胡海浩，黃鑒濤，馬嘉霖，楊 碩，閆秀英，簡紀(jì)常

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

魚淋巴囊腫病毒中國株（Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn）是牙鲆（Paralichthys olivaceus）淋巴囊腫病的病原[1]，致使患魚在皮膚、鰭、尾部等長有囊腫，給牙鲆養(yǎng)殖造成了重大損失。對(duì)LCDVcn 及牙鲆淋巴囊腫病的研究已取得一定進(jìn)展[2-6]，但牙鲆淋巴囊腫病的有效防控依然是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的難題，其原因之一是LCDV-cn 的致病機(jī)制知之甚少[7]。微小RNA（miRNA）可通過與靶基因結(jié)合對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，從而參與多種病理、生理過程[8]。因此，對(duì)LCDV-cn 感染過程中miRNA 的調(diào)控作用進(jìn)行研究，可在miRNA 層面解析LCDV-cn的致病機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)不同物種miR-146a的序列高度保守，提示miR-146a在生物體的生理、病理過程中可能發(fā)揮重要作用[8]。已有研究表明miR-146a在多種腫瘤中高度表達(dá)，調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的許多生物學(xué)過程，而且miR-146a 的調(diào)控具有促腫瘤發(fā)展的作用，抑制miR-146a 的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞的致瘤性和侵襲力下降[9-10]。更有研究表明miR-146a 調(diào)控病毒的感染過程，如在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染過程中，miR-146a 通過抑制機(jī)體抗病毒反應(yīng)促進(jìn)HBV 復(fù)制和蛋白表達(dá)[11]；丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染可誘導(dǎo)miR-146a 的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)病毒感染[12]；在人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染中，miR-146a 發(fā)揮多重作用，調(diào)控HPV 的感染進(jìn)展[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a 的上調(diào)與EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起的腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)[14-15]、有些病人miR-146a 的下調(diào)可能與新型冠狀病毒（Corona covid-19 virus，COVID-19）感染引起的嚴(yán)重癥狀有關(guān)[16]、miR-146a 可調(diào)控人類免疫缺陷病毒（Human immunodefdiciency virus type 1,HIV-1）感染[17]、miR-146a 的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）感染[18]，等。上述研究表明miR-146a 在病毒感染和腫瘤發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。

本課題組前期研究[19]表明，草魚miR-146a（Ctenopharyngodon idellamiR-146a，cid-miR-146a）在LCDV-cn 感染草魚卵巢細(xì)胞系（grass carp ovary cells，GCO）過程中存在顯著差異表達(dá)。因此，本研究在LCDV-cn感染GCO 過程中，對(duì)cid-miR-146a進(jìn)行鑒定和表達(dá)特性分析，并探索cid-miR-146a 的調(diào)控作用，為在miRNA 層面解析LCDV-cn 的致病機(jī)制等提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LCDV-cn 分離自患淋巴囊腫病的牙鲆，保存于本實(shí)驗(yàn)室；GCO細(xì)胞購買于深圳檢驗(yàn)檢疫局。

本研究所用引物見表1，在上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 LCDV-cn感染GCO細(xì)胞

用25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶于28 ℃培養(yǎng)GCO 細(xì)胞，具體操作參照文獻(xiàn)[2,19]，所用培養(yǎng)基為MEM 培養(yǎng)基[含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）]，正常傳代約48 h 單層細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，吸出培養(yǎng)液，取1 mL 的LCDV-cn 懸液（滴度濃度105.5TCID50/mL[19]）進(jìn)行感染（同時(shí)設(shè)未感染組為對(duì)照組），于20 ℃下孵育1 h后，取出病毒懸液，加入4 mL 維持液（含體積分?jǐn)?shù)2%FBS 的MEM 培養(yǎng)基）于20 ℃下繼續(xù)感染實(shí)驗(yàn)，并定時(shí)取樣。

1.3 電鏡負(fù)染

取10 mL 滴度濃度（105.5TCID50/mL）的LCDV-cn懸液[19]，于室溫和-80 ℃反復(fù)凍融4 次，于4 ℃、1 000g條件下離心30 min，取上清用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%磷鎢酸進(jìn)行染色，于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行電鏡觀察。

1.4 頸環(huán)（Stem-loop）RT-PCR

取LCDV-cn感染GCO 72 h時(shí)樣品1瓶（細(xì)胞培養(yǎng)瓶），胰酶消化后取1×106個(gè)細(xì)胞，于室溫、1 000g條件下離心3 min，棄上清后，加入1 mL Trizol，按照TRIzol?LS試劑盒說明書提取RNA，并用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。用提取的RNA和頸環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物RT-cid-miR-146a（表1），按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser 說明書進(jìn)行特異性反轉(zhuǎn)錄，制備頸環(huán)RT-PCR模板cDNA，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

根據(jù)前期研究結(jié)果[19]，采用頸環(huán)RT-PCR 擴(kuò)增cid-miR-146a，所用引物cid-miR-146a-F 和cid-miR-146a-R 見表1。PCR 擴(kuò)增體系為50 μL，包含EX-Taq 25 μL、cDNA 3 μL（質(zhì)量濃度約為50 μg/mL）、cid-miR-146a-F 2 μL、cid-miR-146a-R 2 μL 和ddH2O 18 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，循環(huán)40 次。然后用3%（質(zhì)量體積比）瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。頸環(huán)RT-PCR 擴(kuò)增獲得目的片段的長度為60 bp，包括上游序列4 bp（5′-GCGC-3′）、cid-miR-146a序列23 bp（5′-TGAGA ACTGAATTCCATAGATGG-3′）、頸環(huán)序列33 bp（5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATC GAC-3′）。將cid-miR-146a 插入至pMD18-T 載體，然后轉(zhuǎn)化至DH5α，于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。按藍(lán)白斑篩選方法選取陽性菌落[1]，并將陽性菌落送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 定量PCR

收集LCDV-cn 感染GCO 細(xì)胞后0、4、8、16、24、48、72、144 和196 h 樣品，然后制備cDNA（同前）用于定量PCR。所用引物cid-miR-146a-F、cid-miR-146a-R、U6F和U6R見表1，定量PCR總體積為10 μL，包含TB Green Premix Ex Taq II 5 μL、cDNA 1 μL、cid-miR-146a-F 1 μL、cid-miR-146a-R 1 μL 和ddH2O 2 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，循環(huán)40次。

上調(diào)下調(diào)實(shí)驗(yàn)中，cid-miRNA-146a 在GCO 細(xì)胞的表達(dá)定量。上調(diào)下調(diào)實(shí)驗(yàn)包括4 組：上調(diào)組（轉(zhuǎn)染cid-miR-146a mimics 模擬物，轉(zhuǎn)染濃度為20 nnmol/L）、下調(diào)組（轉(zhuǎn)染cid-miR-146a inhibitor 抑制物，轉(zhuǎn)染濃度為20 nnmol/L）、陰性對(duì)照（NC組：轉(zhuǎn)染NC，轉(zhuǎn)染濃度為20 nnmol/L，）和陽性對(duì)照（LCDV-cn 正常感染組，無轉(zhuǎn)染）。cid-miR-146a mimics、cid-miR-146a inhibitor 和NC的序列分別為5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG-3′、5′-CCAUCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3′和5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，于上海生工生物技術(shù)有限公司合成。用不含抗生素的MEM（含體積分?jǐn)?shù)10%FBS）培養(yǎng)GCO細(xì)胞，當(dāng)GCO細(xì)胞于12～16 h 單層生長至70%～90%時(shí)，使用Lipo‐fectamineTMRNAiMAX 將cid-miR-146a mimics、cidmiR-146a inhibitor 和NC 分別轉(zhuǎn)染至GCO 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用LCDV-cn進(jìn)行感染，于20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。然后，收集LCDV-cn 感染GCO 細(xì)胞0、4、8、16、24、48、72、144 和196 h 樣品，制備cDNA 用于cid-miR‐NA-146a 的定量。定量PCR 所用引物、定量PCR 體系和反應(yīng)條件同上述cid-miRNA-146a的表達(dá)定量。

cid-miRNA-146a 靶基因Flt1的表達(dá)定量。樣品制備同上述上調(diào)下調(diào)實(shí)驗(yàn)。定量PCR 所用引物RT-Flt-F、RT-Flt-R、18s-F 和18s-R 見表1，定量PCR體系和反應(yīng)條件同上述cid-miRNA-146a 的表達(dá)定量。

根區(qū)溫度對(duì)嫁接黃瓜苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響…………………………… 劉念奇，宋 陽，孫世君，高 宇，吳佳旺，崔曉晗（118）

LCDV-cnmcp（主要衣殼蛋白，major capsid protein）的表達(dá)定量（代表LCDV-cn 的復(fù)制[7]）。樣品制備同上述上調(diào)下調(diào)實(shí)驗(yàn)。定量PCR 所用引物RT-LCDV-MCP-F、RT-LCDV-MCP-R、18s-F 和18s-R見表1，定量PCR 體系和反應(yīng)條件同上述cid-miR-146a的表達(dá)定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 24 軟件，用2-ΔΔCt法[23]進(jìn)行單因素方差分析，并統(tǒng)計(jì)差異顯著與否（P<0.05或P<0.01）。

1.7 cid-miR-146a靶基因預(yù)測

應(yīng)用RNAhybrid（https://bibiserv.cebitec.unibielefeld.de/rnahybrid/）、miRanda（http://www.microrna.org/）和TargetScan（http://www.targetscan.org/fish_62/）軟件預(yù)測cid-miR-146a的靶基因。3 個(gè)軟件預(yù)測到的共同靶基因作為靶向目標(biāo)進(jìn)行后續(xù)研究。

1.8 雙熒光素酶系統(tǒng)驗(yàn)證cid-miR-146a的靶基因

應(yīng)用RNA22 預(yù)測cid-miR-146a 靶基因的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增靶基因片段的引物為pmirGLO-Flt1-F和pmirGLO-Flt1-R（表1）。RT-PCR總體積為50 μL，包含ExTaq?酶25 μL、pmirGLOFlt1-F 2 μL、pmirGLO-Flt1-R 2 μL、cDNA 3 μL、ddH2O 18 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃3 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，進(jìn)行亞克隆。通過菌落PCR（引物見表1）和測序進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的靶基因片段插入至雙熒光素酶啟動(dòng)子pmirGLO 載體上，構(gòu)建pmirGLO-Flt1 載體，并進(jìn)行亞克隆。通過菌落PCR和測序進(jìn)行驗(yàn)證。將正確構(gòu)建的pmirGLO-Flt1載體分別與cid-miR-146a mimics、cid-miR-146a inhibitor 和NC 共轉(zhuǎn)染至GCO細(xì)胞，于20 ℃培養(yǎng)48 h，檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.9 生物信息學(xué)方法預(yù)測cid-miR-146a調(diào)控LCDV-cn感染的信號(hào)通路

應(yīng) 用GO（http://geneontology.org/）和KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫對(duì)cid-miR-146a可能參與的信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCDV-cn感染GCO細(xì)胞的過程

LCDV-cn感染GCO細(xì)胞后，呈現(xiàn)的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect,CPE）與文獻(xiàn)[2]一致。LCDVcn 感染GCO 細(xì)胞后3 d，細(xì)胞聚集、呈現(xiàn)明顯的“疤痕”現(xiàn)象，“疤痕”一直持續(xù)到約感染后6 d，6 d 之后細(xì)胞逐漸脫落、裂解，出現(xiàn)空洞（圖1）。

圖1 LCDV-cn感染GCO細(xì)胞Fig.1 GCO cells challenged with LCDV-cn

2.2 感染用LCDV-cn懸液電鏡負(fù)染

LCDV-cn 以滴度濃度105.5TCID50/mL[19]進(jìn)行后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)，感染用病毒懸液進(jìn)行電鏡負(fù)染可看到病毒粒子（直徑約110 nm）（圖2）。

圖2 感染用LCDV-cn懸液電鏡負(fù)染Fig.2 Electron microscope of negative staining with LCDV-cn suspension for infection

2.3 cid-miR-146a的擴(kuò)增

電泳結(jié)果表明28S、18S和5S rRNA條帶完整清晰(圖3)，說明提取的樣品總RNA 無降解，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。頸環(huán)RT-PCR 擴(kuò)增后，電泳檢測表明獲得目的片段（圖4(a)）。經(jīng)菌落PCR（圖4(b)）和測序驗(yàn)證獲得的片段是正確的，即為cid-miR-146a。cidmiR-146a 的序列為5′-UGAGAACUGAAUUCCAU‐AGAUGG-3′（23 bp），經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，cidmiR-146a與其他物種miR-146a同源（表2）。

表2 已知的miR-146a序列Table 2 Known miR-146a sequences

圖3 提取的樣品總RNAFig.3 Extracted total RNA of samples

圖4 cid-miR-146a頸環(huán)RT-PCR和菌落PCRFig.4 Stem-loop RT-PCR and colony PCR of cid-miR-146a

2.4 cid-miR-146a 在LCDV-cn 感染GCO中的表達(dá)特性

依據(jù)LCDV-cn 感染GCO 細(xì)胞出現(xiàn)CPE 現(xiàn)象的變化特點(diǎn)，選取LCDV-cn 感染后0、4、8、16、24、48、72、144和196 h樣品，進(jìn)行差異表達(dá)分析。由圖5可知，從0 到72 h，cid-miR-146a 的表達(dá)量逐漸增加，144和196 h時(shí)cid-miR-146a的表達(dá)量下降。

圖5 cid-miR-146a在LCDV-cn感染GCO過程中的表達(dá)Fig.5 Expression of cid-miR-146a in GCO cells infected with LCDV-cn

2.5 cid-miR-146a靶基因的預(yù)測

RNAhybrid 預(yù)測到cid-miR-146a 的靶基因?yàn)镚imap8（GTP 酶免疫相關(guān)蛋白8，GTPase immuneassociated protein 8）、LEPR（瘦素受體，leptin receptor）、Flt1（Fms 相關(guān)酪氨酸激酶1，F(xiàn)ms-related tyrosine kinase 1）和DLGAP5（Discs 大同源相關(guān)蛋白5，Discs large homologous affinity protein 5），其總評(píng)分值分別為-0.41、-0.01、-0.32和-0.046（評(píng)分值為負(fù)數(shù)，靶基因的概率大）。miRanda 預(yù)測到cid-miR-146a 的靶基因?yàn)镻DIA3（蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3,protein disulfide-isomerase A3）、irak1（細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-2）、LOX（賴氨酰氧化酶，lysyl oxidase）和Flt1（Fms 相關(guān)酪氨酸激酶1，F(xiàn)ms-related tyrosine kinase 1），其總評(píng)分值分別為-0.013、-0.046、-0.19和-0.31。TargetScan 預(yù)測到cid-miR-146a 的靶基因?yàn)镈IO-1（碘代甲狀腺氨酸脫碘酶1，iodothyronine deiodinase 1）、Flt1（Fms 相關(guān)酪氨酸激酶1，F(xiàn)msrelated tyrosine kinase 1）和Gimap8（GTP酶免疫相關(guān)蛋白8，GTPase immune-associated protein 8），其總評(píng)分值分別為-0.18、-0.32和-0.41。預(yù)測到的靶基因與癌癥和腫瘤發(fā)生、抗原呈遞和感染反應(yīng)相關(guān)。

此3 個(gè)軟件均預(yù)測到Flt1是cid-miR-146a 的靶基因，因此后續(xù)以Flt1為靶標(biāo)開展實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用RNA22 預(yù)測到Flt1含有 結(jié)合cid-miRNA-146a 的位點(diǎn)（折疊能為-72.38 kJ/mol，P值為0.353），F(xiàn)lt1與cid-miRNA-146a 結(jié) 合 的 位 點(diǎn) 序 列 為：5′-UACA‐AAAGGGAGGUUCAGUUCUC-3′（圖6），位于Flt1mRNA（GenBank 編碼：XM_039667029）的280-302堿基（圖6）。

圖6 cid-miR-146a靶向Flt1基因的結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Binding sites of the gene Flt1 targeted with cid-miR-146a

2.6 cid-miR-146a的靶基因Flt1驗(yàn)證

選取含靶位點(diǎn)的Flt1片段，其長度為456 bp，位于Flt1mRNA 的249-704 堿基。經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增后將目的Flt1片段插入至pmirGLO 載體，菌落PCR、XhoⅠ和SalⅠ雙酶切（圖7）和測序結(jié)果說明目的片段是正確的，成功構(gòu)建pmirGLO-Flt1，并應(yīng)用雙光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證靶基因。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測雙熒光素酶的活性結(jié)果顯示（圖8）：共轉(zhuǎn)染cid-miR-146a mimics 和pmirGLO-Flt1 后，雙熒光素酶活性顯著下降，并與其它兩組（共轉(zhuǎn)染cid-miR-146a inhibitor 或NC）差異顯著（P<0.05），表明Flt1確實(shí)是cid-miR-146a的靶基因。

圖7 pmirGLO-Flt1雙酶切Fig.7 Double enzyme digestion of pmirGLO-Flt1

圖8 雙熒光素酶活性檢測Fig.8 Detection of luciferase activity

2.7 cid-miR-146a在上調(diào)下調(diào)GCO細(xì)胞中的表達(dá)量

對(duì)cid-miR-146a 進(jìn)行上調(diào)下調(diào)后，定量PCR 結(jié)果表明（圖9）：在cid-miR-146a 上調(diào)和下調(diào)的GCO細(xì)胞中，cid-miR-146a 的表達(dá)量與陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組中的表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05）；cidmiR-146a 上調(diào)組中，cid-miR-146a 的表達(dá)量明顯升高（P<0.05），而在cid-miR-146a 下調(diào)組中，cid-miR-146a 的表達(dá)量明顯下降（P<0.05）。由此也說明轉(zhuǎn)染cid-miR-146a mimics 和cid-miR-146a inhibitor 的濃度20 nnmol/L 是合適的，后續(xù)研究按此濃度20 nnmol/L進(jìn)行。

圖9 上調(diào)下調(diào)實(shí)驗(yàn)中cid-miRNA-146a在GCO細(xì)胞的表達(dá)Fig.9 Expression of cid-miRNA-146a in GCO cells for the up-down regulation experiment

2.8 cid-miR-146a對(duì)其靶基因Flt1的調(diào)控

對(duì)cid-miR-146a 進(jìn)行上調(diào)下調(diào)后，靶基因Flt1定量PCR 結(jié)果表明（圖10）：在cid-miR-146a 上調(diào)組，F(xiàn)lt1的表達(dá)量最少，與其它組的表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05）；在cid-miR-146a下調(diào)組，F(xiàn)lt1的表達(dá)量最多，與其它組的表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05）；在陽性對(duì)照組，F(xiàn)lt1的表達(dá)量先下降然后上升，在72和144 h時(shí)最少。

圖10 GCO細(xì)胞中Flt1的表達(dá)Fig.10 Expression of the gene Flt1 in GCO cells

2.9 cid-miRNA-146a對(duì)LCDV-cn復(fù)制的調(diào)控

對(duì)cid-miR-146a 進(jìn)行上調(diào)下調(diào)后，LCDV-cnmcp基因定量PCR 結(jié)果（mcp的表達(dá)代表LCDV-cn的復(fù)制）表明（圖11）：在cid-miR-146a 上調(diào)組，mcp基因的表達(dá)量最多，峰值在72 h，與其它組的表達(dá)量差異顯著（P<0.05）；在cid-miR-146a下調(diào)組，mcp基因的表達(dá)量最少，與其它組的表達(dá)量差異顯著（P<0.05）；在陽性對(duì)照組（LCDV-cn 正常感染），mcp基因的表達(dá)量先上升后下降，與上調(diào)組趨勢(shì)一致，峰值在72 h。由此說明，cid-miR-146a 上調(diào)促進(jìn)LCDV-cn 在GCO 細(xì)胞的復(fù)制，cid-miR-146a 下調(diào)后LCDV-cn在GCO細(xì)胞的復(fù)制降低。

圖11 GCO細(xì)胞中mcp基因的表達(dá)Fig.11 Expression of the mcp gene in GCO cells

2.10 生物信息學(xué)預(yù)測cid-miR-146a 在LCDV-cn 感染過程中調(diào)控的信號(hào)通路

應(yīng)用GO 和KEGG 預(yù)測到cid-miR-146a 調(diào)控的信號(hào)通路可能包括Toll樣受體（Toll-like receptor）信號(hào)通路（P值為0.005 6）、NF-кB（nuclear factor κB）信號(hào)通路（P值為0.009 4）和ErbB（receptor tyrosine kinases）信號(hào)通路（P值為0.0266 7）等。Toll 樣受體可識(shí)別病原體、快速激活先天免疫，NF-кB可調(diào)節(jié)涉及免疫、細(xì)胞存活等的基因，ErbB 可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和存活等（https://www.genome.jp/kegg/）。

3 討論

miRNA 在病毒感染和腫瘤發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用，miR-146a 作為不同生物中比較保守的miRNA，已成為抗病毒感染和抗腫瘤等研究的熱點(diǎn)[9-18]。高通量測序表明在LCDV-cn感染GCO 過程中，cid-miR-146a 的表達(dá)存在顯著差異[19]，本研究以cid-miR-146a 為目標(biāo)miRNA，探索cid-miR-146a 對(duì)其靶基因和LCDV-cn復(fù)制的調(diào)控作用。

LCDV-cn 感染GCO 后的CPE 現(xiàn)象呈現(xiàn)出“疤痕”和空洞，與Zhang等[2]的研究一致。在本研究中，LCDV-cn 感染GCO 后CPE 現(xiàn)象的變化與cid-miR-146a的表達(dá)變化時(shí)間點(diǎn)呈正相關(guān)：在LCDV-cn 感染GCO 后，細(xì)胞聚集“疤痕”形成的過程（圖2），cidmiR-146a 的表達(dá)一直上調(diào)（圖4）；細(xì)胞脫落、裂解、“疤痕”消失的過程（圖2），cid-miR-146a的表達(dá)下調(diào)（圖4）?？傊贚CDV-cn 感染GCO 細(xì)胞過程中，cid-miR-146a的表達(dá)先上升（3 d前）后下降（6 d后）。在病毒感染的不同時(shí)期，cid-miR-146a 呈先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式，這在其它病毒感染中也得以發(fā)現(xiàn)，如，在HPV感染中，在感染的起始階段miR-146a表達(dá)上調(diào)，在感染后期miR-146a表達(dá)下調(diào)[13]。

本研究表明cid-miR-146a靶向Fms相關(guān)酪氨酸激酶1 (FLT1)的編碼區(qū)而發(fā)揮其調(diào)控作用。FLT1是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體之一，F(xiàn)lt1廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，與血管生成和腫瘤發(fā)生相關(guān)[24]。在本研究中，LCDV-cn 感染后引起的淋巴囊腫病是一種皮膚瘤（可自愈），在較大的囊腫上有肉眼可見的紅色血管[25]，說明在LCDV-cn 引起的皮膚瘤發(fā)展過程中確實(shí)存在著血管生成。研究表明在多種腫瘤中Flt1的表達(dá)異常，如，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Flt1的表達(dá)高度上調(diào)[24]、在頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌中Flt1選擇性上調(diào)表達(dá)[26]等。本研究發(fā)現(xiàn)在LCDV-cn 感染GCO細(xì)胞過程中，cid-miR-146a 對(duì)其靶基因Flt1的表達(dá)起著負(fù)調(diào)控作用（圖10），與HPV 感染中miR-146a的調(diào)控相似。在HPV 感染引起的腫瘤中，miR-146a靶向調(diào)控表皮生長因子受體（EGFR），且miR-146a負(fù)調(diào)控EGFR的表達(dá)[27]。在其它一些腫瘤研究中，也發(fā)現(xiàn)了miRNA 對(duì)Flt1的負(fù)調(diào)控作用，如，miR-139-5p 靶向Flt1抑制Flt1的表達(dá)，從而調(diào)控人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[24]。此外，研究發(fā)現(xiàn)降低或抑制Flt1的表達(dá)可控制腫瘤的發(fā)展等：乳腺癌中Flt1的抑制可以降低腫瘤轉(zhuǎn)移效率[28]，敲降Flt1的表達(dá)可以阻止膠質(zhì)瘤細(xì)胞的傳播[29]，在絨膜癌細(xì)胞中Flt1基因是特定類型細(xì)胞腫瘤的抑制劑[30]。而且，血管生成對(duì)腫瘤發(fā)展來說是必不可少的，F(xiàn)LT1是血管生成和腫瘤發(fā)生的主要調(diào)控因子之一[24,31]，因此，F(xiàn)lt1已成為一種新型潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[28-29]。雖然本研究表明cid-miR-146a對(duì)Flt1的表達(dá)起著負(fù)調(diào)控作用，但其對(duì)LCDV-cn感染的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

本研究結(jié)果進(jìn)一步表明LCDV-cn的復(fù)制與cidmiR-146a 的表達(dá)呈正相關(guān)（圖11），隨著cid-miR-146a 的上調(diào)下調(diào)而變化。在其它病毒感染中，也發(fā)現(xiàn)miR-146a的表達(dá)與病毒復(fù)制呈正相關(guān)，并促進(jìn)病毒復(fù)制。如，miR-146a 促進(jìn)HBV 的復(fù)制，可提高HBV 引起肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[32-33]。此外，目前研究表明在病毒感染中，miR-146a 調(diào)控免疫相關(guān)等信號(hào)通路，從而調(diào)控病毒的復(fù)制。如，在流感病毒H1N1 和H3N2 感染中，miR-146a 參與的信號(hào)通路包括Toll樣受體信號(hào)通路、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和凋亡[34]；在EBV 感染過程中，miR-146a 參與淋巴細(xì)胞信號(hào)通路和干擾素信號(hào)通路等[35]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測到cid-miR-146a可能參與調(diào)控Toll 樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、NF-кB 信號(hào)通路和ErbB信號(hào)通路，這些信號(hào)通路與免疫和腫瘤發(fā)生相關(guān)。因此，推測cid-miR-146a 調(diào)控的LCDV-cn 致病機(jī)制可能涉及與宿主免疫因子的互作、腫瘤發(fā)生發(fā)展等，cid-miR-146a 對(duì)LCDV-cn 感染的調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。本研究還發(fā)現(xiàn)Flt1的表達(dá)與LCDVcn 的復(fù)制呈負(fù)相關(guān)，但Flt1對(duì)LCDV-cn 復(fù)制的調(diào)控機(jī)制有待解析。