崔晨珂， 林濤， 安艷波， 崔鵬

（浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，杭州 311300）

甘 薯（Ipomoea batatasL.）屬 旋 花 科（Convolvulaceae），其不僅是重要的糧食，也是重要的飼料工業(yè)原料及新型能源作物。我國是甘薯生產(chǎn)大國，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的67.3%[1]。中國甘薯品種審定專業(yè)委員會按照用途將甘薯品種劃分為5個類型：食用型、淀粉型、兼用型、特用型和葉菜型。食用型品種注重外觀、食味和營養(yǎng)價值，主要用于蒸煮和烘烤加工；淀粉型品種的干率和淀粉含量較高，主要用于淀粉加工；兼用型是指其既可以食用，也可進行淀粉加工和飼料加工；特用型主要是類胡蘿卜素和花青素含量較高的品種，主要用于天然色素提?。蝗~菜型主要以莖尖和幼嫩葉片為蔬菜進行食用和種植[2]；而觀賞型是近年來新增加的甘薯分類類型，側(cè)重于其地上部分的顏色和形狀，主要用于觀賞。隨著甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展，甘薯分類逐步趨于細化，例如觀賞型又可分為觀葉型、觀花型、觀根型、藥用觀賞型等[3]；鮮食型又可分為鮮食、烘烤、蒸煮和水果型以及薯脯加工型。目前，我國甘薯育種取得了較大進步，已經(jīng)育成徐薯18、煙薯25、廣薯87和心香等優(yōu)良品種，包括淀粉型、鮮食型、兼用型等類型。但甘薯遺傳基礎(chǔ)仍非常狹窄,沖繩100和南瑞苕多次作為親本被應(yīng)用于雜交育種[4]，這極大地限制了品種遺傳改良的發(fā)展。因此，利用分子標(biāo)記研究甘薯品種間的遺傳差異,對提高雜種優(yōu)勢利用率具有十分重要的意義。

目前，分析品種遺傳多樣性常用的分子標(biāo)記在主要包括 AFLP（amplified fragment length polymorphism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、SSR（simple sequence repeat）、SRAP（sequencerelated amplified polymorphism)、SNP（single nucleotide polymorphism）和 ISSR（inter-simple sequence repeat）等。Wadl等[5]通過SNP技術(shù)對來自8個不同地區(qū)419個甘薯品種進行了分析，結(jié)果表明，樣品遺傳多樣性與地區(qū)差異有關(guān)，而地區(qū)差異又與種群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。Yada等[6]采用405對SSR引物對New Kawogo×Beauregard親本及其后代采集到133個有效多態(tài)性位點，表明SSR適宜甘薯遺傳多樣性鑒定。Wang等[7]采用EST-SSR標(biāo)記豐富了甘薯數(shù)量和質(zhì)量性狀特性。劉中華等[8]采用SRAP標(biāo)記在遺傳距離為0.18處較好的區(qū)分了野生種、地方種和育成品種。此外，還有學(xué)者對不同菜用、觀賞以及食用甘薯品種進行了遺傳多樣性分析，均能較好地區(qū)分品種間的遺傳差異[9-11]。

ISSR具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、精確度高、通用性強等較多優(yōu)點。李強等[4]利用ISSR標(biāo)記對中國甘薯的親本進行了遺傳差異分析，Huang等[12]利用ISSR標(biāo)記同時分辨了甘薯種間和種內(nèi)的遺傳多樣性，表明該標(biāo)記技術(shù)在植物的親緣關(guān)系、甘薯遺傳多樣性以及系譜關(guān)系等方面有很高的分辨力。本研究擬利用ISSR分子標(biāo)記方法，從品種類型特性角度對來自全國各地的37個不同類型的優(yōu)良甘薯品種遺傳多樣性進行分析，判定其親緣關(guān)系的遠近，優(yōu)先選擇遺傳距離較遠的育種親本可以提高遺傳變異的程度，該結(jié)果為甘薯雜交育種提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

37份甘薯品種（表1）的薯塊購自相關(guān)育種單位，鮮食型品種可溶性糖接近40%；淀粉型品種淀粉含量接近30%；兼用型品種風(fēng)味口感一般，可溶性糖含量在20%左右，硬度較高。所有材料于2020年3月10日在浙江農(nóng)林大學(xué)平山溫室大棚進行常規(guī)種植，4月22日采摘新鮮幼嫩甘薯葉片，液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 37份供試材料的特點和來源Table 1 Characteristics and geographic origins of 37 sweetpotato varieties 續(xù)表Continued

表1 37份供試材料的特點和來源Table 1 Characteristics and geographic origins of 37 sweetpotato varieties

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴增 采用植物基因組提取試劑盒（Cat.No.3201050，Simgen）提取甘薯葉片DNA。

PCR反應(yīng)體系：Taq酶Mix（Takara公司）10 μL，ISSR 引 物（10 μmol·L-1）和 模 板 DNA（100 ng·μL-1）分別添加1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃ 1 min，72 ℃1.5 min，40個循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。100條ISSR引物[13]由Invitrogen公司合成，其他所用生化試劑購自上海生工生物公司。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠分離，利用TANON凝膠電泳圖象軟件拍攝，并分析電泳結(jié)果。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 根據(jù)每條引物擴增產(chǎn)物片段的大小進行統(tǒng)計。用數(shù)字“1”和“0”分別表示供試材料某一等位基因的有和無，有記為“1”，無記為“0”，用Excel對37份材料的擴增結(jié)果建立“1/0”數(shù)據(jù)庫。利用NTsys2.10e軟件進行Jaccard（J）遺傳相似性系數(shù)分析，利用非加權(quán)類平均法（unweight pairgroup method using arithmetic averages，UPGMA）構(gòu)建37個甘薯品種的遺傳關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標(biāo)記擴增結(jié)果分析

引物篩選結(jié)果（圖1）表明，甘薯品種親緣關(guān)系較近，100條ISSR引物中篩選出19條具有多態(tài)性引物。篩選的引物擴增條帶清晰，多態(tài)性明顯，表明ISSR方法能有效的應(yīng)用于甘薯遺傳多樣性分析。

圖1 引物UBC850對37個品種的擴增帶型Fig.1 ISSR-PCR profiles of 37 sweetpotato variety with UBC850 primer

2.2 ISSR標(biāo)記多態(tài)性分析

經(jīng)統(tǒng)計分析（表2），利用篩選獲得的19條引物共擴增出118條帶，其中多態(tài)性條帶115條，多態(tài)性位點頻率為97.5%。引物UBC821擴增條帶數(shù)最少，為3條；引物UBC850擴增條帶數(shù)最多，達8條。19條引物擴增的平均多態(tài)性帶數(shù)為6條，其分子量一般在200～2 000 bp之間。多態(tài)性位點頻率最低的引物是UBC811和UBC848，為80%，其次是UBC842（83%），其他引物的多態(tài)性位點頻率均達100%，表明每個品種之間均有多態(tài)性差異。

表2 引物序列及擴增結(jié)果Table 2 Amplification efficiency of different primers

2.3 聚類結(jié)果分析

37份不同甘薯品種中涉及鮮食、淀粉和菜用等共9個類型。雖然薯脯加工型和水果型從廣義分類均屬于鮮食型，但隨著薯類產(chǎn)業(yè)分工不斷細化，這2種類型已經(jīng)逐漸成為獨立類型。根據(jù)ISSR分子標(biāo)記統(tǒng)計結(jié)果，試驗涉及甘薯品種的遺傳距離介于0.04～0.36之間，平均遺傳距離為0.14（圖2）。遺傳距離0.36處，劃分為2類，第1類包含紫羅蘭、徐紫薯8號和徐紫薯2號等31個品種，第2類包含秦薯5號和廣薯87等6個品種。其中第1類在0.32處，以紅東和冀紫薯2號為分界點又分為2個亞類，分別包含紫羅蘭等17個和冀紫薯2號等14個鮮食品種。其中，臺薯66和紅東的遺傳距離最近，僅為0.04，二者均屬薯脯加工型，商薯19和商薯8號的遺傳距離為0.05，均屬于淀粉型，紅香蕉和煙薯25屬于典型的鮮食型甘薯品種，遺傳距離也較近，為0.06。觀賞型甘薯品種紫羅蘭，與花青素加工型徐紫薯8號聚為一類（0.08），二者薯肉均呈紫色，由此可見，ISSR能很好地區(qū)分不同類型的甘薯品種。

圖2 基于ISSR數(shù)據(jù)的37份甘薯品種聚類分析結(jié)果Fig.2 Clustering analysis of 37 sweetpotato varieties based on the results of ISSR data

2.4 遺傳距離分析

根據(jù)ISSR聚類分析得出9種類型甘薯的遺傳距離（圖3），可以看出，花青素加工型與菜用型和水果型的遺傳距離最遠，分別為0.434和0.401，與觀賞型遺傳關(guān)系最近，距離為0.077，水果型與其他8種類型的遺傳關(guān)系較遠，遺傳距離均大于0.300，而鮮食型品種大多適用于蒸煮或烘烤，除與菜用型和水果型的遺傳關(guān)系稍遠之外（分別為0.346和0.368），與其他6種類型的遺傳距離均較近。表明鮮食型品種數(shù)量較多，其親本來源類型相對廣泛，而菜用型、觀賞型和花青素加工型品種數(shù)量少，品種親本類型狹窄。

表3 不同類型甘薯品種間的平均遺傳距離Table 3 Mean genetic distances among different types of sweetpotato varieties

3 討論

甘薯既可以作為糧食作物，也可以是能源和飼料加工原料，使用目的不同，對其品質(zhì)要求也不同。結(jié)合經(jīng)濟性狀和營養(yǎng)成分等數(shù)據(jù)對甘薯品種進行系統(tǒng)分類[14-15]，可以作為親本選擇的依據(jù)，但同一類型的不同品種之間還是存在一些差異，不能很好地按用途分類來指導(dǎo)親本選擇。ISSR分子標(biāo)記進行擴增時不需要知道DNA序列，在引物設(shè)計上也比SSR標(biāo)記更簡單[16]，且能揭示比AFLP、RAPD和SSR分子標(biāo)記更豐富的多態(tài)性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域[1,17]。本研究從甘薯類型分析，37份材料中有鮮食型16份、水果型4份、淀粉型和兼用型各5份、薯脯加工型4份、菜用型和花青素加工型和觀賞型各1份，由聚類結(jié)果可知，不同類型的甘薯品種均能夠各自聚為一類，不同類型甘薯可以明顯被區(qū)分（圖2），表明ISSR分子標(biāo)記是適用于甘薯資源遺傳多樣性分析的理想分子標(biāo)記。

本研究中菜用型和觀賞型的遺傳距離較遠，為0.379，與蘇一鈞等[3]的研究結(jié)果一致。季志仙等[9]通過ISSR分子標(biāo)記，說明甘薯食用品種間遺傳多樣性是比較豐富的，本研究中的16個鮮食型品種聚為一類，其遺傳距離與其他類型較近，表明其他類型甘薯品種為鮮食型甘薯品種遺傳改良與育種創(chuàng)新提供了較好的背景材料。同時，同一類型下的不同品種間遺傳距離也較遠，表明這些品種資源間存在豐富的遺傳多樣性[18-20]。此外，本研究中的觀賞型品種紫羅蘭與花青素加工型品種徐紫薯8號遺傳關(guān)系最近，且紫羅蘭的的親本不詳，推測其二者的親本來源相似[21]。