劉巖，劉兵，李斯琪，李紅帥，徐麗斯，劉艷霞

國家老年疾病臨床研究中心 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院老年醫(yī)學中心干二科，沈陽 110016

神經(jīng)酰胺是真核細胞中存在的一類復雜多樣的高度疏水性脂質(zhì)，它不僅是細胞膜的重要組成部分，而且作為脂質(zhì)第二信使參與細胞生長、增殖、分化和凋亡等過程，同時也是鞘磷脂信號途徑的重要中間產(chǎn)物[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺與多種心血管危險因素關系密切，尤其在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用[4-5]，測定生物樣本中各種神經(jīng)酰胺的含量，對研究神經(jīng)酰胺的生物學效應機制有重要意義[6]。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)的多反應監(jiān)測模式檢測血漿中不同類型神經(jīng)酰胺含量，并探討神經(jīng)酰胺水平與動脈粥樣硬化的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年8月1日至2020年7月31日在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院體檢或入院診治的動脈粥樣硬化患者(AS組)114例，健康對照者(CO組)134例。

1.2 納入與排除標準 納入標準：年齡為45～55歲。頸部血管超聲測量頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)，并重復測量3次，取平均值。以IMT>1.0 mm，定義為頸動脈內(nèi)膜中層增厚；以IMT>1.3 mm，定義為頸動脈粥樣硬化斑塊形成[7]。IMT>1.0 mm入選AS組，IMT≤1.0 mm入選CO組。資料完整且簽署知情同意書。排除標準：妊娠期婦女；惡性腫瘤患者；不愿配合者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器及測定指標 超高效液相色譜儀(美國，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，Waters)；CV100-DNA真空離心濃縮儀(中國，北京吉艾姆)。全譜神經(jīng)酰胺指標包含：Ceramide 16∶0 (Cer 16∶0)、Ceramide 18∶0 (Cer 18∶0)、Ceramide 24∶0(Cer 24∶0)、Ceramide 24∶1(Cer 24∶1)。Cer 16∶0-d7、Cer 18∶0-d7、Cer 24∶0-d7、Cer 24∶1-d7為相應神經(jīng)酰胺內(nèi)標。

1.3.2 實驗室指標 按統(tǒng)一標準測定體重指數(shù)(BMI)、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、同型半胱氨酸等指標，以及研究對象合并疾病、合并用藥等基線資料。研究對象均空腹采靜脈血，應用HPLC-MS檢測血液中4種神經(jīng)酰胺(Cer 16∶0,Cer 18∶0,Cer 24∶0,Cer 24∶1)的濃度。依據(jù)檢測出的數(shù)值進行評分，評分標準[8]見表1，根據(jù)總分分級，神經(jīng)酰胺低水平(0～2分)，神經(jīng)酰胺中水平(3～6分)和神經(jīng)酰胺高水平(7～12分)。

表1 UPLC-MS法檢測神經(jīng)酰胺項目及評分標準(μmol/L)

2 結果

2.1 一般情況比較 2組研究對象的性別、年齡、BMI、三酰甘油、血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、同型半胱氨酸、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、腦梗死等患病情況，應用口服藥物的情況等進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AS組患者的總膽固醇水平、低密度脂蛋白膽固醇水平高于CO組患者，高密度脂蛋白膽固醇水平低于CO組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者一般資料比較

2.2 神經(jīng)酰胺水平比較 AS組3種神經(jīng)酰胺水平(Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 24∶1)及Cer 18∶0/24∶0均較CO組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組研究對象Cer 16∶0/24∶0、Cer 24∶1/24∶0比值差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 2組患者神經(jīng)酰胺水平比較[M(P25,P75)]

2.3 神經(jīng)酰胺風險等級比較 按神經(jīng)酰胺水平分3個風險等級，2組低、中、高風險等級所占人數(shù)比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組神經(jīng)酰胺不同風險等級評分人數(shù)比較[例(%)]

2.4 相關性分析 應用二元logistic回歸分析，對2組研究對象的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平進行校正，結果表明神經(jīng)酰胺是動脈粥樣硬化的獨立危險因素[P<0.05,OR(神經(jīng)酰胺中風險)=1.990，OR(神經(jīng)酰胺高風險)=6.071]。見表5。

表5 動脈粥樣硬化與神經(jīng)酰胺水平的二元logistic回歸分析

3 討論

動脈粥樣硬化是心血管疾病較常見的病因之一，也是患者死亡的主要原因之一[9]。鞘脂分子可能通過不同的機制介導動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。冠心病患者的神經(jīng)酰胺亞型(Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 22∶0、Cer 24∶0和Cer 24∶1)與斑塊不穩(wěn)定[10]、不良心血管事件[11]和遠期預后[12]相關?；颊邉用}粥樣硬化的發(fā)生受年齡、性別、血脂、肥胖等因素影響[13]。本研究中2組研究對象年齡、性別、BMI、血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、三酰甘油、同型半胱氨酸、吸煙飲酒史、并發(fā)疾病、應用藥物等多項指標差異無統(tǒng)計學意義，而總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

目前，神經(jīng)酰胺的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法和HPLC-MS法。其中HPLC是分離神經(jīng)酰胺的最主要技術，但前期處理復雜，耗時長，存在靈敏度和分辨率不高的缺陷，增加了實驗的難度和誤差。而質(zhì)譜法，雖然靈敏度高、所需樣品少且用時較短，但由于可能出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)重疊的脂質(zhì)分子之間的相互干擾，常常導致其檢測特異性不佳[19-21]。本研究采用的HPLC-MS技術，是一種通過制備、分離、檢測氣相離子來鑒定化合物的專門技術，廣泛地應用于各個領域中[22]。在眾多的分析測試方法中，質(zhì)譜法被認為是一種同時具備高特異性和高靈敏度的且被廣泛應用的方法，在臨床研究的應用方面，質(zhì)譜已成為國際公認的定量分析技術。HPLC-MS可以用于檢測多種神經(jīng)酰胺[23]。

本研究入選人群年齡在45～55歲，對于研究廣泛人群的神經(jīng)酰胺水平仍有一定局限性，有待于進一步加大樣本量，并對此人群進行隨訪，觀察未來1～3年心血管事件發(fā)生情況，進一步研究神經(jīng)酰胺水平與動脈硬化及心血管事件的相關性。

綜上所述，采用HPLC-MS可同時測定不同類型神經(jīng)酰胺水平，Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 24∶1高水平與動脈粥樣硬化的發(fā)生相關。高神經(jīng)酰胺水平與動脈粥樣硬化的發(fā)生呈明顯正相關，是動脈粥樣硬化的獨立危險因素。