酯的抗氧化性能隨鏈長(zhǎng)增加先升高后降低，羥基酪醇辛酯具有最優(yōu)的抗氧化性能[17]。

2.3 沒食子酸烷基酯在核桃油和均相溶液中的抗氧化性能

選擇POV和TBA分別監(jiān)測(cè)核桃油中初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物的生成。如圖4（a）和圖4（b）所示，在貯藏相同時(shí)間后，添加GA及其烷基酯的核桃油POV和TBA水平均顯著低于未添加抗氧化劑的核桃油（P<0.05），表明GA及其烷基酯具有較好的抗氧化活性。此外，烷基鏈長(zhǎng)對(duì)GA及其烷基酯在核桃油中的抗氧化性能影響不大，但整體的抗氧化性能隨鏈長(zhǎng)的增加而下降（P>0.05）。Laguerre等也發(fā)現(xiàn)，烷基鏈長(zhǎng)對(duì)綠原酸及其烷基酯在玉米油中的抗氧化性能影響不顯著[18]。

圖3 沒食子酸及其烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能Fig.3 Antioxidant performances of GA and its alkyl esters in walnut oil-in-water emulsions

GA及其烷基酯在乙醇溶液中的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力見圖5（a）和圖5（b）。0.047 mmol/L GA及其烷基酯的DPPH自由基清除能力為（63.35±0.75）%~（69.19±0.68）%，ABTS自由基清除能力為（67.69±0.45）%~（74.42±0.62）%?？梢?，烷基鏈長(zhǎng)對(duì)沒食子酸烷基酯在均相溶液中的抗氧化能力影響不大。

上述結(jié)果表明，在均相體系、散裝油體系和水包油乳液體系中，烷基鏈長(zhǎng)對(duì)GA及其烷基酯的抗氧化性能有不同的影響。在均相溶液中，GA及其烷基酯通過(guò)酚羥基提供氫原子來(lái)清除自由基[19]。由于它們都有3個(gè)酚羥基。因此，其在均相溶液中的抗氧化性能相似。

然而，在散裝油體系和水包油乳液體系中，抗氧化劑的性能不僅與其化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，還與其物理性質(zhì)有關(guān)。在散裝油體系中，抗氧化劑性能受其在油脂中的溶解度和油脂中存在的納米環(huán)境（微量水分和表面活性劑可組成反膠束，親水抗氧化劑易與其接近而發(fā)揮作用）的影響[20]。此外，Zhong等研究指出，抗氧化劑的濃度會(huì)進(jìn)一步影響上述兩個(gè)影響因素[21]。在高濃度下，納米環(huán)境的影響大于抗氧化劑在油脂中溶解度的影響，因此親水抗氧化劑的效率優(yōu)于疏水抗氧化劑，而在低濃度下則相反。作者使用的核桃油可能含有微量的水，因此可形成反膠束。同時(shí)，油樣中GA及其烷基酯的添加量為0.47 mmol/kg，是中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014[9]允許的沒食子酸丙酯的最大添加量，濃度較高。因此，GA及其烷基酯在核桃油中的抗氧化性能隨鏈長(zhǎng)（疏水性）的增加而下降，符合“極性悖論”[20]。

在水包油乳液體系中，由于油-水界面是氧化的關(guān)鍵位點(diǎn)，抗氧化劑在水相、油相和油-水界面的分配對(duì)抗氧化效率有關(guān)鍵影響。同時(shí)，抗氧化劑的分配會(huì)受到其疏水性的影響[22]。由于烷基酯的疏水性由其鏈長(zhǎng)決定，在一定鏈長(zhǎng)閾值范圍內(nèi)的烷基酯更容易分布在油水界面上。因此，具有適當(dāng)疏水性的GA-C2可以更好地集中在油水界面上發(fā)揮抗氧化作用。

圖4 沒食子酸及其烷基酯在核桃油中的抗氧化性能Fig.4 Antioxidant performances of GA and its alkyl esters in walnut oils

圖5 沒食子酸及其烷基酯的自由基清除能力Fig.5 Scavenging ability of GA and its alkyl esters

3 結(jié)語(yǔ)

在核桃油和水包核桃油乳液中，烷基鏈長(zhǎng)對(duì)沒食子酸及其烷基酯的抗氧化能力影響不同。在水包核桃油乳液中，隨著烷基鏈長(zhǎng)的增加，抗氧化效率先增加后下降，其中GA-C2的抗氧化效率最高，呈“截?cái)嘈?yīng)”。而在核桃油中，其抗氧化效率隨鏈長(zhǎng)增加呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著，符合“極性悖論”。這有助于選擇合適的抗氧化劑來(lái)穩(wěn)定核桃油及其水包油乳液。