王文配，韓泠姝,2，張向磊，劉 鵬，楊新宇，王 犖，張偉杰，常亞青，丁 君

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

中間球海膽（Strongylocentrotus intermediu）生長(zhǎng)快、品質(zhì)優(yōu)，但對(duì)溫度變化敏感，2017 年山東、遼寧等地增養(yǎng)殖中間球海膽曾因夏季高溫導(dǎo)致大量死亡[1-3]。海洋生物在急性高溫脅迫下會(huì)調(diào)整生理調(diào)節(jié)機(jī)制，線(xiàn)粒體代謝機(jī)制的調(diào)整對(duì)生物補(bǔ)償溫度變化所產(chǎn)生的影響至關(guān)重要[4-5]。ATP 酶是一類(lèi)分布廣泛的膜結(jié)合蛋白酶，參與生物體能量代謝等生理生化過(guò)程。鯉（Cyprinus carpio）和團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）在受到高溫脅迫時(shí)其肝臟細(xì)胞線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)受損[6-7]；凡納濱對(duì)蝦（Litope‐naeus vannamei）和銀鯧（Pampus argenteus）在受到高溫脅迫時(shí)，其ATP 酶活性顯著降低[8-9]。但未見(jiàn)對(duì)中間球海膽線(xiàn)粒體的相關(guān)報(bào)道。

此外，高溫也會(huì)激活生物體液免疫，改變抗氧化酶活性。抗氧化系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）和過(guò)氧化物酶（POD）等起主要作用，SOD 將生物體產(chǎn)生的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT 和GSH-PX 可以將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友酰郧宄踝杂苫捅Ｗo(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[10]。POD 廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中，在底棲海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中如貽貝（Mytilus edulis）和蛤類(lèi)，POD是參與免疫調(diào)節(jié)的主要免疫酶類(lèi)[11]。在牙鲆（Paralichthys olivaceus）[12]及長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）[13]的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫使其體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶的活性顯著升高，而羅氏南極魚(yú)（Notothenia rossii）[14]在高溫狀態(tài)下其腎臟中CAT 酶活性顯著降低；中間球海膽1 ℃/d 從15 ℃升至26 ℃的過(guò)程中，SOD及CAT活性呈先升高后降低趨勢(shì)，該變化可以保護(hù)海膽免受氧化損傷[15]。

本研究以中間球海膽為研究對(duì)象，開(kāi)展急性高溫脅迫下中間球海膽線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能以及抗氧化酶活性變化特征研究，有助于從生理水平上闡明中間球海膽如何響應(yīng)高溫脅迫，為海膽響應(yīng)高溫脅迫及高溫育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取45 只飼養(yǎng)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的1.5 齡健康中間球海膽，體質(zhì)量為（35.30±1.93）g，殼徑為（47.01±5.35）mm，殼高為（28.99±2.80）mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)15、20和25 ℃3個(gè)溫度梯度，以15 ℃為對(duì)照組。每個(gè)梯度3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始將45 只中間球海膽放置于15 ℃控溫水槽內(nèi)暫養(yǎng)7 d，其中15 只暫養(yǎng)7 d 后立即取樣。再將剩余30 只實(shí)驗(yàn)用中間球海膽隨機(jī)分配到2 個(gè)控溫水槽中，其中15 只以1 ℃/h 速度逐漸升溫至20 ℃后，維持24 h 后立即取樣；另外15 只以1 ℃/h 的速度逐漸升溫至25 ℃后，維持24 h后立即取樣。

1.3 樣品采集

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3 只，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組9 只，置于冰盒上活體解剖，每只抽取約5 mL 體腔液裝入10 mL離心管內(nèi)，離心（轉(zhuǎn)速9 000 r/min）10 min 后取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管內(nèi)。抽取體腔液后立即剪取腸組織液氮速凍，同離心后的體腔液和沉淀的體腔細(xì)胞放置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

腸組織檢測(cè)指標(biāo)是ATP 和Ca2+濃度、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶，體腔液檢測(cè)的指標(biāo)是SOD、CAT、GSH-Px、POD。線(xiàn)粒體提取、ATP 濃度測(cè)定、Ca2+濃度測(cè)定的試劑盒均購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，其具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)；ATP 酶活測(cè)定、抗氧化酶（GSH-Px、CAT、POD、SOD）活性測(cè)定的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。超薄切片制備借鑒劉曉輝的實(shí)驗(yàn)方法[6]，最后使用透射電鏡（JEM-2000EX）觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別對(duì)各組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析和Duncan’s多重比較，顯著性水平α=0.05。柱狀圖使用GraphPad Prism v8.0.2.263制作。

2 結(jié)果

2.1 急性高溫脅迫下中間球海膽體腔細(xì)胞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)變化

對(duì)照組（15 ℃）體腔細(xì)胞邊界清楚（圖1(a)）。線(xiàn)粒體呈圓形或橢圓形，且在細(xì)胞邊緣排列，線(xiàn)粒體膜完整，嵴清晰可見(jiàn)且靠近線(xiàn)粒體兩端排列（圖1(b)）。

圖1 15 ℃下的中間球海膽體腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of coelomocytes of the Strongylocentrotus intermedius at 15°C

20 ℃組體腔細(xì)胞邊界清楚（圖2(c)），線(xiàn)粒體呈圓形或橢圓形，在細(xì)胞核周?chē)帕校c對(duì)照組相比線(xiàn)粒體數(shù)目顯著增多。極大部分線(xiàn)粒體膜完整且嵴在線(xiàn)粒體中間排列；小部分線(xiàn)粒體膜溶解破損，嵴脫落不清晰，線(xiàn)粒體基質(zhì)與對(duì)照組相比密度增大（圖2(d)）。

圖2 20 ℃下的中間球海膽體腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of coelomocytes of the Strongylocentrotus intermediu at 20°C

25 ℃組體腔細(xì)胞邊界清楚（圖3(e)），線(xiàn)粒體呈圓形或橢圓形。線(xiàn)粒體數(shù)目與20 ℃組相比數(shù)目降低；大部分線(xiàn)粒體膜完整，部分線(xiàn)粒體膜破損，結(jié)構(gòu)破損情況與20 ℃組相似。嵴破損溶解脫落在線(xiàn)粒體基質(zhì)中渾濁不清晰，線(xiàn)粒體基質(zhì)密度比20 ℃組大（圖3(f)）。

圖3 25 ℃下的中間球海膽體腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.3 The structure of coelomocytes of the Strongylocentrotus intermedius at 25°C

2.2 急性高溫脅迫下中間球海膽腸組織線(xiàn)粒體功能變化

圖4顯示，隨溫度升高，ATP濃度變化不顯著（P>0.05）。隨溫度升高至20 ℃，Ca2+濃度顯著下降（P<0.01）；當(dāng)升溫至25 ℃，與20 ℃組相比Ca2+濃度變化不明顯（P>0.05），與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。

圖4 不同溫度下中間球海膽腸組織線(xiàn)粒體ATP、Ca2+濃度Fig.4 Mitochondrial ATP,Ca2+concentration of intermediate Strongylocentrotus intermedius tissue at different temperatures

隨溫度升高，Ca2+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性降低，Na+-K+-ATP 酶活性升高。20 ℃組Ca2+-ATP酶活性與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），20 ℃組Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；25 ℃組Ca2+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性與對(duì)照組和20 ℃組相比差異極顯著（P<0.01）。25 ℃組Na+-K+-ATP 酶活性與20 ℃組相比差異不顯著（P>0.05），與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）（圖5）。

圖5 不同溫度下中間球海膽腸組織線(xiàn)粒體Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP酶活性Fig.5 The mitochondrial Ca2+-ATP,Ca2+-Mg2+-ATP and Na+-K+-ATP enzyme activity of Strongylocentrotus intermedius tissue at different temperatures

2.3 急性高溫脅迫下中間球海膽體腔液抗氧化酶活性變化

圖6顯示，隨溫度升高，SOD活性顯著升高（P<0.05），25 ℃組較20 ℃組呈下降趨勢(shì)，變化不明顯（P>0.05）；CAT活性下降明顯（P<0.05），20 ℃組和25 ℃組之間CAT 活性變化不明顯（P>0.05）；GSHPx活性顯著下降（P<0.01），但25 ℃組和20 ℃組之間酶活性變化不明顯（P>0.05）；POD活性顯著升高（P<0.05），20 ℃組和25 ℃組相比差異顯著（P<0.05）。

圖6 不同溫度下中間球海膽體腔液抗氧化酶活性變化Fig.6 Changes in the activity of antioxidant enzymes in Strongylocentrotus intermedius cavity fluid at different temperatures

3 討論

3.1 急性高溫脅迫下中間球海膽體腔細(xì)胞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)變化

高溫對(duì)中間球海膽體腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。本研究結(jié)果顯示，隨溫度升高，體腔細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體數(shù)量、線(xiàn)粒體膜及嵴變化趨勢(shì)明顯。盛連喜等[16]對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行脅迫，發(fā)現(xiàn)其肝細(xì)胞線(xiàn)粒體腔室內(nèi)有聚集狀態(tài)的非膠質(zhì)物質(zhì)出現(xiàn)。劉曉暉等[6]對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行急性脅迫，發(fā)現(xiàn)鯉魚(yú)肝細(xì)胞中線(xiàn)粒體數(shù)量先增多后減少，第一次熱脅迫時(shí)部分嵴斷裂脫落在線(xiàn)粒體基質(zhì)中；隨溫度繼續(xù)升高，線(xiàn)粒體受損嚴(yán)重，膜結(jié)構(gòu)破壞，嵴脫落等。本實(shí)驗(yàn)與其研究結(jié)果一致的是，當(dāng)升溫至20 ℃時(shí)，體腔細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)目顯著增多，推測(cè)這與溫度突然升高、中間球海膽運(yùn)動(dòng)幅度加大、線(xiàn)粒體需提供更多能量有關(guān)[17]。當(dāng)溫度升高至25 ℃，線(xiàn)粒體數(shù)量減少，這可能是由于高溫?fù)p害了線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)和酶的附著位點(diǎn)。本研究結(jié)果與鯉魚(yú)急性高溫脅迫后線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)不一致的是，隨溫度升高，鯉魚(yú)肝細(xì)胞逐漸出現(xiàn)均質(zhì)化，線(xiàn)粒體出現(xiàn)空泡化，而中間球海膽的體腔細(xì)胞和線(xiàn)粒體逐漸出現(xiàn)渾濁；而在熱脅迫小鼠早期囊胚細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其線(xiàn)粒體數(shù)目減少，線(xiàn)粒體發(fā)生腫脹、空泡化，線(xiàn)粒體基質(zhì)變淺呈透明形態(tài)、嵴變短變少甚至消失，有的線(xiàn)粒體嵴排列紊亂不清晰[18]。這是脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物在高溫脅迫下其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn)。

3.2 急性高溫脅迫下中間球海膽腸組織線(xiàn)粒體特征酶分析

ATP 是重要能量分子，在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中起著重要作用[19]。錢(qián)令嘉等[20]對(duì)小鼠的熱脅迫實(shí)驗(yàn)及朱孟凱等[21]對(duì)凡納濱對(duì)蝦的高溫脅迫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體中ATP 濃度顯著增高。而本研究結(jié)果顯示，中間球海膽腸組織線(xiàn)粒體中ATP 濃度無(wú)顯著變化，推測(cè)在高溫下中間球海膽消耗更多能量以保持機(jī)體內(nèi)正常平衡[22]。

Ca2+是調(diào)節(jié)細(xì)胞器的重要因子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化，這是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的致命一擊[23]。隨溫度升高，Ca2+-ATP酶活性呈下降趨勢(shì)，推測(cè)是由于高溫使線(xiàn)粒體氧化代謝能力下降，膜脂質(zhì)過(guò)氧化所導(dǎo)致的膜酶蛋白構(gòu)象的改變，這降低了細(xì)胞內(nèi)部Ca2+的線(xiàn)粒體的重?cái)z取能力，導(dǎo)致細(xì)胞中鈣超載。線(xiàn)粒體Ca2+濃度降低是由于線(xiàn)粒體膜上的Ca2+-ATP酶可分解ATP產(chǎn)能，轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+儲(chǔ)存于線(xiàn)粒體內(nèi)，Ca2+-ATP 酶活性降低，所以Ca2+濃度降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與熊大林等[8]對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行熱脅迫，發(fā)現(xiàn)Ca2+-ATP酶活性呈下降趨勢(shì)的結(jié)果一致。

Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶在維持細(xì)胞正常生理功能方面起重要作用。湯平濤等[24]對(duì)雄性大鼠進(jìn)行熱脅迫120 min后，發(fā)現(xiàn)大鼠肝線(xiàn)粒體中的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性下降，本研究結(jié)果與其研究結(jié)果一致，可能由于線(xiàn)粒體膜通透性升高，不能將Ca2+通過(guò)逆濃度梯度及時(shí)運(yùn)回，從而出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)[25]。隨溫度升高，線(xiàn)粒體中Na+-K+-ATP酶活性明顯升高，推測(cè)溫度能夠影響其生物膜結(jié)構(gòu)、膜上Na+-K+-ATP酶的構(gòu)象以及酶對(duì)反應(yīng)離子和底物的親和力[26]。

3.3 急性高溫脅迫下中間球海膽體腔液抗氧化酶活性變化特征

本研究結(jié)果表明，中間球海膽隨著溫度升高，其體腔液中的抗氧化酶活性均發(fā)生變化。正常生理狀態(tài)下，水生動(dòng)物的抗氧化系統(tǒng)會(huì)及時(shí)從機(jī)體中去除代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧，而在環(huán)境脅迫下，機(jī)體內(nèi)會(huì)有大量活性氧產(chǎn)生，從而造成機(jī)體損傷[27]。

SOD可將機(jī)體產(chǎn)生的毒性O(shè)2-轉(zhuǎn)化為H2O2，后者繼續(xù)被CAT 代謝為無(wú)毒的H2O[28-29]。丁文君等[15]對(duì)中間球海膽以每天升溫1 ℃進(jìn)行急性脅迫，結(jié)果顯示SOD 活性均呈先升高后降低趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，中間球海膽隨溫度升高，SOD 活性顯著升高，推測(cè)隨溫度升高中間球海膽機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞和組織中自由基迅速增加，所以機(jī)體需更多SOD 來(lái)應(yīng)對(duì)過(guò)多的自由基，從而提高了SOD 活性[30]。當(dāng)溫度升高至25 ℃時(shí)，SOD 活性呈下降趨勢(shì)，但是變化不顯著，推測(cè)是由于機(jī)體中自由基含量增多，超過(guò)了SOD清除能力，導(dǎo)致SOD活性下降。

有研究高溫對(duì)刺參（Apostichopus japonicus）的影響，結(jié)果顯示CAT 活性隨溫度升高而降低[31-32]。謝明媚等[9]對(duì)銀鯧幼魚(yú)急性高溫脅迫，其血清中的GSH-Px 活性呈降低趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，隨溫度升高CAT 及GSH-Px 活性呈下降，表明高溫對(duì)中間球海膽已造成損傷，抗氧化能力減弱，體內(nèi)活性氧堆積超過(guò)了CAT 和GSH-Px 的清除能力，所以體內(nèi)過(guò)多有毒自由基對(duì)CAT和GSH-Px的活性產(chǎn)生了抑制作用[33]。

POD 與生物應(yīng)激有關(guān)，能將過(guò)氧化氫水解，可以對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中間球海膽隨熱脅迫溫度升高，體腔液中POD 活性顯著上升，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與丁文君等[15]、丁小豐等[34]、Wang等[32]研究結(jié)果一致，即隨水溫升高，海膽機(jī)體因高溫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，POD活性升高以保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

4 結(jié)論

隨溫度升高，中間球海膽體腔細(xì)胞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)、腸組織線(xiàn)粒體的ATP 濃度、Ca2+濃度、ATP 酶活性以及抗氧化酶均發(fā)生一定變化。高溫使中間球海膽的線(xiàn)粒體發(fā)生損傷，其中線(xiàn)粒體膜破損，線(xiàn)粒體基質(zhì)密度顯著增大，嵴溶解；Ca2+濃度、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性顯著下降，Na+-K+-ATP 酶活性顯著升高，與高溫脅迫陸生脊椎動(dòng)物相比不同的是，熱脅迫下中間球海膽ATP 濃度沒(méi)有顯著性變化。此外，中間球海膽熱脅迫后體腔液SOD 酶、POD 酶活性顯著升高，CAT、GSH-Px 酶活性顯著下降。綜上所述，在生理水平上，中間球海膽通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能及抗氧化酶活性以響應(yīng)熱脅迫。

本實(shí)驗(yàn)有助于從生理水平上闡明中間球海膽如何響應(yīng)高溫脅迫，為以后篩選耐高溫中間球海膽提供了一定參考，也為后續(xù)研究海膽響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制提供依據(jù)。