張倩，徐靜，陸培春，夏琳，孫彩霞

神經(jīng)病理性疼痛(NP)是軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)疾病或受損導(dǎo)致的一種疼痛[1]，且通常是持續(xù)存在或反復(fù)發(fā)作的慢性疼痛。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在美國(guó)和歐洲，慢性疼痛發(fā)病率最高可達(dá)40%[2-3]，而我國(guó)至少有3億的慢性疼痛患者，其中慢性NP在普通人群中發(fā)病率為6.9%～10%，住院患者中可達(dá)16%，是造成全球疾病負(fù)擔(dān)的主要因素之一[4-5]。葛根素是從我國(guó)傳統(tǒng)藥、食同源植物——葛根中提取的異黃酮類(lèi)衍生物，具有吸收快速、分布廣泛、所需劑量小、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，因其具有抗炎、抗氧化、控制血糖、抗腫瘤等作用，被廣泛用于心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、Alzheimer’s癥、癌癥等多種疾病的治療[6]。然而，葛根素雖具有廣泛的藥理活性，但其臨床應(yīng)用方式卻十分有限。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)[7]顯示，葛根素目前僅限于靜脈注射和滴眼兩種臨床給藥方式。近年來(lái)有研究[8-10]發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)中樞及周?chē)訬P有緩解作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本次研究通過(guò)建立創(chuàng)傷小、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，能更好模擬臨床NP癥狀的坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(SNI)小鼠模型[11]，并進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)及分子生物學(xué)測(cè)試，比較三種不同給藥途徑下葛根素對(duì)SNI小鼠機(jī)械痛閾及促炎癥因子表達(dá)的影響，旨在探尋NP治療中更合適的葛根素給藥方式。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性6～8周BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體重20～25 g ,由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)[許可證號(hào)：SYXK(蘇)2018-0053], 小鼠適應(yīng)環(huán)境5 d后開(kāi)始建模，保持飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)安靜，室溫(22±2)℃, 空氣相對(duì)濕度30%～40%, 12 h/12 h晝夜節(jié)律, 自由攝食水。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理審查，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 注射用葛根素購(gòu)自瑞陽(yáng)制藥有限公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen，異戊醇、氯仿等試劑及β-Actin 、IL-1β、IL-6、TNF-α引物均購(gòu)自上海生物工程有限公司，PrimescriptTMRT reagent Kit、SybrGreen qPCR mastermix 購(gòu)自TaKaRa公司，NC12775-99 von Frey 痛覺(jué)測(cè)試包購(gòu)自Stoelting 公司，微量分光光度計(jì)購(gòu)自TitertekBerthold，Mycyler PCR儀購(gòu)自BIO-RAD 公司，Quantstudio 5熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 SNI小鼠模型制備[11]1%戊巴比妥按0.5 mg/10 g腹腔注射麻醉小鼠，給藥5～10 min后，可達(dá)麻醉深度，對(duì)左后肢進(jìn)行備皮，以碘伏消毒皮膚，沿左側(cè)坐骨神經(jīng)分叉處切開(kāi)皮膚，分離筋膜和股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)及其三個(gè)分支：腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)；用4-0的慕思線(xiàn)將脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分別結(jié)扎、沿遠(yuǎn)端切斷，并去除其末端2～4 mm的神經(jīng)；保留腓腸神經(jīng)，逐層縫合。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 建模前5 d，每天檢測(cè)小鼠的50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(MWT)，確定小鼠的基礎(chǔ)閾值，剔除痛閾異常小鼠。按隨機(jī)數(shù)字法，將建模組小鼠分為五組，分別是建模無(wú)治療組(SNI組)、建模5 d腹腔注射葛根素組(SNI-PA組)、建模5 d鞘內(nèi)注射葛根素組(SNI-PI組)、建模前5 d予以鞘內(nèi)置管[12]并于建模5 d經(jīng)導(dǎo)管注射葛根素組(SNI-PC組)、建模5 d鞘內(nèi)注射生理鹽水組(SNI-NS組)。對(duì)照組小鼠隨機(jī)分為三組，即正常對(duì)照組(CON組)、正常鼠鞘內(nèi)注射生理鹽水組(CON-NS組)、正常鼠鞘內(nèi)注射葛根素組(CON-PI組)。于SNI模型建立5 d，確認(rèn)痛閾明顯降低后，當(dāng)天即予以藥物處理，后于每天9：00至12：00給藥一次，持續(xù)給藥至建模15 d，每次予鞘內(nèi)注射5 μl葛根素，即葛根素濃度為4 μg/μl；腹腔注射0.5 ml葛根素，即葛根素的治療劑量為100 mg/kg。生理鹽水組與SNI-PI組注射時(shí)間、劑量相同。排除小鼠SNI建模失敗、建模后小鼠出現(xiàn)自噬、傷口感染或左下肢完全癱瘓等影響痛閾測(cè)量、置管后利多卡因?qū)嶒?yàn)陰性(置管失敗)、鞘內(nèi)注射或置管后偏癱甚至死亡等因素，最終保持各組小鼠的數(shù)量均為5只。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo) (1)行為學(xué)觀察：給藥后2 d每天觀察小鼠因建模所致的左足五趾收攏外翻畸形有無(wú)變化。(2)給藥后測(cè)量CON組、SNI組、SNI-NS組、SNI-PC組、SNI-PI組、SNI-PA組小鼠左足機(jī)械痛閾，計(jì)算50%MWT。每次測(cè)定選擇當(dāng)天9：00至12：00，室溫23 ℃，在安靜的環(huán)境下，將小鼠置于底為3 mm×3 mm的金屬絲網(wǎng)的透明有機(jī)玻璃箱中，適應(yīng)15 min，從中等力度的纖毛(0.16 g)開(kāi)始測(cè)試，根據(jù)小鼠是否出現(xiàn)抬足或舔足表現(xiàn)，按照“up and down”方法，分別以上一級(jí)力度或下一級(jí)力度的von-Frey纖毛垂直刺激小鼠左足底皮膚，避開(kāi)足墊，所用纖毛折力分別為0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.6、1.0、1.4、2.0 g。每次刺激間隔至少30 s，最大折力為2.0 g，超過(guò)此值時(shí)記為2.0 g，根據(jù)刺激的纖毛力度及小鼠的縮足反射推算50% MWT，所有測(cè)量均由同一人完成。(3)腰段患側(cè)脊髓背角促炎癥因子檢測(cè)：分別提取CON組、建模7 d SNI組、給藥7 d SNI-NS組、SNI-PC組、SNI-PI組、CON-NS組、CON-PI組小鼠患側(cè)脊髓背角，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)促炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA含量變化。涉及引物序列：IL-1β sense 5′-GAA ATG CCA CCT TTT GAC AGT G-3′、IL-1β anti-sense 5′-CTG GAT GCT CTC ATC AGG CA-3′、IL-6 sense 5′-GAG TCC TTC AGA AGA TAC AGA AAC-3′、IL-6 anti-sense 5′TGG TCT TGG TCC TTA GCC AC-3′、TNF-αsense 5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT-3′、TNF-α anti-sense 5′-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3′、β-actin sense 5′-GCC AAC CGT GAA AAG ATG ACC-3′、β-actin anti-sense 5′-GAG GCA TAC AGG GAC AGC AC-3′。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察結(jié)果 所有SNI建模組小鼠于建模3 d即可見(jiàn)明顯的左足畸形，表現(xiàn)為五趾并攏屈曲、輕度外翻，行走時(shí)以右足為主，左足不敢著地或輕靠在地，間或出現(xiàn)縮足或舔足行為。與CON組小鼠相比，SNI建模組小鼠行為差別明顯。建模組中SNI-PC組、SNI-PI組小鼠建模后左足不敢落地或以右足為主行走且多次舔足現(xiàn)象于給藥后明顯好轉(zhuǎn)，左足可以著地行走，且舔足次數(shù)減少，但五趾并攏內(nèi)收，輕度外翻屈曲現(xiàn)象無(wú)明顯改善。SNI-PA組、SNI-NS組與SNI組相比無(wú)明顯改善。

2.2 50%MWT計(jì)算結(jié)果

2.2.1 CON組及各建模組之間比較 建模前，CON組、SNI組、SNI-PA組、SNI-PI組、SNI-PC組、SNI-NS組基礎(chǔ)50%MWT分別為(1.27±0.10)g、(1.24±0.12)g、(1.26±0.08)g、(1.22±0.07)g、(1.26±0.13)g、(1.24±0.13)g，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建模5 d，SNI-PA組、SNI-PI組、SNI-PC組、SNI-NS組50%MWT分別為(0.08+0.01)g、(0.08+0.01)g、(0.08±0.01)g、(0.08±0.01)g，與SNI組[(0.07+0.01)g]相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，較CON組[(1.26+0.06)g]均明顯下降(P<0.01)，提示SNI建模成功。

2.2.2 CON組、SNI組、SNI-PA組之間比較 給藥3 d，SNI-PA組[(0.05+0.02)g]與CON組[(1.20+0.04)g]相比仍明顯下降(P<0.01)，較SNI組[(0.03+0.01)g]差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。推斷腹腔注射葛根素對(duì)SNI小鼠痛閾改善無(wú)明顯作用，遂未再針對(duì)SNI-PA組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 CON組、SNI組、SNI-PC組、SNI-PI組比較 SNI-PC組、SNI-PI組給藥3 d(建模7 d)痛敏反應(yīng)減弱，50%MWT分別為(0.34±0.11)g、(0.34±0.06)g，與給藥前及同時(shí)間點(diǎn)SNI組小鼠[(0.03±0.01)g]相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；給藥7 d(建模11 d)，兩組50%MWT均上升至峰值，SNI-PC組為(0.71±0.04)g，SNI-PI組(0.69±0.07)g，與給藥前及同時(shí)間點(diǎn)SNI組小鼠[(0.02±0.01)g]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；直至給藥11 d(建模15 d)，兩組50%MWT趨于穩(wěn)定，但均未恢復(fù)到建模前及相應(yīng)同時(shí)間點(diǎn)CON組水平。SNI-PC組與SNI-PI組兩種不同的中樞給藥方式效果相似，各時(shí)間點(diǎn)50%MWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

注：SNI-PC組、SNI-PI組給藥后與給藥前比較#P<0.05，##P<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)SNI組比較××P<0.01圖1 CON組、SNI組、SNI-PC組、SNI-PI組小鼠患足50%MWT變化趨勢(shì)及比較

2.2.4 SNI-PI組、SNI組、SNI-NS組比較 給藥3 d，SNI-PI組50%MWT為(0.34±0.06)g，SNI-NS組為(0.05±0.01)g，SNI-PI組較SNI-NS組明顯上升(P<0.01)；SNI-NS組50%MWT在鞘內(nèi)注射生理鹽水后較注射前進(jìn)一步下降，且與同時(shí)間點(diǎn)SNI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 腰段脊髓背角促炎癥因子表達(dá)變化

2.3.1 SNI-PI組IL1-β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)變化 見(jiàn)表1。根據(jù)圖1中小鼠左足50%MWT變化趨勢(shì)，SNI組建模7 d痛閾下降至最低，并保持在低谷水平；葛根素給藥7 d后，痛閾上升至高峰期，并維持在高峰水平，分別選擇CON組、建模7 d SNI組(SNI 7)、葛根素鞘內(nèi)注射7 d SNI-PI組(SNI-PI 7)檢測(cè)促炎癥因子的表達(dá)情況。IL1-β、IL-6、TNF-α在SNI 7組均較CON組有不同程度上升(均P<0.05)，而SNI-PI 7組又較SNI 7組進(jìn)一步升高(均P<0.05)。

2.3.2 SNI-PC組IL1-β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)變化 見(jiàn)表1。比較CON組、SNI 7組、鞘內(nèi)置管葛根素治療7 d SNI-PC組(SNI-PC 7組)促炎癥因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SNI-PC 7組三種促炎癥因子較SNI 7組均有不同程度的下降(均P<0.05)，但仍高于CON組水平(均P<0.05)。

2.3.3 CON組、CON-NS組、CON-PI組IL1-β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。對(duì)CON組、鞘內(nèi)注射生理鹽水7 d CON-NS組(CON-NS 7組)、鞘內(nèi)注射葛根素7 d CON-PI組(CON-PI 7組)促炎癥因子比較發(fā)現(xiàn)，CON-NS 7組較CON組均明顯升高(均P<0.05)，CON-PI 7組各促炎癥因子較CON組亦明顯升高(均P<0.05)，但較CON-NS 7組明顯降低(均P<0.05)。

表1 腰段脊髓背角促炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s,n=3)組別IL-1βIL-6TNF-αCON組1.01±0.121.01±0.141.02±0.26SNI 7組3.67±0.24▲4.36±0.39▲4.01±0.82▲SNI-PI 7組5.00±0.35#5.86±0.45#7.82±1.19#SNI-PC 7組1.84±0.42#2.23±0.42#2.51±0.39#CON-PI 7組3.04±0.36*3.08±0.42*3.42±1.11*CON-NS 7組6.09±1.115.42±1.246.05±0.85 注:與SNI 7組比較#P<0.05;與CON-NS組比較*P<0.05;與CON組比較▲P<0.05

3 討 論

有文獻(xiàn)[9]表明，葛根素經(jīng)鞘內(nèi)置管給藥可能通過(guò)抑制脊髓細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)及伴隨的小膠質(zhì)細(xì)胞激活緩解腰椎間盤(pán)突出引起的神經(jīng)根性疼痛；亦有發(fā)現(xiàn)腹腔注射葛根素可以通過(guò)抑制背根神經(jīng)節(jié)中瞬時(shí)感受器電位香草素亞型1(TRPV1)和瞬時(shí)感受器電位錨蛋白亞型1(TRPA1)的上調(diào)緩解坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏[10]，還可通過(guò)降低背根神經(jīng)節(jié)或交感神經(jīng)節(jié)中嘌呤能離子通道型P2X3受體表達(dá)來(lái)抑制傷害性感受信號(hào)的傳遞[13-14]，并在脊髓急性損傷模型中對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用[15]。這些研究結(jié)果提示葛根素通過(guò)腹腔注射、鞘內(nèi)注射及鞘內(nèi)置管等外周或中樞途徑給藥，均對(duì)NP有緩解作用，但目前尚無(wú)評(píng)價(jià)這三種給藥方式對(duì)NP小鼠的影響。

本次實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)典的小鼠SNI模型，通過(guò)對(duì)各組小鼠機(jī)械痛閾的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射葛根素并未對(duì)建模后小鼠機(jī)械痛閾產(chǎn)生明顯影響。這與既往研究發(fā)現(xiàn)不符，結(jié)合其他研究中單次腹腔注射100 mg/kg葛根素于SNI小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)僅維持在給藥后10～20 min[16]；在連續(xù)腹腔注射葛根素5 d停止注射后次日，炎性疼痛模型小鼠痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)超敏再次出現(xiàn)[17]，提示葛根素消除半衰期短，需要頻繁或大劑量注射[7]。本實(shí)驗(yàn)于注藥次日再次給藥前測(cè)量機(jī)械痛閾觀察葛根素的慢性效應(yīng)，效果并不理想，若想提高外周用藥的慢性效能，需針對(duì)腹腔注射劑量及給藥頻率行進(jìn)一步細(xì)化研究。另外，要考慮葛根素外周給藥途徑用于NP治療的主要限制因素是其血-腦屏障通透性較低。研究[17]表明，腹腔給藥90 min后體內(nèi)葛根素濃度在肝、腎中較高，大腦中較低，提示外周給藥后葛根素作用更多的是在外周而不是中樞；且葛根素雖可通過(guò)血-腦屏障，但腦靶向指數(shù)僅有5.0%，而聯(lián)合應(yīng)用冰片或α-細(xì)辛腦可以使葛根素更容易穿透血-腦屏障，明顯改善其腦內(nèi)的吸收速率和分布水平[7,18-19]。這也為進(jìn)一步研發(fā)腦生物利用度更高的應(yīng)用劑型，從而推進(jìn)葛根素在外周途徑鎮(zhèn)痛的臨床應(yīng)用提供了新的線(xiàn)索。

鞘內(nèi)注射與鞘內(nèi)置管給予葛根素均可明顯改善小鼠機(jī)械痛閾，表明葛根素通過(guò)中樞途徑給藥對(duì)NP有緩解作用。建模7 d，SNI小鼠患足痛閾下降至最低，出現(xiàn)明顯痛覺(jué)超敏及痛覺(jué)過(guò)敏，同時(shí)腰段脊髓促炎癥因子IL1-β、IL-6、TNF-α表達(dá)較正常小鼠明顯升高，與既往研究[20]相符。但反復(fù)鞘內(nèi)注射葛根素后，促炎癥因子表達(dá)進(jìn)一步升高，提示反復(fù)鞘內(nèi)注射給藥有致無(wú)菌性炎癥風(fēng)險(xiǎn)。該觀點(diǎn)在正常小鼠鞘內(nèi)分別注射葛根素與生理鹽水進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也再次得到證實(shí)。而與反復(fù)鞘內(nèi)注射相比，鞘內(nèi)置管給藥能夠在改善SNI所致的機(jī)械痛閾下降、緩解痛覺(jué)敏化癥狀的同時(shí)，明顯減少腰段脊髓促炎癥因子的表達(dá)。近年來(lái)，諸多研究已證實(shí)外周及CNS的炎癥和免疫機(jī)制在NP發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。神經(jīng)損傷后，周?chē)窠?jīng)附近或神經(jīng)內(nèi)大量不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)并被激活，其釋放的促炎癥因子直接或間接作用于外周及中樞痛覺(jué)敏化過(guò)程，其中TNF-α和IL-6可以通過(guò)脊髓谷氨酸受體提高興奮性電流，IL-1β可以促進(jìn)興奮性突觸傳遞、降低抑制性電流，還可以直接作用于外周TRPV1 受體[1,20-21]。結(jié)合之前提到，葛根素可通過(guò)抑制背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1、TRPA1及P2X3受體表達(dá)干預(yù)外周敏化[10,14]，初步推測(cè)鞘內(nèi)給予葛根素后SNI模型鼠機(jī)械痛閾上調(diào)可能與其抑制腰段脊髓促炎癥因子的表達(dá)，從而干預(yù)了促炎癥因子在NP發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的相應(yīng)環(huán)節(jié)有關(guān)，但其相關(guān)性及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和探索。

綜上所述，外周給予葛根素對(duì)SNI模型機(jī)械痛閾無(wú)明顯改善，鞘內(nèi)置管給藥方式是發(fā)揮葛根素對(duì)NP治療作用的有效途徑，葛根素通過(guò)中樞途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，可能與其抑制脊髓促炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。