程名， 朱瑩， 王曉楠， 羅平， 陳勇， 郝轉(zhuǎn)芳*， 席章營*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450046；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

植物在生長過程中會遇到各種生物和非生物脅迫[1]。生物脅迫主要來源于病蟲害和微生物侵染，非生物脅迫指干旱、高溫、高鹽、低溫、澇害等不利環(huán)境因素[2]。干旱是限制作物生產(chǎn)的主要脅迫因素之一，影響作物的生長發(fā)育和生理代謝[3]。據(jù)統(tǒng)計，1978—2016年年平均干旱受災(zāi)面積為2 267.6萬hm2，占我國氣象災(zāi)害總受災(zāi)面積的53%[4]。

植物受干旱脅迫后，細胞感受器感知脅迫并產(chǎn)生脫落酸(abscisic acid，ABA)等信號分子，經(jīng)過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞給轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子特異性識別并激活或抑制下游靶基因的表達，進而響應(yīng)和抵御干旱脅迫[5]。轉(zhuǎn)錄因子能控制基因的表達，在植物脅迫反應(yīng)中扮演著重要角色，如NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)家族轉(zhuǎn)錄因子，其為植物所特有，具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域和多樣的生物學(xué)功能。首先被克隆的NAC轉(zhuǎn)錄因子是矮牽牛NAM基因，參與胚的生長發(fā)育，隨后在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了與NAM功能不同但N端結(jié)構(gòu)相似的ATAF1/2和CUC2基因，取其名稱首字母命名為NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)域又可分為A、B、C、D和E 5個亞域，通過鹽橋等作用形成有功能的NAC蛋白二聚體[6-8]。

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在植物干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。SNAC1(STRESS-RESPONSIVE NAC 1)基因受干旱誘導(dǎo)表達，田間嚴重干旱下過表達SNAC1基因能夠明顯提高水稻生殖階段的抗旱能力[9]。此外，玉米ZmSNAC1也受干旱誘導(dǎo)表達，過表達ZmSNAC1的擬南芥幼苗脫水耐受性顯著提高[10]。Xiang等[11]發(fā)現(xiàn)，ZmNAC49能夠特異性結(jié)合氣孔發(fā)育相關(guān)基因ZmMUTE的啟動子，通過抑制該基因的表達，降低氣孔密度進而提高玉米的耐旱性。Mao等[12]研究表明，提高ZmNAC111的表達量能夠提高玉米水分利用率，增強玉米苗期的耐旱性，而啟動子區(qū)MITE（miniature inverted repeat transposable element，微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件）的插入會引起RNA介導(dǎo)的DNA和組蛋白甲基化，從而降低ZmNAC111的表達，因此，ZmNAC111啟動子區(qū)MITE的發(fā)現(xiàn)可作為一個玉米苗期耐旱性的遺傳標(biāo)記，在苗期階段用于初步判別玉米材料的耐旱能力。玉米ZmNAC55、水稻OsNAC2、棉花GhNAC4、大豆GmNAC109和水稻ONAC022也在抵御干旱脅迫反應(yīng)中起正向調(diào)控作用[13-17]。

近幾年，國內(nèi)外鑒定出一些逆境相關(guān)基因的等位變異，發(fā)現(xiàn)它們能夠影響基因的表達和功能，挖掘抗逆基因的優(yōu)異變異對于作物抗逆育種意義重大。ZmVPP1編碼液泡H+型焦磷酸酶，過表達ZmVPP1能夠提高玉米的抗旱能力，其啟動子區(qū)366 bp片段的插入誘導(dǎo)其在干旱條件下表達[18]。ZmTIP1編碼S-?；D(zhuǎn)移酶，調(diào)控玉米根毛伸長[19]。通過對166份來源不同的玉米自交系進行重新測序，發(fā)現(xiàn)ZmTIP1的啟動子區(qū)存在大量變異，主要分為2種單體型，攜帶單體型2的玉米自交系在干旱脅迫下較單體型1的存活率更高、根毛更長，表明單體型2所攜帶的變異是耐旱等位變異，而單體型1所攜帶的變異是干旱敏感性等位變異。本課題組前期基于候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)玉米ZmSNAC13基因5’-UTR區(qū)存在2個與耐旱選擇指數(shù)SI(selection index)相關(guān)的位點80308-SNP-220和80308-SNP-219，根據(jù)攜帶這2個位點的9個高度連鎖位點將玉米自交系劃分成2種單體型[20]，但是目前ZmSNAC13等位變異響應(yīng)耐旱的分子機制尚未明確。本研究以耐旱性不同的單體型玉米B73（干旱敏感）和Qi319（耐旱）為材料，利用熒光定量PCR分析干旱脅迫下ZmSNAC13基因的表達，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析等位變異對不同單體型啟動子活性的影響及其對ZmSNAC13基因表達的調(diào)控作用，為玉米抗旱育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

載體pGreenⅡ0800、玉米自交系B73和Qi319均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所玉米優(yōu)質(zhì)抗逆育種課題組保存和提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米ZmSNAC13基因的生物信息學(xué)分析利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索擬南芥、矮牽牛、小麥、棉花、水稻和玉米6個物種中10個典型的與耐旱性相關(guān)的NAC基因，以及NAM、CUC2、ATAF2的氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，使用鄰近法(Neighbor-joining)，設(shè)置Bootstrap值為1 000。

1.2.2 玉米幼苗的種植與干旱處理 將玉米自交系B73和Qi319種子清洗干凈，均勻鋪放在發(fā)芽盒中的濾紙上，再蓋上1層濾紙，浸濕后放置于28℃植物培養(yǎng)箱（CU-36L5，美國PERCIVAL科技公司）黑暗培養(yǎng)至發(fā)芽，期間補加清水保持濕度，選取發(fā)芽一致的種子移至含育苗基質(zhì)的培養(yǎng)盒中，所有材料種植在同一培養(yǎng)盒中并做好標(biāo)記，待幼苗長至三葉期時停止?jié)菜鞲珊堤幚恚?、5、8、10、12 d分別取根、莖和葉，迅速放入液氮冷凍，于-80℃超低溫冰箱保存。每個樣品各有3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 干旱脅迫下玉米ZmSNAC13基因的表達分析 使用TransZol Up Plus RNA Kit（全式金生物技術(shù)有限公司）提取RNA，用瓊脂糖凝膠檢測質(zhì)量，使用Thermo Nanodrop 2000（美國）檢測濃度。質(zhì)量檢測合格的RNA使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑（天根生化科技有限公司）進行反轉(zhuǎn)錄。將cDNA樣品稀釋10倍，采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green，天根生化科技有限公司)試劑盒進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，10 μmol·L-1正向和反向引物（表1）各0.6 μL，cDNA模板 2 μL，加RNase-free ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序：設(shè)置95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，58℃退火 30 s，72 ℃延伸32 s，40個循環(huán)。采用2-△△CT法[21]計算基因的相對表達量，每個樣品各有3個生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 ZmSNAC13基因啟動子的克隆及載體的構(gòu)建 從Gramene（http://ensembl.gramene.org/index.html）下載 ZmSNAC13基因組序列，利用PlantCARE（https://www.plantcaretools.com）預(yù)測啟動子順式作用元件。以ATG上游1 500 bp為參考序列設(shè)計引物（表1），采用CTAB法[22]提取B73和Qi319的葉片基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用常規(guī)PCR方法擴增玉米ZmSNAC13基因的啟動子序列，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，將條帶大小與預(yù)期相符的擴增產(chǎn)物送至華大公司測序。PCR 反應(yīng)體系：10×Buffer 25 μL，dNTPs 10 μL，KOD 1 μL，正向引物和反向引物各1.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 8 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min 40 s，35個循環(huán)；68℃延伸5 min，12℃保存。In-Fusion連接法[23]將啟動子區(qū)序列連接到pGreenII0800-LUC載體上，酶切位點選用BamHⅠ，構(gòu)建重組載體pZmSNAC13-B73和pZmSNAC13-Qi319。由華大公司通過基因組合成的方式將B73中ZmSNAC13基因5’-UTR區(qū)9個高度連鎖的變異替換成Qi319的變異，反之將Qi319中9個高度連鎖的變異替換成B73的變異，啟動子區(qū)其他序列保持不變，構(gòu)建重組載體pZmSNAC13-B73m和pZmSNAC13-Qi319m。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 脫落酸處理下玉米ZmSNAC13基因的啟動子活性檢測 參照Yoo等[24]方法提取玉米原生質(zhì)體，通過PEG-Ca2+介導(dǎo)法將空載pGreenⅡ0800和重組載體 pZmSNAC13-B73、pZmSNAC13-Qi319、pZmSNAC13-B73m、pZmSNAC13-Qi319m分別轉(zhuǎn)化到玉米原生質(zhì)體中，用0和10 μmol·L-1ABA處理的W5緩沖液室溫暗培養(yǎng)16 h。孵育完成后的原生質(zhì)體使用Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒（Promega）進行處理，在熒光檢測儀器上測定螢火蟲熒光素酶活性（firefly luciferase activity，LUC）與 海 腎 熒 光 素 酶 活 性（renilla luciferase activity，REN），計算LUC/REN比值，即為相對熒光素酶活性。每個樣品3次重復(fù)，數(shù)據(jù)分析使用Excel進行t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmSNAC13基因的生物信息學(xué)分析

基因結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，植物NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在抵御非生物脅迫中具有重要的作用。對玉米ZmSNAC13與其他不同物種中參與非生物脅迫應(yīng)答的NAC轉(zhuǎn)錄因子進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)這些NAC轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的N端均具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，由大約160個氨基酸殘基組成，可分為A、B、C、D和E共5個亞結(jié)構(gòu)域，其中A、C、D亞結(jié)構(gòu)域高度保守，B和E亞結(jié)構(gòu)域保守性不強；而C端具有高度變異的氨基酸序列，同時富含絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等。玉米ZmSNAC13氨基酸序列N端保守、C端高度變異。保守的N端可能與其他NAC蛋白一樣負責(zé)DNA或蛋白的結(jié)合，C端是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，C端的高度變異說明ZmSNAC13可能具有獨特的生物學(xué)功能。

進一步對ZmSNAC13與其他物種NAC轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，ZmSNAC13與玉米ZmSNAC1[10]、水稻 SNAC1[9]、水稻 OsNAC3[25]和小麥TaNAC67[26]的進化關(guān)系最近（圖1）。這4個與ZmSNAC13進化關(guān)系最為相近的NAC轉(zhuǎn)錄因子都已被證實響應(yīng)多種非生物脅迫刺激，且均參與干旱脅迫應(yīng)答，正向調(diào)節(jié)植物的抗旱能力，由此推測ZmSNAC13也參與干旱脅迫應(yīng)答，在玉米抵御干旱的生物過程中有重要的作用。

圖1 不同物種NAC轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of NAC transcription factors among different species

2.2 干旱處理下ZmSNAC13基因的表達分析

熒光定量結(jié)果（圖2）表明，玉米自交系B73和Qi319根中ZmSNAC13基因的相對表達量在干旱處理后表現(xiàn)下調(diào)，分別在干旱處理8、10 d達到最低；B73和Qi319莖中ZmSNAC13的相對表達量均在干旱處理12 d達到最高，相比于干旱脅迫前分別上調(diào)表達3.27和2.43倍；Qi319葉中ZmSNAC13基因的相對表達量在干旱處理12 d上調(diào)2.78倍，而B73葉中ZmSNAC13基因的相對表達量在干旱處理8和10 d下調(diào)。干旱脅迫下玉米B73和Qi319的根、莖、葉中ZmSNAC13基因的表達模式各有不同，在干旱脅迫處理12 d的B73莖中的上調(diào)表達倍數(shù)最高，而Qi319葉中上調(diào)表達倍數(shù)最高。以上結(jié)果表明，ZmSNAC13基因響應(yīng)干旱脅迫，可能參與調(diào)控玉米干旱脅迫應(yīng)答。

圖2 干旱處理下玉米B73與Qi319根、莖和葉中ZmSNAC13基因的相對表達量Fig.2 Relative expression of ZmSNAC13 gene in roots，stems and leaves of maize B73 and Qi319 under drought stress

2.3 ZmSNAC13基因啟動子元件及其活性分析

B73的ZmSNAC13上游非編碼區(qū)啟動子序列擴增長度為1 500 bp，而Qi319的ZmSNAC13上游非編碼區(qū)啟動子序列擴增長度為2 222 bp。經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，B73和Qi319的ZmSNAC13啟動子序列除了含有基本順式作用元件CAAT-box和TATA-box外，都含有激素響應(yīng)元件ABRE（脫落酸順式作用元件）、CGTCA-motif和TGACG-motif（茉莉酸甲酯順式作用元件），干旱響應(yīng)元件MBS，光響應(yīng)元件Box4、G-Box和 G-box。 除 此 之 外 ，Qi319的ZmSNAC13啟動子序列還包含參與胚乳調(diào)控的元件 AACA-motif，光響應(yīng)元件 GT1-motif、Sp1、TCT-motif和chs-CMA1a。

利用雙熒光素酶報告體系分析ZmSNAC13基因的啟動子活性，發(fā)現(xiàn)在無ABA處理下B73和Qi319 ZmSNAC13啟動子控制的LUC/REN比值無顯著差異；而在 10 μmol·L-1ABA處理下，Qi319 ZmSNAC13啟動子控制的LUC/REN比值是B73的1.54倍（圖 3），說明 ABA處理下 Qi319的ZmSNAC13啟動子活性高于B73。同時，在干旱處理12 d時，Qi319葉中ZmSNAC13基因的相對表達量上調(diào)表達倍數(shù)高于B73（圖2），2個材料ZmSNAC13基因啟動子區(qū)均含有8個ABA響應(yīng)元件(ABRE)，由此推測玉米ZmSNAC13基因可能依賴于ABA信號通路參與干旱脅迫應(yīng)答。

圖3 ABA處理下ZmSNAC13基因的啟動子活性分析Fig.3 Activity of the ZmSNAC13 promoter under ABA treatment

從圖4可以看出，ZmSNAC13基因啟動子9個高度連鎖的變異位點包括7個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和 2個插入-缺失(insertions-deletions,InDels)變異。SNP為5’-UTR區(qū)T/A（ATG中的A記為+1 bp，位置為-220 bp）、T/C（-219 bp）、T/G（-155 bp）、C/T（-60 bp）、T/C（-42 bp）、C/G（-23 bp）和 C/G（-20bp）；InDels為-/GGC（-147bp）、-/GT（-142bp）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在 0 和 10 μmol·L-1ABA 處理下，pZmSNAC13-B73m驅(qū)動的LUC/REN值分別是pZmSNAC13-Qi319m的1.62和1.80倍，說明B73 ZmSNAC13 5’-UTR區(qū)替換成Qi319 ZmSNAC13攜帶的9個連鎖變異后啟動子活性顯著增強，而Qi319 ZmSNAC13 5’-UTR區(qū)替換變異后啟動子活性下降，說明ZmSNAC13 5’-UTR區(qū)的9個連鎖變異互換使B73 ZmSNAC13啟動子活性強于Qi319，這些變異位點能夠影響啟動子的活性，進而調(diào)控基因的表達。

圖4 ZmSNAC13的9個連鎖變異影響啟動子活性Fig.4 9 linkage variants of ZmSNAC13 affect promoter activity

3 討論

3.1 ZmSNAC13基因響應(yīng)干旱脅迫

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于植物基因組中，在植物的非生物脅迫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作 用[27]。 水 稻 SNAC1[9]與 OsNAC3[25]、玉 米ZmSNAC1[10]和小麥TaNAC67[26]都受干旱脅迫誘導(dǎo)表達，提高它們的表達量能分別增強植物的耐旱能力。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，玉米ZmSNAC13與水稻SNAC1、水稻OsNAC3、玉米ZmSNAC1和小麥TaNAC67的進化關(guān)系較近，同時qRT-PCR驗證了ZmSNAC13基因受干旱誘導(dǎo)表達，由此推測ZmSNAC13基因也參與調(diào)控玉米的耐旱機制。ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是植物干旱脅迫的核心[28]，其通過促使氣孔關(guān)閉減少水分散失以適應(yīng)干旱環(huán)境，葡萄VvNAC17可以被干旱和脫落酸誘導(dǎo)表達，過表達VvNAC17擬南芥通過調(diào)節(jié)參與ABA介導(dǎo)途徑的基因表達提高植株的耐旱能力[29]。ZmSNAC13基因的啟動子序列含有ABA和干旱誘導(dǎo)響應(yīng)的順式作用元件，表明ZmSNAC13可能依賴ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與干旱脅迫應(yīng)答。

3.2 ZmSNAC13基因5’-UTR區(qū)遺傳等位變異影響啟動子活性

變異影響基因的表達或功能，精準測序使基因的變異位點更易檢出，有利的變異位點可以被開發(fā)成分子標(biāo)記用于輔助育種。ZmTIP1CIMBL55上游1.5 kb片段中包含6個MybSt1結(jié)合位點，而ZmTIP1B73和ZmTIP1Mo17只含有1個MybSt1結(jié)合位點，利用GUS報告基因分析啟動子促進基因表達的能力，發(fā)現(xiàn)ZmTIP1CIMBL55啟動子比ZmTIP1B73和ZmTIP1Mo17啟動子能增強GUS酶活，表明ZmTIP1啟動子區(qū)的序列差異影響基因的表達[19]。蘋果MdhpRNA277啟動子區(qū)的基序b(-1 186 bp)位點G/T的突變能夠消除MdhpRNA277啟動子的活性[30]。TaSNAC8-6A是干旱響應(yīng)基因，在有無ABA處理下TaSNAC8-6AIn-313啟動子的活性都要高于TaSNAC8-6ADel-313，TaSNAC8-6A 中 InDel-313位點的插入變異能夠提高TaSNAC8-6A的表達[31]。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmVPP1CIMBL55和ZmVPP1B73啟動子片段控制的GUS在無ABA處理時處于低水平表達，而10 μmol·L-1ABA處理極大地增強了由ZmVPP1CIMBL55啟動子片段控制的GUS的表達，同時高于ZmVPP1B73啟動子片段控制的GUS的表達。ZmVPP1CIMBL55啟動子片段存在366 bp插入變異，該變異中包含的3個MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列能夠介導(dǎo)脅迫下耐旱等位基因ZmVPP1CIMBL55的表達。本研究中，10 μmol·L-1ABA處理下，Qi319材料ZmSNAC13啟動子的活性要高于B73材料，且Qi319材料所攜帶的該基因5’-UTR區(qū)9個高度連鎖的變異能夠增強啟動子的活性，分析發(fā)現(xiàn)Qi319 ZmSNAC13基因5’-UTR區(qū)9個高度連鎖的變異增加了1個Sp1光響應(yīng)元件，猜測Qi319材料ZmSNAC13基因5’-UTR區(qū)9個高度連鎖的變異中包含的Sp1光響應(yīng)元件介導(dǎo)了干旱脅迫下耐旱ZmSNAC13等位基因的表達。本研究為解析玉米在干旱脅迫下的響應(yīng)機理奠定了基礎(chǔ)。