李 明，包鵬云，陶 韋，南海林，徐 哲，曹淑青，姜玉聲，馬悅欣

（1.大連海洋大學(xué)/遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116026；3.大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司，遼寧 大連 116039）

刺參（Apostichopus japonicus）又名仿刺參，隸屬于棘皮動(dòng)物門海參綱，是我國重要的海珍品養(yǎng)殖種類，其規(guī)模化養(yǎng)殖主要集中在遼寧的大連、盤錦、錦州、葫蘆島等，山東的煙臺、青島等和福建的霞浦等[1]，是我國海水養(yǎng)殖重要支柱產(chǎn)業(yè)之一[2]。然而，隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，由病原微生物引起的多種傳染性疾病經(jīng)常發(fā)生，給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，已成為該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸[1,3]?？股氐然瘜W(xué)藥物的使用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)[4-5]，抗生素不合理使用會(huì)導(dǎo)致漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境污染和水產(chǎn)品中藥物殘留，危害人類健康[6]。因此，環(huán)境友好的生物防控方法（如使用益生菌和免疫多糖類等免疫增強(qiáng)劑），越來越多地用于刺參健康養(yǎng)殖和病害防治[1,7]。

學(xué)界對益生菌在中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行了研究[7]。酵母益生菌可促進(jìn)魚[8]、蝦[9]和海參[7]的生長、消化酶活力和先天免疫反應(yīng)。單一酵母菌梅奇酵母（Metschnikowiasp.）C14和仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）C21可提高幼參生長和消化酶活力[10-11]，增強(qiáng)其免疫反應(yīng)[12-13]。幼參腸道中可培養(yǎng)梅奇酵母C14細(xì)胞數(shù)量需維持在105cfu·g-1方有提高胰蛋白酶和溶菌酶（LSZ）活力的作用[14]。與添加單一益生菌相比，飼喂添加混合益生菌飼料的幼參特定生長率和消化酶活力更高，免疫反應(yīng)更強(qiáng)[15-16]。然而，不同菌株組合的混合益生菌對幼參的影響效果不同[15-16]，關(guān)于刺參腸道中混合益生菌細(xì)胞數(shù)量與其有益效果之間的相關(guān)性尚未見報(bào)道?；趩我唤湍妇菲娼湍窩14和仙人掌有孢漢遜酵母C21的有益作用[10-13]，筆者研究二者混合添加對幼參生長、消化酶活力和免疫反應(yīng)的影響，分析2株酵母菌在幼參腸道內(nèi)數(shù)量與消化酶活力及免疫參數(shù)的相關(guān)性，為益生酵母菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康幼參購自大連市某刺參養(yǎng)殖場。基礎(chǔ)飼料（固態(tài)）配方見文獻(xiàn)[12]，具體組分質(zhì)量分?jǐn)?shù) (%) 為：豆粕10、魚粉8、馬尾藻25、脫膠海帶粉30、麥飯石10、石粉16.5和多維預(yù)混料0.5；營養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）為粗蛋白16、粗脂肪5.5、粗纖維16和灰分31。

1.2 含菌飼料制備、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

從健康刺參腸道分離梅奇酵母C14和仙人掌有孢漢遜酵母C21[12-13]。將C14 和C21 接種至酵母膏胨葡萄糖液體培養(yǎng)基，于25 ℃下振蕩培養(yǎng)16 h，將菌懸液離心（4 000 r/min，10 min），用生理鹽水重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，添加至基礎(chǔ)飼料，分別制備含C14 (1×105g-1)、C21 (1×105g-1)、C14(1×105g-1)+C21(1×105g-1)的飼料。

幼參暫養(yǎng)14 d 后，隨機(jī)?。?.92±0.01）g 的健康幼參至12 個(gè)盛有100 L 過濾海水的塑料桶中，每桶100 頭，靜水充氣飼養(yǎng)。將幼參分為4 組，對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗(yàn)組分別飼喂添加C14、C21及混合菌（C14+C21）飼料（分別記為M、H 和MH 組），每組設(shè)3 個(gè)平行。每日16:00 按體質(zhì)量5%飼喂1 次。M、H 和MH 組幼參飼喂含菌飼料28 d后改飼基礎(chǔ)飼料至38 d 實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間水溫17～22 ℃，pH 7.8～8.2,鹽度33～34。日換水50 L，吸底。

分別在飼養(yǎng)7、14、21、28、29、31、33、35、38 d 時(shí)每桶隨機(jī)取幼參10 頭，停飼16 h[17]。用無菌海水沖洗幼參體表，立即剪斷尾部，解剖，每頭幼參取體腔液50 μL，合并，加入含等體積抗凝劑[18]的離心管，混勻，取400 μL 進(jìn)行體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)，吞噬活力、呼吸爆發(fā)測定。其余體腔液離心（10 000 r/min，4 ℃，10 min），得上清液（CF）；沉淀用體腔細(xì)胞等滲液[18]重懸，將重懸液置于冰上超聲破碎，離心（10 000 r/min，4℃，10 min），得體腔細(xì)胞裂解液上清液（CLS）。制備的CF 和CLS 用于測定LSZ 和總一氧化氮合成酶（T-NOS）活力。

剖取10 頭幼參腸道，用無菌海水沖洗后合并，加入9 倍體積預(yù)冷生理鹽水，勻漿。取部分勻漿液進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)，剩余部分離心（6 000 r/min，4 ℃，10 min），上清液用于消化酶活力測定。

1.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[19]測定體腔液、CLS和腸道勻漿液上清液的可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.4 腸道酵母菌計(jì)數(shù)

將腸道勻漿液梯度稀釋，取100 μL涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂平板，25 ℃下培養(yǎng)7 d，計(jì)數(shù)。

1.5 幼參生長測定

分別在飼喂前、飼喂7、14、21、28 d 時(shí)稱量幼參（30 頭/桶）體質(zhì)量，參考文獻(xiàn)[10]計(jì)算幼參的特定生長率（SGR）。

1.6 消化酶活力測定

使用南京建成科技有限公司試劑盒參照檢測方法說明書通過比色分析測定幼參腸道胰蛋白酶和脂肪酶活力[15]。

1.7 免疫參數(shù)測定

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光鏡下計(jì)數(shù)體腔細(xì)胞。根據(jù)Ma 等[13]方法測定體腔細(xì)胞吞噬活力。體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)用硝基四氮唑藍(lán)（NBT）還原實(shí)驗(yàn)[20]測定，其中測定溫度由37 ℃改為室溫（約20 ℃）。630 nm處測定溶解細(xì)胞質(zhì)甲臜的光密度（OD），呼吸爆發(fā)以每106個(gè)細(xì)胞的OD 值表示。LSZ 和T-NOS 活力的測定參考文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS Version 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。生長、消化酶活力和免疫參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。用Levene 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若滿足方差齊性，使用Tukey 法進(jìn)行事后多重比較；若方差不齊，差異顯著性采用Welch 近似值，并用Tamhane’s T2 法進(jìn)行事后多重比較。如數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，則采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。如P<0.05，則差異顯著。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析消化酶活力和免疫參數(shù)數(shù)據(jù)與C14 和C21 細(xì)胞數(shù)量之間的相關(guān)性，顯著性采用雙尾檢驗(yàn)，酵母菌細(xì)胞數(shù)量使用常用對數(shù)轉(zhuǎn)換值。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼參腸道中酵母菌C14和C21細(xì)胞數(shù)量變化

酵母菌C14和C21均可從飼喂含混合菌飼料的幼參腸道分離獲得（圖1）。幼參腸道酵母菌數(shù)量7～28 d 時(shí)增加，28 d 時(shí)腸道C14 和C21 分別達(dá)3.1×105和2.5×105cfu·g-1。僅飼喂基礎(chǔ)飼料后（28 d后），腸道中2 株酵母菌數(shù)量均下降（圖1）。相比之下，飼喂含混合菌飼料的幼參腸道中C14 數(shù)量低于飼喂含C14 飼料，C21 數(shù)量低于飼喂含C21 飼料，其中21、28、29、31 d 時(shí)MH 組幼參腸道酵母菌總數(shù)（C14+C21）也低于H 組幼參腸道C21 數(shù)量，但高于M 組幼參腸道中C14 數(shù)量，不過從M 組幼參腸道只能分離到C14，從H 組幼參腸道只能分離到C21（圖1）。

圖1 幼參腸道中C14和C21的數(shù)量Fig.1 Numbers of C14 and C21 in sea cucumber intestines

2.2 益生酵母菌對幼參生長的影響

養(yǎng)殖14 d 時(shí)，MH 組幼參SGR 顯著高于對照和H 組（P<0.05）（表1）。養(yǎng)殖21 d 時(shí)，M 組幼參SGR 顯著高于對照組，養(yǎng)殖28 d 時(shí)，M 和H組幼參SGR 顯著高于對照組，而飼喂含混合菌飼料21 d 和28 d 幼參SGR 顯著高于M 和H 組（P<0.05）（表1）。

表1 益生酵母菌對幼參特定生長率的影響Table 1 Effects of probiotic yeasts on specific growth rates of juvenile sea cucumbers %·d-1

2.3 益生酵母菌對幼參消化酶活力的影響

圖2 可見，飼養(yǎng)28 d 時(shí)，MH 組幼參胰蛋白酶和脂肪酶活力顯著高于對照組、M 和H 組（P<0.05），改飼基礎(chǔ)飼料后，29～33 d 時(shí)，MH 組與對照組和單一酵母菌組（M 和/或H 組）幼參之間的胰蛋白酶和脂肪酶活力仍有顯著差異（P<0.05）。

圖2 益生酵母菌對幼參腸道胰蛋白酶和脂肪酶活力的影響Fig.2 Effects of probiotic yeasts on intestinal trypsin and lipase activities of juvenile sea cucumbers

2.4 益生酵母菌對幼參免疫參數(shù)的影響

圖3(A)可見，MH 組幼參體腔細(xì)胞吞噬活力7～28 d 時(shí)呈增加趨勢，28～35 d 時(shí)呈逐漸下降趨勢，35～38 d 時(shí)趨于平穩(wěn)。飼養(yǎng)21 d 時(shí)，與對照和H組幼參相比，MH 組幼參體腔細(xì)胞吞噬活力顯著增強(qiáng)（P<0.05）；飼養(yǎng)28 d 時(shí)，MH 組幼參的體腔細(xì)胞吞噬活力比對照、M 和H 組更高（P<0.05），M 和H 組平均值略高于對照組，但無顯著差異。改飼基礎(chǔ)飼料后，29～33 d 時(shí)，MH 組幼參體腔細(xì)胞吞噬活力與對照組和單一酵母菌組（M 和H 組）間仍存在顯著差異（P<0.05）。

圖3(B)可見，MH 組幼參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)7～28 d 時(shí)呈增加趨勢，29～35 d 時(shí)略有下降，38 d 時(shí)下降較明顯。飼養(yǎng)28 d 時(shí)，與對照組幼參相比，M和H 組幼參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)顯著增強(qiáng)（P<0.05），而MH 組幼參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)顯著高于M 和H組（P<0.05）。改飼基礎(chǔ)飼料后，29～31 d 時(shí)MH組與對照組和單一酵母菌組（M 和H 組）幼參之間體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)仍存在顯著差異（P<0.05）。

圖3 益生酵母菌對幼參體腔細(xì)胞吞噬活力和呼吸爆發(fā)的影響Fig.3 Effects of probiotic yeasts on phagocytic activity and respiratory burst in coelomocytes of juvenile sea cucumbers

圖4 可見，MH 組幼參體腔液上清液（CF）LSZ活力7～28 d 時(shí)呈逐漸增加趨勢，29～35 d 時(shí)略有波動(dòng)，38 d 時(shí)下降較明顯。飼養(yǎng)14、21 d 時(shí)，MH 組幼參CF 的LSZ 活力顯著高于對照、M 和H 組（P<0.05）；與飼喂基礎(chǔ)飼料和含C21 飼料幼參相比，飼喂含混合菌飼料28 d 幼參CF 的LSZ 活力顯著增加（P<0.05）。MH 組幼參體腔細(xì)胞裂解液上清液（CLS）LSZ 活力7～28 d 時(shí)呈逐漸上升趨勢，28～33 d 時(shí)逐漸下降，33～38 d 時(shí)略有波動(dòng)。飼養(yǎng)28 d時(shí)，MH 組幼參CLS 的LSZ 活力顯著高于對照、M和H 組（P<0.05）。僅飼基礎(chǔ)飼料后，MH 組幼參CF（29～35 d）和CLS（29～31 d）的LSZ 活力仍顯著高于對照組和單一酵母菌組（M 和H 組）（P<0.05）。

圖4 益生酵母菌對幼參體腔液上清液和體腔細(xì)胞裂解液上清液溶菌酶活力的影響Fig.4 Effects of probiotic yeasts on lysozyme activity in coelomic fluid supernatant and coelomocyte lysate supernatant of juvenile sea cucumbers

圖5可見，MH組幼參體腔液上清液（CF）的T-NOS活力7～28 d時(shí)呈逐漸增加趨勢，29～33 d時(shí)基本平穩(wěn)，35～38 d時(shí)下降較明顯。圖5(A)可見，28 d時(shí)，與對照和H組幼參相比，MH組幼參CF的T-NOS活力更高 (P<0.05)。MH組幼參體腔細(xì)胞裂解液上清液（CLS）T-NOS活力7～28 d時(shí)呈逐漸上升趨勢，29～35 d時(shí)緩慢下降，35～38 d時(shí)略有波動(dòng)。圖5(B)可見，飼養(yǎng)21 d時(shí)，MH組幼參CLS的T-NOS活力顯著高于對照、M和H組 (P<0.05)；與飼喂基礎(chǔ)飼料和含C14飼料相比，飼喂含混合菌飼料28 d幼參CLS的T-NOS活力顯著提高 (P<0.05)。僅飼基礎(chǔ)飼料后，MH組幼參CF (29～31 d) 和CLS（29～33 d）的T-NOS活力仍顯著高于對照組和單一酵母菌組（M和H組）(P<0.05)。

圖5 益生酵母菌對幼參體腔液上清液和體腔細(xì)胞裂解液上清液總一氧化氮合酶活力的影響Fig.5 Effects of probiotic yeasts on total nitric oxide synthase activity in coelomic fluid supernatant and coelomocyte lysate supernatant of juvenile sea cucumbers

皮爾遜相關(guān)分析（表2）表明，胰蛋白酶和脂肪酶活力與C14和C21細(xì)胞數(shù)量間均呈正相關(guān)性，所有免疫參數(shù)與C14細(xì)胞數(shù)量間，以及除體腔液上清液（CF）的T-NOS活力外的所測免疫參數(shù)與C21細(xì)胞數(shù)量間顯示正相關(guān)性。

表2 各參數(shù)與C14和C21細(xì)胞數(shù)量常用對數(shù)間的皮爾遜相關(guān)性Table 2 Pearson correlation coefficients between each parameter and log10-transformed numbers of C14 or C21 cells

3 討論

3.1 酵母菌在幼參腸道中的數(shù)量變化

本實(shí)驗(yàn)中，從飼喂含混合菌飼料幼參的腸道可分離出C14和C21。飼喂含混合菌飼料28 d后，腸道中C14和C21細(xì)胞數(shù)量達(dá)到約105cfu·g-1。然而，當(dāng)幼參改飼基礎(chǔ)飼料后其腸道中2株酵母菌數(shù)量10 d內(nèi)持續(xù)下降。這一結(jié)果與Macey等[21]飼喂南非鮑（Haliotis midae）含混合益生菌飼料的結(jié)果類似。研究結(jié)果支持Sharifuzzaman等的通過飼料引入的益生菌在宿主腸道中維持一種短暫狀態(tài)的觀點(diǎn)[22]。另外，本研究中，飼喂含混合菌飼料幼參腸道中C14數(shù)量低于飼喂含C14飼料，C21數(shù)量低于飼喂含C21飼料的幼參，其原因可能是2株酵母菌在腸道微環(huán)境中存在空間或營養(yǎng)上的競爭，這有待進(jìn)一步研究。

3.2 益生酵母菌對幼參生長及消化酶活力的影響

益生菌促進(jìn)水生動(dòng)物生長和促進(jìn)腸道消化是重要評判指標(biāo)。本研究表明，飼料中添加單一益生酵母菌C14和C21可顯著提高幼參的SGR，與前人研究結(jié)果[10-11]一致，且飼喂含混合酵母菌（C14+C21）飼料21、28 d幼參SGR顯著高于飼喂含單一酵母菌（C14和C21）飼料，促進(jìn)生長的一個(gè)原因可能是酵母菌富含蛋白質(zhì)、糖、核酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[16,23-24]。Macey和Coyne[25]報(bào)道，飼喂混合益生菌南非鮑腸道蛋白酶活力明顯提高，對蛋白質(zhì)的消化和吸收顯著增加，生長速度顯著提高?；旌弦嫔龠M(jìn)生長的另一個(gè)原因可能是混合益生菌可提高幼參消化酶活力，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。本研究中，飼喂含混合酵母菌（C14+C21）飼料28 d幼參腸道胰蛋白酶和脂肪酶活力顯著高于飼喂含單一酵母菌（C14和C21）飼料，與Ma等[16]的飼喂幼參含混合酵母菌飼料的結(jié)果類似。本研究顯示，幼參改飼基礎(chǔ)飼料后3 d內(nèi)MH組幼參腸道胰蛋白酶和脂肪酶活力仍顯著高于單一酵母菌組，且2種酶活力與腸道中C14和C21細(xì)胞數(shù)量均呈正相關(guān)性，但7 d時(shí)MH組和單一酵母菌組幼參的2種消化酶活力已無顯著差異，可能是2株酵母菌需要在腸道中維持一定的數(shù)量方可起到提高幼參消化酶活力的作用，或是前期飼喂酵母菌后消化作用的持續(xù)。此外，本研究中幼參生長只測量到飼喂含菌飼料結(jié)束，如能統(tǒng)計(jì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段幼參的生長情況，應(yīng)更能全面反映混合益生菌優(yōu)勢。不過，一般生長需要較長一段時(shí)間才能體現(xiàn)出來（如開始飼喂7 d各組生長無差異，14 d MH組才和其他組有差異），由于測生長用的是30頭幼參，停飼10 d時(shí)的幼參數(shù)量已不足以測定生長，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮用更多的幼參。

3.3 益生酵母菌對幼參免疫反應(yīng)的影響

刺參缺乏特異性免疫器官，主要依賴非特異性免疫防御外來異物，包括體腔液中體腔細(xì)胞的細(xì)胞免疫和免疫因子的體液免疫。飼料中添加單一海洋酵母菌會(huì)影響刺參的先天細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)水平，如影響吞噬活力、LSZ和T-NOS活力[13,26-27]以及呼吸爆發(fā)[14]。本研究表明，飼料中添加2株酵母菌飼喂28 d可顯著提高幼參的吞噬活力、呼吸爆發(fā)、LSZ和T-NOS活力，且顯著高于單一酵母菌（C14和/或C21）組。這些結(jié)果與Ma等[16]飼喂含2株酵母菌 [紅酵母H26 (Rhodotorulasp.) +梅奇酵母C14]飼料4周后幼參先天免疫參數(shù)變化的結(jié)果相似。本研究選擇連續(xù)飼喂含2株酵母菌飼料28 d，是因?yàn)殡S著連續(xù)飼喂時(shí)間的推移，28 d時(shí)飼喂含2株酵母菌飼料幼參的免疫參數(shù)與飼喂單一酵母菌飼料的幼參均呈現(xiàn)出顯著差異。飼喂28 d后，將飼喂含酵母菌飼料幼參（單一酵母菌組和2株酵母菌混合組）改飼基礎(chǔ)飼料，發(fā)現(xiàn)29～31 d（僅飼基礎(chǔ)飼料3 d）MH組幼參體腔細(xì)胞的吞噬活力和呼吸爆發(fā)以及CF和CLS的LSZ和T-NOS活力仍顯著高于單一酵母菌組。來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的β-葡聚糖可增強(qiáng)幼參體腔細(xì)胞的吞噬活力、呼吸爆發(fā)，以及CLS的LSZ、NOS活力[28-29]。本研究中，酵母菌C14和C21可能是通過其細(xì)胞壁成分（葡聚糖）激活幼參非特異性免疫反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)注意的是，MH組幼參腸道中酵母菌總數(shù)（C14+C21）低于H組幼參腸道中的酵母菌C21的數(shù)量，皮爾遜相關(guān)分析也表明，除C21細(xì)胞數(shù)量與CF的T-NOS活力無相關(guān)性以外，腸道中C14和C21細(xì)胞數(shù)量與所測免疫參數(shù)均呈正相關(guān)性，表明幼參免疫水平的提高可能是2株酵母菌在腸道微環(huán)境中共同作用的結(jié)果。從刺參養(yǎng)殖的角度來看，使用2株酵母菌的混合物可能比使用單一酵母菌更有效，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，對照組幼參在實(shí)驗(yàn)期間的特定生長率、消化酶活力和免疫反應(yīng)參數(shù)也有一些變化，這可能與刺參自身的代謝和生長及環(huán)境因素（如溫度）有關(guān)。

綜上，飼喂C14和C21混合酵母菌28 d對幼參的生長、消化酶活力和先天免疫反應(yīng)的影響均大于單一酵母菌組，并且僅飼基礎(chǔ)飼料后3 d內(nèi)2株酵母菌仍顯著影響其消化酶活力和免疫反應(yīng)。