楊洋梁萍陳昌益

廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 婦科,南寧530021

宮頸癌是女性最常見惡性腫瘤之一,近年來發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。盡管宮頸癌是可預(yù)防的惡性腫瘤之一,但新發(fā)病例數(shù)不斷增加,尤其在我國缺乏有效篩查和規(guī)范治療的偏遠(yuǎn)地區(qū),宮頸癌仍是危害女性身心健康的重要公共衛(wèi)生問題[1]。目前臨床主要通過手術(shù)和放化療等手段治療宮頸癌,患者總生存率得到有效提高,但對(duì)于晚期宮頸癌患者,尤其是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者,其5年生存率仍較低。宮頸癌細(xì)胞無限增殖及向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是制約臨床預(yù)后的關(guān)鍵因素。進(jìn)一步闡明宮頸癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制,尋求理想治療方式,已成為臨床亟待解決的問題。研究[2-3]顯示,微小核糖核酸(microRNA,miRNA),如miR-34b、miR-586、miR-622等,與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。miR-181a定位于人9號(hào)染色體,屬于miR-181家族成員,在細(xì)胞生長及分化過程中發(fā)揮重要作用,廣泛參與惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等多種腫瘤進(jìn)展過程[4-5]。研究[6]顯示,miR-181a在卵巢癌患者中表達(dá)是對(duì)照人群的20.62倍,參與卵巢癌進(jìn)展,并與腫瘤分期等臨床特征相關(guān),可作為潛在治療靶點(diǎn)。研究[7]表明,miR-181a可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和遷移。miR-181a在婦科腫瘤中發(fā)揮重要作用,而其在宮頸癌中的作用及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究觀察miR-181 對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,并探討相關(guān)作用機(jī)制,旨在為臨床治療宮頸癌提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人宮頸癌SiHa細(xì)胞,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑和儀器

LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司),含有miR-181a擬似物(mimic)及擬似物陰性對(duì)照(mimic-NC)、抑制劑(inhibitor)及抑制劑陰性對(duì)照(inhibitor-NC)的pc DNA3.1重組質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);MTT 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),Transwell小室(美國Corning公司),熒光素酶檢測(cè)試劑盒(美國Promega公司),兔抗人第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p-Akt一抗及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Abcam 公司)。Gallios流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司),7500熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司),DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

37℃水浴復(fù)蘇Si Ha細(xì)胞,接種于DMEM 培養(yǎng)基中(其中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、1%的青霉素和鏈霉素),置于CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中(其中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2),37 ℃條件下培養(yǎng),取對(duì)數(shù)期生長良好細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

轉(zhuǎn)染前24 h,重懸細(xì)胞密度為1×106個(gè)/m L,接種于6孔板,待細(xì)胞生長至80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、擬似物組和擬似物對(duì)照組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組不轉(zhuǎn)染,其他4 組進(jìn)行轉(zhuǎn)染:分別取5μL LipofectamineTM2000和含有miR-181a mimic、miR-181a mimic-NC、miR-181a inhibitor和miR-181a inhibitor-NC 序列的質(zhì)粒,加入250μL Opti-MEM?,均勻混合,孵育5 min;將稀釋的LipofectamineTM2000和含有各序列的質(zhì)粒在室溫下混合,孵育20 min,制備質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物;將質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物加入到6孔板中,輕搖混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力

將各組細(xì)胞使用胰酶消化,PBS 洗滌,重懸細(xì)胞密度為1×105個(gè)/m L,接種于96孔板;置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱,37 ℃培養(yǎng)24 h、48 h和72 h;除去上清,加入新鮮培養(yǎng)基,同時(shí)每孔加入10 μL MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜,低速搖晃10 min,充分溶解結(jié)晶后,使用酶標(biāo)儀讀取490 nm 處吸光度A。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

胰酶消化各組細(xì)胞,3 000 r/min室溫離心5 min,1×緩沖結(jié)合液重懸細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL;加入1.25μL Annexin V-FITC于室溫條件下避光孵育15 min,離心棄上清,PBS洗滌,使用1×緩沖結(jié)合液重懸細(xì)胞;加入10μL PI染色液,室溫避光染色10 min,離心棄上清,PBS洗滌;加入400μL的1×緩沖結(jié)合液,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=[(早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞)/細(xì)胞總數(shù)]×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力

按1∶50的比例稀釋Matrigel膠,每個(gè)小室添加200μL稀釋后的Matrigel膠;將Transwell小室放置在24孔板中,置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中,37 ℃過夜。取各組細(xì)胞,PBS清洗,用不含血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/m L;取出小室,上室加入200μL 細(xì)胞懸液,下室加入600μL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)48 h;取出小室,將膜表面的細(xì)胞和膠擦去,放入甲醇中固定20 min后,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫室溫染色30 min,清水沖洗;晾干后顯微鏡下拍照,隨機(jī)取5 個(gè)視野,用Image Pro Plus軟件對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞miR-181a、PTEN mRNA表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞總RNA,嚴(yán)格按照TRizol說明書步驟進(jìn)行操作。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260 nm 和280 nm 處吸光度A,計(jì)算兩者比值,確定RNA 濃度及純度;參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR;根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則,應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物。所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1。反應(yīng)體系:2μL cDNA 模板,10μL SYBR Green Mix(2×),0.5μL PCR Forward Primer,0.5 PCR Reverse Primer,dd H2O 補(bǔ)充總體積至20μL。擴(kuò)增條件:95 ℃10 min,95 ℃10 s,55 ℃60 s,72 ℃30s,共40個(gè)循環(huán)。miR-181a以U6為內(nèi)參,PTEN以GAPDH 為內(nèi)參,采用公式2-△△CT計(jì)算miR-181a、PTEN m RNA 表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.9 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-181a與PTEN 的靶向關(guān)系

利用TargetScan 和miRanda軟件預(yù)測(cè)miR-181a的潛在靶基因,將PTEN 的3′UTR 區(qū)域野生型(wt)和突變型(mut)核苷酸序列分別構(gòu)建至Firefly-Luciferase報(bào)告基因。取對(duì)數(shù)期Si Ha細(xì)胞,按1×106個(gè)/m L接種于6孔板;待細(xì)胞鋪滿約50%時(shí),將wt PTEN 和mut PTEN 質(zhì)粒載體分別與miR-181a mimic/miR-181a mimic-NC及miR-181a inhibitor/miR-181a inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞;繼續(xù)培養(yǎng)48 h,檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性,相對(duì)熒光素酶活性以二者比值表示。

1.10 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)

PBS清洗各組細(xì)胞,1 500 r/min離心3 min,棄上清;加入細(xì)胞裂解液,12 000 r/min,抽提總蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白濃度,配制分離膠和濃縮膠。根據(jù)蛋白樣品濃度,每孔加入30μg 樣品,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳;濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,放入5%脫脂牛奶中,室溫封閉2 h;TBST 溶液洗膜5 min×3次,加入一抗4 ℃,過夜;TBST 溶液洗膜5 min×3次,加入相應(yīng)二抗,室溫孵育2 h。TBST 溶液洗膜5 min×3次,ECL顯色,顯影、拍攝;分析條帶,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GDPAH 條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料表示為,多樣本比較以單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較以LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較

與空白對(duì)照組、擬似物對(duì)照組比較,擬似物組細(xì)胞24 h、48 h、72 h的A值增加(P<0.05);與空白對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組比較,抑制劑組細(xì)胞24 h、48 h、72 h的A值減小(P<0.05);抑制劑組細(xì)胞24 h、48 h、72 h的A值小于擬似物組(P<0.05)。空白對(duì)照組與擬似物對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組的細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)A值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞增殖能力比較

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

與空白對(duì)照組、擬似物對(duì)照組比較,擬似物組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與空白對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組比較,抑制劑組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);抑制劑組細(xì)胞凋亡率高于擬似物組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與擬似物對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

2.3 各組細(xì)胞侵襲數(shù)比較

與空白對(duì)照組、擬似物對(duì)照組比較,擬似物組侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05);與空白對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組比較,抑制劑組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),抑制劑組侵襲細(xì)胞數(shù)少于擬似物組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與擬似物對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組侵襲細(xì)胞數(shù)

表3 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.4 各組細(xì)胞miR-181a、PTEN mRNA表達(dá)比較

與空白對(duì)照組、擬似物對(duì)照組比較,擬似物組miR-181a表達(dá)升高,PTEN mRNA 表達(dá)降低(P<0.05);與空白對(duì)照組和抑制劑對(duì)照組比較,抑制劑組miR-181a表達(dá)降低,PTEN m RNA 表達(dá)升高(P<0.05);抑制劑組miR-181a表達(dá)低于擬似物組,PTEN m RNA 表達(dá)高于擬似物組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與擬似物對(duì)照組和抑制劑對(duì)照組的miR-181a、PTEN m RNA 表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞miR-181a、PTEN mRNA表達(dá)水平

2.5 雙熒光素酶結(jié)果

miR-181a與PTEN 存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn),見圖5A。轉(zhuǎn)染miR-181a mimic可明顯抑制wt PTEN相對(duì)熒光素酶活性,轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor可明顯升高wt CPTEN 相對(duì)熒光素酶活性(P<0.05),見圖5B;轉(zhuǎn)染miR-181a mimic和miR-181 a inhibitor對(duì)mut PTEN 相對(duì)熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05),見圖5C。

圖5 miR-181a靶向PTEN

2.6 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與空白對(duì)照組、擬似物對(duì)照組比較,擬似物組PTEN 蛋白表達(dá)降低,PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與空白對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組比較,抑制劑組PTEN 蛋白表達(dá)升高,PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)降低(P<0.05);抑制劑組PTEN 蛋白表達(dá)高于擬似物組,PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)低于擬似物組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與擬似物對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組的PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖6。

表4 各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較()

表4 各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較()

a 與空白對(duì)照組比較,P<0.05;b 與相應(yīng)對(duì)照組比較,P<0.05;c 與擬似物組比較,P<0.05。

圖6 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

宮頸癌嚴(yán)重威脅女性生命健康,由子宮頸鱗狀上皮經(jīng)過低級(jí)別病變、高級(jí)別病變、早期浸潤癌等階段,最終進(jìn)展為浸潤癌。宮頸癌的發(fā)生與遺傳、多產(chǎn)、性活躍等多種因素有關(guān),其中人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是引起宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素,尤其是高危型HPV 持續(xù)感染,90%以上患者由高危型HPV 持續(xù)感染引起[8]。miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,某些異常表達(dá)的miRNA 可作為宮頸癌診斷、預(yù)后潛在標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),為臨床靶向治療宮頸癌提供新思路[9-10]。

miRNA 參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)行為過程,是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子。miR-181a失調(diào)與人類多種腫瘤密切相關(guān),在不同種類腫瘤中表達(dá)水平不盡相同。研究[11]顯示,miR-181a可增加髓系來源抑制細(xì)胞原位浸潤,促進(jìn)乳腺癌腫瘤生長和免疫逃逸。Luo等[12]對(duì)幾種人類宮頸癌細(xì)胞系中miR-181a的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示:不同細(xì)胞系中miR-181a表達(dá)存在差異,與細(xì)胞增殖及治療敏感性有關(guān)。而在卵巢癌患者中,高表達(dá)miRNA-181a與治療不良反應(yīng)及早期進(jìn)展密切相關(guān)[13]。本研究以宮頸癌Si Ha細(xì)胞為研究對(duì)象,通過轉(zhuǎn)染miR-181a擬似物和抑制劑,觀察miR-181a對(duì)細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-181amimc的細(xì)胞增殖能力升高、凋亡率降低、侵襲細(xì)胞數(shù)增加,而細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后呈現(xiàn)相反效果。提示miR-181a參與調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲過程,上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮促癌作用。

PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期方面發(fā)揮重要作用,與多種腫瘤發(fā)展過程有關(guān)。PTEN 是一種抑癌基因,在正常組織中均有表達(dá),而在膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[16]證實(shí),敲除PTEN 基因的小鼠,可導(dǎo)致前列腺癌。臨床研究[17]顯示,宮頸癌患者中PTEN 明顯缺失,并與腫瘤分期、腫瘤大小、病理學(xué)分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。PI3K 是磷脂激酶家族重要成員,可激活A(yù)kt,促進(jìn)細(xì)胞過度增殖,發(fā)生癌變。多項(xiàng)研究[18]表明,PTEN 和PI3K在惡性腫瘤中呈負(fù)相關(guān),PTEN 可通過脫磷酸作用阻斷PI3K,拮抗Akt,抑制細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是PI3K/Akt通路關(guān)鍵抑制劑。本研究結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后,細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)明顯下降,而轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor 后,PTEN m RNA 表達(dá)明顯升高。提示miR-181a可能參與調(diào)節(jié)PTEN 表達(dá)。進(jìn)一步Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:擬似物組PTEN 蛋白表達(dá)明顯下降,PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高,抑制劑組上述蛋白表達(dá)呈相反結(jié)果。經(jīng)熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí),PTEN 是miR-181a直接靶基因,表明miR-181a可靶向抑制PTEN 表達(dá),調(diào)控PI3K/Akt 通路。Nishimura等[19]證實(shí),高表達(dá)miR-181a在大腸癌中通過抑制PTEN,影響患者預(yù)后,與本研究結(jié)果相似。提示miR-181a可靶向PTEN/PI3K/Akt,影響宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-181a可促進(jìn)宮頸癌Si Ha細(xì)胞增殖和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡,部分原因可能與靶向抑制PTEN 表達(dá)、進(jìn)而調(diào)控PI3K/Akt通路有關(guān)。敲降miR-181a可能是治療宮頸癌的潛在靶標(biāo),但其是否存在其他作用機(jī)制,尚需進(jìn)一步研究明確。