楊蓓蓓 武衛(wèi)民 肖 華

1福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，福建福州，350005；2郴州市第一人民醫(yī)院皮膚科，湖南郴州，423000

單純性大皰性表皮松解癥(EBS)是一種遺傳性皮膚脆性疾病，屬常染色體顯性遺傳。多數(shù)于出生后數(shù)天或數(shù)月發(fā)病。皮損好發(fā)于手足以及其他受壓和摩擦部位。愈后遺留色素沉著，但不留瘢痕。本病常持續(xù)終生，部分患者青春期后癥狀改善。EBS的致病主要是由于編碼表皮和基底膜帶的角蛋白K5和K14的基因突變。迄今為止，在EBS各亞型患者中，已報道260多種K5和K14基因突變。本研究中，收集到一家系并通過全基因組外顯子測序和Sanger測序確定了KRT5基因的一個新的突變位點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，女，1.5歲。因“全身紅斑、水皰1年余”就診?；颊呱?月余，雙側手足反復出現(xiàn)紅斑、 水皰，水皰愈合后未出現(xiàn)瘢痕。體格檢查：一般情況良好。皮膚科檢查：頸部、雙腋下、腹部、腹股溝、四肢關節(jié)及雙足可見大小不一環(huán)狀紅斑，邊緣區(qū)可見散在綠豆至蠶豆大水皰，部分皰壁緊張，部分皰壁松弛，水皰消退后不留瘢痕，愈合后伴有褐色色素沉著(圖1)，無指甲、毛發(fā)及黏膜受累，雙掌跖未見角化性皮疹。實驗室檢查：血、尿、糞常規(guī)正常，肝腎功能、電解質、微量元素、免疫球蛋白及補體、自身抗體譜均正常。患者父親訴5歲前在皺褶部位有紅斑水皰等皮損，未予處理，5歲后皮損基本自愈，患者父親皮膚科檢查無異常。皮膚組織病理：表皮內皰(圖2)。免疫熒光dsg1、dsg3、BP180、BP230均陰性。

圖1 腹部、腹股溝、四肢關節(jié)及雙足可見大小不一環(huán)狀紅斑，邊緣區(qū)可見散在綠豆至蠶豆大水皰,水皰消退后不留瘢痕，愈合后伴有褐色色素沉著 圖2 表皮內水皰 (HE,×100)

圖3 患者基因檢測結果

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 患兒父母簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母外周血各2mL，收集于EDTA抗凝管中。

1.2.2 基因組DNA提取 采用常規(guī)方法提取DNA，使用核酸濃度測定儀 NanoDrop2000進行標本DNA濃度及純度測定。

1.2.3 高通量測序及Sanger測序驗證 樣本送檢至諾禾致源基因檢測公司進行高通量測序，通過IIIuminalHiSeq 6000平臺對基因組文庫進行高通量、高深度測序。使用TRIMMOMIC v0.38軟件對檢測到的變異進行過濾，設計引物并對突變位點進行Sanger測序驗證，對篩選出的突變位點所在的基因序列區(qū)域進行PCR擴增，應用primer 5.0設計引物序列：KRT5-F：TGTAAACGACGGCCAGTAAGGGGGTCCAGTAGAGT-GC，KRT5-R：CAGGAAACAGCTATGACCATTTGACG-CTGGAGCTGCTA。擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增結束后，PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化后，直接在一代測序儀上測序，測序結果與KRT5基因參考序列進行分析比對。

2 結果

注釋后的結果顯示：該患者及其父親KRT5基因外顯子9(移碼缺失c.1653_1654delCT)發(fā)生了突變(圖3)，通過Sanger測序對KRT5的新突變進行驗證，結果顯示：該患者及其父親攜帶同一突變(KRT5 c.1653_1654delCT)，其母親未發(fā)現(xiàn)該突變?；颊咴\斷為伴移行性環(huán)狀紅斑的單純性大皰性表皮松解癥(EBS-Migr)。

3 討論

單純性大皰性表皮松解癥(EBS)是一種較為少見的遺傳性皮膚脆性疾病，極小的創(chuàng)傷即可引起水皰形成，其特征在于表皮內水皰[1]。KRT5和KRT14是角質形成細胞中間絲蛋白的重要組成部分，對于維持基底層角質形成細胞的結構穩(wěn)定和抗張力具有重要意義[2]。大多數(shù)EBS病例(75%)源于KRT5或KRT14基因的突變[3]。EBS伴有移行性環(huán)狀紅斑(EBS-Migr)是EBS的一種罕見亞型，其特征為環(huán)狀紅斑，伴有水皰形成和愈合后色素沉著。根據(jù)報道：KRT5中c.1649delG的雜合突變是導致EBS-Migr的特異性突變[4]。然而，根據(jù)既往報道，相同的突變會導致EBS的另一種罕見亞型：EBS伴有斑駁樣色素沉著(EBS-MP)[5]。既往報道指出了EBS-Migr相關的KRT5外顯子9的突變(c.1637del4[6],c.1638_1641del-CTAG[7],c.1649delG[4,8,9], and c.1650delC[10])。本研究中，我們收集到一家系并通過二代測序確定了KRT5基因的新突變：c.1653_1654delCT的雜合突變。

KRT5基因突變在EBS發(fā)病中起著十分重要的作用。KRT5為中間絲蛋白的重要組成部分，主要表達于表皮基底細胞層中，最終構成細胞骨架，使表皮基底細胞與基底膜帶連接緊密[11]。KRT5基因的細胞遺傳學位置為12號染色體長臂(12q13.13)。在大皰性表皮松解癥患者中已發(fā)現(xiàn)超過130個KRT5基因突變，這導致皮膚脆性增加及水皰形成。

當環(huán)境因素(主要是外部創(chuàng)傷)觸發(fā)時，突變類型及其在mRNA和蛋白質水平上的表達水平決定了該疾病表型譜的總體嚴重程度[12]。KRT5的mRNA和蛋白質水平在EBS患者細胞中沒有降低[13]，移碼突變可能由于異常的尾部區(qū)域延伸而干擾正常的蛋白質折疊。

KRT5敲除小鼠模型的轉錄組分析顯示EBS患者病變皮膚內IL-6和IL-1β的表達升高，免疫組化研究表明炎癥細胞和分子浸潤[14]。雙醋瑞因(下調IL-1β的小分子)的局部應用已被證明可以穩(wěn)定角蛋白中間絲并減少重度EBS患者的水皰[15]，表明EBS發(fā)病與炎癥相關。

c.1653_1654delCT的堿基缺失突變導致KRT5的C肽端缺失，表明C端框架移位有助于產生EBS-Migr在嬰兒期特征性的炎癥表型，這可能觸發(fā)了免疫反應[8,16]。該表型的潛在機制仍需進一步研究。

EBS的病理學機制從結構蛋白擴展到酶、信號受體、囊泡轉運蛋白和泛素化等[12]。這些類型的病理學不是EBS獨有的，因此，其他遺傳疾病療法的進步很可能為EBS治療打開新的思路。